王新寧，吳忠蘭，李宗倍，吳玉靈，蘇艷艷，馬學平

（1.寧夏醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與管理學院；寧夏環(huán)境因素與慢性病控制重點實驗室，銀川 750004；2.寧夏疾病預(yù)防控制中心，銀川 750004）

人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus，HRSV）是嬰幼兒、老年人和免疫功能低下人群急性下呼吸道感染的重要病原體之一[1]。HRSV引起2歲以下兒童急性下呼吸道感染（acute lower respiratory tract infections，ALRTI）的感染率高達97%[2]，常見癥狀為咳嗽、咳痰、發(fā)熱、呼吸困難和喘憋[3]。HRSV只有1個血清型，根據(jù)其對單克隆抗體的抗原性和遺傳性的差異可分為HRSV-A和HRSV-B兩大亞型：根據(jù)G蛋白的第二高變區(qū)（the second hypervariable region in the G protein，HVR2）的核苷酸序列的基因特征，將HRSV-A劃分為18個基因型（GA1～7、ON1～2、NA1～4、SAA1～2、TN1～2和CBA）[4-7]，將HRSV-B劃分為39個基因型［BA1～14、GB1～13、SAB1～4、BAc、URU1～2、CB1（GB5）、CBB、BA-CCA、BA-CCB和THB］[5，8-10]。本研究對2020年寧夏地區(qū)新型冠狀肺炎流行期間具有下呼吸道感染癥狀的人群進行多病原檢測，并對其中一株HRSV-B全基因組序列進行了測定，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中世界其他地區(qū)報道的56株HRSV-B亞型病毒G基因組序列進行了對比分析，研究其基因特征，豐富了我國HRSV基因數(shù)據(jù)庫，也為HRSV的快速診斷方法的建立、評價預(yù)防性治療單克隆抗體提供了核苷酸和氨基酸的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

從2020年1月20日至2020年11月20日寧夏地區(qū)具有呼吸道感染癥狀且新型冠狀肺炎監(jiān)測為陰性病例中隨機選取480例為研究對象。所有研究對象在就診后2 h內(nèi)采集鼻-咽拭子、咽拭子、痰、肺泡灌洗標本，并盡快送往實驗室保存于-80℃低溫冰箱。所有患者及未成年人家屬均簽署知情同意書，自愿協(xié)助本次實驗研究。

采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real time reverse transcription polymerase chain re－action，real time RT-PCR）對甲型流感病毒（FluA）、乙型流感病毒（FluB）、呼吸道合胞病毒（RSV）、副流感病毒（PIV）Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、呼吸道腺病毒（RAdV）、人偏肺病毒（HMPV）等8種呼吸道病毒進行檢測。將篩選出的所有HRSV陽性樣本提取核酸后送至上海伯杰醫(yī)療科技有限公司進行測序，最終有一株全基因組測序成功，本文中該病毒命名為China/ningxia/2020-02。此病毒株來自2020年2月23日海原縣人民醫(yī)院收治住院的1例發(fā)熱病例，患兒1歲5個月，男，漢族，既往體健，2月21日出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、咳痰。22日癥狀加重，轉(zhuǎn)送到縣醫(yī)院發(fā)熱門診就診：體溫37.8℃，白細胞（WBC）7.14×109/L，淋巴細胞百分比31.7%，中性粒細胞百分比57.5%；X線片示：雙肺紋理輕度增粗。根據(jù)臨床表現(xiàn)、流行病學調(diào)查和新冠病毒核酸檢測結(jié)果分析，考慮為支氣管肺炎。

1.2 試劑及儀器

病毒核酸快速提取試劑盒購自碩世生物科技股份有限公司，甲型流感病毒/乙型流感病毒核酸檢測試劑盒（雙重熒光PCR法）、RSV/PIVⅢ/PIVⅢ（三重熒光PCR法）、PIVI/HMPV/人偏肺病毒（三重熒光PCR法）均購自上海伯杰醫(yī)療科技有限公司；碩世全自動核酸提取儀購自碩世生物科技股份有限公司，7500 Fast Real-Time PCR System、QuantStudioTM 7均購自美國ABI公司，生物安全柜購自美國Baker公司。

1.3 方法

1.3.1 呼吸道多病原檢測 使用病毒核酸快速提取試劑盒進行病毒總RNA的提取，提取方法按照試劑盒說明書的步驟操作，提取的核酸存放于-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用RT-PCR方法進行呼吸道多病原檢測，檢測方法參照試劑盒說明書進行操作。

1.3.2 HRSV陽性樣本的全基因組序列測定 核酸提取后及時送往上海伯杰醫(yī)療科技有限公司進行二代病毒全基因組測序。

1.4 序列分析

通過SPAdes軟件對病毒基因組進行整理后拼接成fasta序列文件。經(jīng)NCBI BLAST序列比對后，使用DNAStar軟件中的MegAlign分析核苷酸序列同源性確定基因亞型。最后用MEGA 7.0軟件對China/ningxia/2020-02與GenBank中登錄的其他RSV毒株的全基因組、G基因進行多序列聯(lián)配確定基因型，采用Clustal W進行多序列比對，使用鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建進化樹，選擇p-distance法估計遺傳距離，Bootstrap值選擇1 000次引導(dǎo)重復(fù)測試準確性。

1.5 全球代表株篩選

通過在NCBI網(wǎng)站進行檢索，搜索關(guān)鍵詞“Human respiratory syncytial virus+基因型”或“HRSVB”進行查詢，通過閱讀大量中英文文獻整理代表株序列，篩選出不同國家、不同年份的全球代表株，見表1。

