孫興忠，曹利利，宮鵬濤，董 航，郭衍冰，姚新華，苑淑賢*

1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林長春 130062；2. 吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062

1 前言

華支睪吸蟲病，現(xiàn)又名肝吸蟲病，主要因華支睪吸蟲寄生在人或動物肝膽管后，引發(fā)肝膽管病變的一種人畜共患病。該病流行情況比較廣泛，主要在中國、日本、越南等國均有發(fā)生，我國境內(nèi)多數(shù)省都有過對該病的報道[1]。人和動物感染該病主要以生食魚、蝦或飲用感染后的水源而患病，患病后初期癥狀不明顯，會成為長期蟲體攜帶者，慢慢會對肝膽等器官造成一定損傷，最終導(dǎo)致膽管發(fā)炎、肝硬化、肝膽管癌等癥。因此，如何在該病的前期有效地診斷很有必要，華支睪吸蟲病的診斷介紹如下。

2 診斷方法

2.1 病原學(xué)診斷

感染華支睪吸蟲病的動物，其蟲體會進入動物的體內(nèi)，而后蟲卵和幼蟲會慢慢隨著動物的糞便排出，這樣我們就可以通過檢查動物的糞便來確定感染華支睪吸蟲情況，并且可確定感染嚴(yán)重程度。檢測糞便中蟲卵最好的方法主要有醛醚法、改良加藤法、沉淀法、漂浮法，氫氧化鈉消化法等，并通過顯微鏡觀察，看蟲卵形態(tài)特性最終確診是否感染，這幾種方法是華支睪吸蟲檢測最直接有效的方法。除糞便檢查外，還有十二指腸引流法可檢測華支睪吸蟲蟲卵，此方法檢出率將近100%，但實際操作技術(shù)復(fù)雜，很難實施[2]。

因華支睪吸蟲蟲卵比較小，鑒別該蟲卵還需要有經(jīng)驗的專業(yè)實驗員才可分辨，而且糞便檢查時所需要的糞量很少，如動物感染較輕，隨糞便排出的蟲卵數(shù)少，這樣在實際檢測當(dāng)中，極易造成有蟲卵存在而漏檢。除此之外，該蟲卵與其他吸蟲的蟲卵在大小和形態(tài)方面有相似之處，很容易發(fā)生誤診。傳統(tǒng)的這些病原診斷方法不但對操作人員技術(shù)要求高，而且操作過程工作量比較大，極易造成誤診、漏檢等現(xiàn)象，很難滿足大規(guī)模流調(diào)、診斷、防治等工作，實際工作中存在局限和弊端。

2.2 免疫學(xué)診斷

利用免疫學(xué)診斷華支睪吸蟲病有間接血凝試驗、免疫熒光抗體技術(shù)、血清循環(huán)抗原檢測、皮內(nèi)試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗以及免疫膠體金技術(shù)等。這些方法當(dāng)中，在診斷中用的較多的主要是酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫膠體金技術(shù)。病原學(xué)方法有一定的缺陷，而免疫學(xué)方法是對其的一個重要補充。隨著免疫學(xué)診斷的發(fā)展，其抗原敏感性和特異性仍不能達到很高的水平，現(xiàn)階段臨床上在輔助診斷上應(yīng)用較多，因此在流行病學(xué)調(diào)查和診斷方面是不可缺少的。隨著免疫學(xué)的進步和完善，探索特異性強、敏感性好的抗原是該病診斷發(fā)展最直接的途徑，并將成為免疫學(xué)診斷研究的重點[3]。

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA方法的出現(xiàn)大概在70年代之后，經(jīng)過幾十年的進步和完善，現(xiàn)在已成為成熟的免疫診斷技術(shù)，敏感性一般83.1%～100%[2]。該方法優(yōu)點在于所用血量少、操作簡單，實際應(yīng)用便捷[4]，但有時候ELISA方法也會出現(xiàn)假陽性、交叉反應(yīng)，現(xiàn)階段在ELISA的基礎(chǔ)上，又研究出多種改進ELISA方法。

2.2.2 間接血凝試驗

間接血凝試驗（IHA），該方法在一般情況下，主要使用成蟲可溶解的抗原來作為檢測用抗原，如將抗原進行一定程度純化后可增強準(zhǔn)確性。該方法擁有操作便利、速度較快，并且結(jié)果直接觀察方便等諸多優(yōu)點，而且感染強弱還可通過結(jié)果顯現(xiàn)出來。但該方法多次試驗證實穩(wěn)定性不高，曾與糞檢法比較符合率75%～95%，存在較大的差異，所以使用該方法時需注意加強重復(fù)。

2.2.3 免疫膠體金技術(shù)

膠體金主要是疏水膠體溶液,并帶有負電荷。它的作用是吸附并結(jié)合像蛋白質(zhì)這樣的高分子物質(zhì)，最后獲得膠體金蛋白。因為金顆粒擁有高電子密度性質(zhì)，而且標(biāo)記物在固相載體上面，載體上的抗原、抗體發(fā)生反應(yīng)位置的標(biāo)記物匯集密度增加到一定時,我們就會看見粉紅色的斑點。該方法具有敏感、簡單以及快速等優(yōu)點，已大規(guī)模進行檢測試劑盒的研發(fā)。

