候吉超，吳 斌，姜 蕾，宋晶晶，任小娜，王 東

（喀什大學(xué) 生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆喀什 844000）

隨著世界人口的高速增長，“全球糧食危機(jī)”已經(jīng)成為全世界關(guān)注的焦點(diǎn)，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)的誕生為解決“全球糧食危機(jī)”帶來了希望[1-2]。與傳統(tǒng)食品不同，轉(zhuǎn)基因食品是利用基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胫参矬w內(nèi)并使其表達(dá)，通過對其加工后形成供人類食用或飲用的物質(zhì)，包括加工食品、半成品和未加工食品，但不包括煙草或用于藥品的物質(zhì)，而導(dǎo)入的外源基因通常來自于其他的生物體，包括動(dòng)物、植物和微生物[3-4]。隨著轉(zhuǎn)基因作物種類的增加及其產(chǎn)品的大規(guī)模商業(yè)化，人們對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性產(chǎn)生一定的質(zhì)疑，監(jiān)管部門、企事業(yè)單位、科研單位和消費(fèi)者對轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)提出更高的要 求[5-6]。因此，建立高通量、便捷、高效的轉(zhuǎn)基因檢測方法對促進(jìn)我國食品安全檢測的發(fā)展以及完善轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)管理制度等方面意義重大。

目前，國內(nèi)外對轉(zhuǎn)基因食品的檢測主要是基于外源蛋白靶標(biāo)和外源核酸成分，相繼建立了一系列快速、靈敏的轉(zhuǎn)基因食品定性、定量檢測技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）、聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)等[7]。本文對轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)的原理、優(yōu)缺點(diǎn)、研究進(jìn)展及發(fā)展方向進(jìn)行簡要概述，以期為我國轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)體系的發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 外源基因的檢測技術(shù)

基于外源基因的轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)主要以PCR為主，它利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將外源基因在體外進(jìn)行擴(kuò)增，通過是否擴(kuò)增出外源基因?qū)D(zhuǎn)基因食品進(jìn)行檢測。常見的基于外源核酸成分的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)主要包括多重PCR檢測技術(shù)[8]、熒光定量PCR檢測技術(shù)[9]、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[10]和基因芯片技術(shù)[11]等。

1.1 多重PCR檢測技術(shù)

多重PCR（Multiplex PCR）又稱復(fù)合PCR，是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展而來的。多重PCR是指在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對特異性引物，可以同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)目的基因片段。與常規(guī)PCR相比，該技術(shù)是多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，各個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)在擴(kuò)增過程中存在相互競爭，一定程度上降低了假陽性出現(xiàn)的概率[12]；同時(shí)各個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)之間會(huì)相互競爭Taq DNA聚合酶，擴(kuò)增效率相對較低的反應(yīng)將會(huì)受到抑制，添加適量濃度的Taq DNA聚合酶可以有效地減弱抑制作用[13]。多重PCR具有高效性，對多個(gè)品系的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測時(shí)，同一PCR反應(yīng)體系中可以同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)不同的目的基因，因此在檢測通量和成本控制方面具有明顯優(yōu)勢，且節(jié)省時(shí)間和試劑[14]。潘志文等[15]對轉(zhuǎn)基因抗病番木瓜品系Event55-1、GM YK、華農(nóng)1號(hào)共3個(gè)轉(zhuǎn)基因番木瓜品系的序列進(jìn)行分析，成功建立了轉(zhuǎn)基因木瓜多重PCR方法，并利用不同的轉(zhuǎn)基因木瓜品系對該方法進(jìn)行驗(yàn)證，但該方法各個(gè)反應(yīng)條件仍需要進(jìn)一步優(yōu)化，否則易使特異性和靈敏度降低。

1.2 熒光定量PCR檢測技術(shù)

隨著世界各國對轉(zhuǎn)基因相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度的逐步建立和不斷完善，一些國家明確規(guī)定了轉(zhuǎn)基因成分的最低含量閾值，如韓國為3%，巴西為1%，歐盟為0.9%等[16-17]。因此，需要建立和開發(fā)新的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是將熒光染料和PCR結(jié)合，利用實(shí)時(shí)熒光信號(hào)變化監(jiān)測靶基因擴(kuò)增的整個(gè)過程，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及Ct值對目的基因進(jìn)行定量分析，實(shí)現(xiàn)了PCR從定性分析到定量分析的飛躍。與常規(guī)PCR技術(shù)相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有污染少、定量準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)監(jiān)測和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)[18]，但該方法對引物設(shè)計(jì)要求高且設(shè)備儀器昂貴，需專業(yè)操作人員操作。目前，熒光定量PCR已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測。根據(jù)熒光定量PCR的化學(xué)發(fā)光原理，可將熒光定量PCR分為TaqMan探針法與SYBR Green染料法[19]兩大類。邵彪等[20]以CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子以及標(biāo)記基因NPTⅡ特異片段序列為靶基因，利用多重PCR和熒光定量PCR的特點(diǎn)，成功建立了多重?zé)晒舛縋CR方法，成功在肉制品中檢測到植物源性轉(zhuǎn)基因成分：CaMV 35S啟動(dòng)子、NOS終止子以及標(biāo)記基因NPTⅡ。該方法靈敏度高達(dá)1 pg、重復(fù)性好且與單重PCR體系的檢測結(jié)果一致。

1.3 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是近年來新發(fā)展起來的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)。該技術(shù)是在恒溫條件下，利用不同活性的酶和特異性引物對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)。與常規(guī)PCR相比，該類檢測技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、等溫高效、操作簡單和設(shè)備要求低等優(yōu)勢，具有良好的應(yīng)用前景[21-22]。由于該方法靈敏度高，操作時(shí)容易形成氣溶膠污染且對引物的設(shè)計(jì)要求比較高。常見等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loopmediated Isothermal Amplification，LAMP）[23]、 鏈替代等溫?cái)U(kuò)增（Strand Displacement Amplification，SDA）[24]、單引物等溫?cái)U(kuò)增（Single Primer Isothermal Amplification，SPIA）[25]、滾 環(huán) 等 溫 擴(kuò) 增（Rolling Circle Amplification，RCA）[26]以 及 跨 越 式 滾 環(huán)等 溫 擴(kuò) 增（Saltatory Rolling Circle Amplification，SRCA）[27]等。目前，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已在一定范圍內(nèi)得到應(yīng)用，其他新發(fā)展起來的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)還在不斷完善中。YU等[28]將LAMP技術(shù)和TaqMan探針相結(jié)合，建立了一種新的LAMP-TaqMan檢測方法，該方法在65 ℃恒溫下，20 min內(nèi)可擴(kuò)增出目的DNA，可檢測到至少5個(gè)拷貝的靶序列，該方法具有類似于TaqMan qPCR的高特異性，且檢測速度比TaqMan qPCR快，為食品中轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測提供了一種新的技術(shù)。

1.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是近年來快速發(fā)展起來的分子生物學(xué)高新技術(shù)，是基于核酸雜交的一項(xiàng)高通量檢測技術(shù)。該技術(shù)利用固體基質(zhì)表面上特定探針與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過分析雜交信號(hào)強(qiáng)度，能夠準(zhǔn)確地對樣品中不同種類的DNA序列進(jìn)行定性、定量的檢測[29]。基因芯片的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)核酸印記雜交技術(shù)，如Southern Blotting和Northern Blotting等存在的操作繁雜、自動(dòng)化程度低、操作序列數(shù)量少和檢測效率低等不足的問題[30]。而且，通過設(shè)計(jì)不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價(jià)值，如基因表達(dá)譜測定、實(shí)變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等，目前該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測等許多領(lǐng)域[31]。TURKEC等[32]針對12個(gè)轉(zhuǎn)基因品種（3個(gè)大豆和9個(gè)玉米）開發(fā)出一套基因芯片檢測方法，該方法能夠特異性地識(shí)別每個(gè)品種，且靈敏度高?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但由于其成本較高、制作基因芯片技術(shù)復(fù)雜、背景干擾嚴(yán)重等問題，一定程度上影響了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

2 基于外源蛋白的檢測技術(shù)