2.3 分子生物學(xué)診斷方法

近幾年，分子生物學(xué)迅猛進步，已大量用在多種寄生蟲病診斷之中，對該病的診斷和應(yīng)用有很多報道。Traub等利用核糖體的ITS序列建立PCR方法，經(jīng)試驗特異性71.0%，敏感性76.7%，并將該技術(shù)第一次應(yīng)用華支睪吸蟲病。鄭培明等[5]應(yīng)用實時定量PCR方法檢測感染華支睪吸蟲病的病人，最后證實該方法可用于該病感染檢測。雖然分子生物學(xué)技術(shù)在華支睪吸蟲病診斷中特異性和敏感性較高，但在實際操作中所用時間長、檢測環(huán)境要求高以及需專門檢測設(shè)備，所以在一定程度上限制該方法的普及應(yīng)用。

2.3.1 常規(guī)PCR方法

該方法在華支睪吸蟲病診斷中有著極其重要作用，它具有敏感性高、批量檢測數(shù)目較大、診斷誤差較小等諸多優(yōu)點。Muller B等利用ITS2序列設(shè)計引物，然后建立常規(guī)PCR方法，并利用該方法從感染的淡水魚、淡水螺中檢測到了華支睪吸蟲基因，檢測可達10-4ng DNA ,特異性較強；而后利用PCR技術(shù)成功在糞便中檢出后睪科吸蟲卵，敏感性和特異性很好，該方法可用在患病動物糞便檢測?，F(xiàn)階段，隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，該方法在臨床中應(yīng)用較廣泛,大多應(yīng)用在流行病學(xué)調(diào)查、疫病治療期間的監(jiān)測以及特異性診斷等方面發(fā)揮不可替代的作用。

2.3.2 套氏PCR方法

該方法是一種特殊的PCR方法，在操作中主要是利用2對引物，來擴增DNA，其中的兩個引物分別叫外引物和內(nèi)引物，外引物含有內(nèi)引物的一些片段，通過2次PCR擴增2次識別靶基因，從而增加了檢測敏感性和特異性。陳瑩等[6]先設(shè)計PCR引物，對華支睪吸蟲囊蚴的DNA擴增，將200～1 000 bp擴增片段測序后，進行同源性對比，而后根據(jù)結(jié)果設(shè)計2對引物，同時進行一次法PCR和套氏PCR，最終結(jié)果顯示套氏PCR要比一次法PCR更高的敏感性，檢測濃度達到10～5 ng，而且與衛(wèi)氏并殖吸蟲、扇棘單睪吸蟲、曼氏血吸蟲和麝貓后睪吸蟲沒有交叉反應(yīng)。

2.3.3 實時定量PCR方法

相對于常規(guī)PCR方法，實時定量PCR方法不僅實現(xiàn)定性而且還可以定量，既可實現(xiàn)核酸的擴增又可對核酸進行定量。精準(zhǔn)測出樣品中DNA或RNA的準(zhǔn)確基因數(shù)目[6]。Cai等根據(jù)華支睪吸蟲ITS1核酸片段合成157 bp大小的引物，構(gòu)建實時定量PCR方法。KIM等利用華支睪吸蟲ITS2片段，使用該方式檢測170份糞便，結(jié)果顯示特異性好，只有與麝貓后睪吸蟲有交叉出現(xiàn)。蔣智華等[7]利用線粒體中的色素C相關(guān)基因設(shè)計因引物，最終成功建立雙重PCR方法，可用于鑒別華支睪吸蟲和扇棘單睪吸蟲。該方法對華支睪吸蟲的檢測逐漸完善，是分子生物學(xué)檢測發(fā)展的飛躍。

3 結(jié)語

據(jù)了解，現(xiàn)階段我國已大部分地區(qū)動物有華支睪吸蟲病的流行，所以建立有效、快速的診斷方法迫在眉睫。而且在該病現(xiàn)有的診斷方法中有很多缺陷，比如假陽性、假陰性以及檢測過程中交叉反應(yīng)現(xiàn)象時有發(fā)生，這些問題都將限制檢測方法的發(fā)展，所以尋求敏感特異的方法，和制備一些穩(wěn)定可靠的抗原也是解決該問題的重要環(huán)節(jié)。

在現(xiàn)有的各種方法中，每一種方法都有其優(yōu)點和不足，這就要求我們在使用時取其優(yōu)點克服不足。糞便法可對該病進行確診，但在實際檢測中誤檢、漏檢較高以及工作量相對較大。免疫學(xué)診斷方法具有方便、快捷等優(yōu)點，但有時會出現(xiàn)假陽性，還有特異性和敏感性需要獲得新的華支睪吸蟲特異抗原。分子生物學(xué)的應(yīng)用與發(fā)展大大提升檢測的敏感性，不但可定性還可定量，這將會成為將來該病診斷方法之一，也將為今后華支睪吸蟲病診斷研究起到促進作用。