基于外源蛋白的轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)主要以免疫分析技術(shù)為基礎(chǔ)建立，利用轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生的特定的外源蛋白與抗體的免疫反應(yīng)從而對外源蛋白進(jìn)行定性和定量的分析。常見的基于外源蛋白靶標(biāo)的轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）[33]、蛋白免疫印跡（Western blot）檢測技術(shù)[34]、膠體金試紙條技術(shù)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)[35]等。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是將可溶性的抗原或抗體固定到ELISA酶標(biāo)板上，保持其免疫活性，同時(shí)利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)與酶對底物高效催化反應(yīng)相結(jié)合，通過酶催化產(chǎn)生的顏色深淺進(jìn)行定性和定量分析檢測[36-37]。目前，該方法已被廣泛用于轉(zhuǎn)基因作物及其相關(guān)產(chǎn)品的定性和定量分析。常見的ELISA方法主要以雙抗夾心ELISA為主，該方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、高通量以及定量準(zhǔn)確，是目前商品化檢測試劑盒采用的主要方法之一[38]。GUERTLER等[39]利用雙抗體夾心ELISA實(shí)現(xiàn)了對轉(zhuǎn)基因玉米中Cry1Ab蛋白的檢測，最低檢測限為 0.4 ng/mL。但該方法操作步驟煩瑣，需要頻繁地洗滌孵育，檢測時(shí)間達(dá)3～4 h。JIANG等[40]對ELISA方法進(jìn)行改良，通過制備初級(jí)抗體-次級(jí)抗體復(fù)合物（Ab-Ab復(fù)合物）建立了一步ELISA方法。相對于傳統(tǒng)的ELISA，該方法不僅可以提高檢測靈敏度，而且簡化了操作步驟，極大地縮短了檢測時(shí)間，為開發(fā)蛋白質(zhì)快速檢測方法提供了新的方向。

2.2 Western Blot檢測技術(shù)

Western Blot檢測技術(shù)是定性、定量檢測蛋白表達(dá)的一種經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，其原理是利用蛋白質(zhì)凝膠電泳在電場力的作用下使蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠上逐步分離，并轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜上），使膜上的蛋白質(zhì)與相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)形成抗原-抗體復(fù)合物，然后與酶標(biāo)記的二抗反應(yīng)，通過顯色反應(yīng)對轉(zhuǎn)基因食品中外源蛋白進(jìn)行檢測[41]。該技術(shù)將電泳的高分辨能力與抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合，可以定性和定量地檢測轉(zhuǎn)基因作物和食品中的外源蛋白質(zhì)。TIAN等[42]建立了一種Western Blot方法，該方法可以快速、靈敏地檢測轉(zhuǎn)基因飼料產(chǎn)品中的外源蛋白，檢測限為0.5%。WANG等[43]利用Western Blot技術(shù)成功檢測到外源EPSPS蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的完整表達(dá)。但是該方法操作步驟煩瑣，檢測周期長，需要專業(yè)的技術(shù)操作及設(shè)備，適用于實(shí)驗(yàn)室檢測，不適用于快速檢測和商品化檢測[5]。

2.3 膠體金試紙條技術(shù)

膠體金試紙條檢測法是利用膠體金免疫層析技術(shù)研制而成，該技術(shù)是以免疫滲濾技術(shù)為基礎(chǔ)建立的一種快速簡易的免疫學(xué)檢測技術(shù)，可用于間接定性或半定量的檢測[44]。膠體金在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，并與蛋白質(zhì)分子的正電荷產(chǎn)生靜電吸引，從而牢固結(jié)合，以硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細(xì)血管作用，使滴加在膜一端的液體緩慢向另一端滲透轉(zhuǎn)移，通過抗原抗體結(jié)合，并利用膠體金呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，檢測外源蛋白[45-46]。SANTOS等[47]研究開發(fā)了一種試紙條，它可以同時(shí)檢測Cry1Ac和Cry8Ka5殺蟲蛋白，檢出限為0.06 μg。目前，膠體金免疫層析試紙條技術(shù)已被應(yīng)用于食品各領(lǐng)域，如利用膠體金免疫層析試紙條技術(shù)檢測食品中的污染物[48]、非法添加劑[49]、食源性致病菌[50]、食品中農(nóng)藥殘留[51]及食品中重金屬污染[52]等。膠體金試紙條法具有快速、簡便、靈敏度高及較低基質(zhì)效應(yīng)等特點(diǎn)，個(gè)人可以獨(dú)立完成，判定方法簡單，適合于單個(gè)樣品檢測和非專業(yè)人士使用，且不需要其他設(shè)備，操作簡單，可立即得到檢測結(jié)果，適用于社會(huì)防疫、現(xiàn)場檢測等方面[53]。但該方法易受待測樣品中雜質(zhì)的干擾，導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)，同時(shí)該方法對配對金標(biāo)抗體特異性要求極高，制作復(fù)雜，時(shí)間成本高[54]。

2.4 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

蛋白芯片技術(shù)又稱蛋白質(zhì)微陣列，是一種高通量的蛋白功能分析技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用[55]。與基因芯片類似，蛋白質(zhì)芯片利用化學(xué)和物理方法對固相載體進(jìn)行處理，再將已知的蛋白固定在載體上形成蛋白質(zhì)探針，如酶、抗原、抗體等，捕獲能與之特異性結(jié)合的轉(zhuǎn)基因蛋白，最后用專用計(jì)算機(jī)進(jìn)行定性、定量分析[56]。汪琳等[57]建立了抗體蛋白芯片檢測方法，可同時(shí)檢測3種轉(zhuǎn)基因成分。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)有著快速、高通量、特異性強(qiáng)及檢測效率高的優(yōu)點(diǎn)，能將多個(gè)、不連續(xù)的檢測過程轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)連續(xù)、快速的檢測分析過程，極大地節(jié)省了時(shí)間、試劑以及勞動(dòng)量，在未來食品科學(xué)和檢測領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景，但該方法也存在蛋白芯片成本高、固相載體的選擇易導(dǎo)致雜蛋白的非特異性吸附以及靈敏度低等問題。

3 展望

隨著轉(zhuǎn)基因作物迅速推廣及擴(kuò)大種植，轉(zhuǎn)基因食品的安全性成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，現(xiàn)有的常規(guī)轉(zhuǎn)基因檢測方法都存在一些局限性，如通量低、檢測時(shí)間長、成本高及需要特殊的儀器設(shè)備等，已不能滿足對轉(zhuǎn)基因食品快速、靈敏、高通量的檢測。因此建立一種快速檢測轉(zhuǎn)基因食品的檢測技術(shù)極為重要。

目前，商品化轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒中基于蛋白檢測的ELISA定性、定量檢測試劑盒與試紙條檢測深受科研人員的青睞，相比于核酸檢測試劑盒，PCR檢測對檢測環(huán)境要求高、易污染，且步驟煩瑣，而ELISA試劑盒與試紙條對檢測環(huán)境要求低，操作相對簡單。試紙條在檢測時(shí)速度快，使用方便，但其在進(jìn)行批量檢測時(shí)成本較高，而ELISA試劑盒由于其高通量、較高靈敏度、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、可進(jìn)行定量和半定量測定等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用。候吉超等[5]對雙抗夾心ELISA方法進(jìn)行改良，利用方陣法篩選出識(shí)別不同抗原表位的單抗并進(jìn)行配對，同時(shí)對工作條件進(jìn)行優(yōu)化，整個(gè)檢測過程僅需2步，減少了一抗、二抗的孵育和煩瑣的洗滌過程，簡化了操作步驟，將檢測時(shí)間縮短至30 min內(nèi)，極大地節(jié)約了檢測成本。

目前，轉(zhuǎn)基因作物及食品的檢測方法主要以蛋白檢測和核酸檢測為主，但由于蛋白質(zhì)在加工過程中受高溫高壓及酸堿的作用，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)易改變，易喪失抗原性，因此蛋白質(zhì)檢測方法適用于轉(zhuǎn)基因初產(chǎn)品，而基于PCR技術(shù)的檢測方法因具有檢測范圍廣、特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用，但由于其對引物設(shè)計(jì)、操作環(huán)境、檢測設(shè)備要求高，使其使用受到一定限制。因此，在檢測過程中，應(yīng)根據(jù)檢測環(huán)境、檢測性質(zhì)、操作方式和儀器設(shè)備等選擇合適的檢測方法。不同的檢測技術(shù)都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)，為了快速準(zhǔn)確地對轉(zhuǎn)基因作物及食品進(jìn)行檢測，可以利用不同檢測技術(shù)的特點(diǎn)，將不同的檢測技術(shù)相結(jié)合，最大限度地提高檢測效率和準(zhǔn)確率，實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的快速定量檢測，因此開發(fā)聯(lián)合檢測技術(shù)是一個(gè)新的方向。

隨著人們對食品安全的關(guān)注度的提高以及轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因食品檢測趨于自動(dòng)化、信息化，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)將不僅僅局限于科學(xué)研究和實(shí)驗(yàn)室檢測，為了方便更多的家庭及非專業(yè)人士可以快速分辨出食物中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，開發(fā)出高效、快速、便捷、高通量、低成本，且無需特殊的檢測設(shè)備適合非專業(yè)人士的檢測方法，將成為今后轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)研究的發(fā)展趨勢。