表1 全球代表株序列信息

2 結(jié)果

2.1 呼吸道多病原檢測結(jié)果

480例具有呼吸道病毒癥狀者中，檢出呼吸道病毒的有51例，陽性率為10.6%，其中RSV檢出率最高（4.0%）（19/480），其余陽性率從高到低分別為FluA（2.7%）（13/480）、RAdV（2.3%）（11/480）、HMPV（0.8%）（4/480）、PIVⅡ（0.2%）（1/480）、FluB（0.2%）（1/480）、RSV與RAdV合并感染（0.2%）（1/480）、RAdV與HMPV合并感染（0.2%）（1/480）。

2.2 核苷酸序列及其同源性

測序結(jié)果經(jīng)SPAdes軟件拼接后得到China/ningxia/2020-02的全基因組序列為15259 bp核苷酸，經(jīng)NCBI BLAST序列比對后，出現(xiàn)了100條同源性較高的B亞型序列，均在99.34%～99.63%。選取其中一些不同年份、不同國家地區(qū)的8條B亞型代表株、RSV-A亞型的原型株Long株（AY911262）以及RSV-B亞型的原型株9320株（AY353550）的基因全長核苷酸序列，利用DNAStar軟件中的MegAlign比對核苷酸序列同源性，見圖1。結(jié)果表明，China/ningxia/2020-02與RSV-A亞型原型株Long株的核苷酸同源性最低為80.9%，與RSV-B亞型原型株9320株的核苷酸同源性為96.0%，也提示了寧夏首株HRSV為B亞型。與其他代表株的核苷酸同源性均在99.0%以上，與2018年英國流行株（MZ515970）及2017年澳大利亞流行株（MW160823）的核苷酸同源性最高為99.6%。

圖1 RSV全長序列核苷酸同源性比對結(jié)果

2.2.1 G基因比對結(jié)果HRSV的G基因變異度大，寧夏首株（B亞型）G基因與RSV-A亞型原型株Long株的核苷酸序列同源性僅為65.9%，氨基酸序列同源性僅為54.0%；該株與RSV-B亞型原型株9320株的核苷酸序列同源性為89.0%，氨基酸序列同源性為86.3%；而與其親緣關(guān)系最近的8個毒株的核苷酸序列同源性在98.6%～99.0%，氨基酸序列同源性在96.8%～97.8%，見圖2A、B。

2.2.2 F基因比對結(jié)果HRSV的F基因保守性高，寧夏首株（B亞型）F基因與RSV-A亞型原型株Long株的核苷酸序列同源性為82.1%，氨基酸序列同源性為89.2%；該株與RSV-B亞型原型株9320株的核苷酸序列同源性為95.9%，氨基酸序列同源性為98.3%；而與其親緣關(guān)系最近的8個毒株的核苷酸序列同源性在99.1%～99.6%，氨基酸序列同源性在99.3%～99.8%，見圖2C、D。

圖2 主要糖蛋白基因及氨基酸序列比對結(jié)果

2.3 全基因組系統(tǒng)發(fā)生樹分析

將NCBI BLAST比對后選取的8條代表株以及RSV-B亞型的原型株9320株的全長核苷酸序列，用MEGA7.0軟件進行序列比對后，并用NJ構(gòu)建系統(tǒng)進化樹?？梢园l(fā)現(xiàn)，China/ningxia/2020-02與2018年英國流行株（MZ515970）及2017年澳大利亞流行株（MW160823）同屬于一個分支，bootstrap值為100%，表明親緣關(guān)系最為接近，與RSV全長序列核苷酸同源性比對結(jié)果結(jié)論一致，與2013年中國廣州（KM517573）及原型株9320株親緣關(guān)系較遠，見圖3。

圖3 合胞病毒B亞型分離株的全基因組進化樹

2.4 G基因組系統(tǒng)發(fā)生樹分析

本文將所測得的1株HRSV-B亞型全基因組序列（China/ningxia/2020-2）和56株全球代表株進行了比對和分析，56株全球代表株分別來自22個國家，覆蓋56年（1962—2018年），包括BA、URU、GB、CB1（GB5）、SAB和BAc各型的代表毒株?；贕蛋白基因HVR2聯(lián)配后構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，China/ningxia/2020-02毒株G基因在792nt之后有60nt的插入，屬于典型的BA型，并且與BA9基因型代表株聚集在同一分支上，因此劃分為BA9基因型，見圖4。

圖4 合胞病毒B亞型分離株的G基因HVR2進化樹

3 討論

呼吸道病毒主要通過空氣和接觸傳播，具有感染力強、發(fā)病急、傳播速度快、病后免疫力不持久等特點。本研究顯示，調(diào)查期間患者感染率最高的病毒是HRSV（4.0%），高于北京地區(qū)2015年全人群的HRSV（2.17%）的陽性率[11]，低于西安市2009—2014年全人群的HRSV（10.78%）的陽性率[12]。由此可見，不同的地區(qū)HRSV感染的陽性率存在著差異。這可能與研究的時間、地點及采用方法的不同有關(guān)，本研究還存在樣本量少的情況。

HRSV的流行特點因為年份和地域的不同而在流行中呈現(xiàn)出不同的變化，可表現(xiàn)為A、B亞型同時為主要流行亞型，也可以表現(xiàn)為A、B亞型交替流行，即以其中一種亞型為主要流行亞型。目前全球的流行亞型為HRSV-A中的ON1型和HRSV-B中的BA9型。本研究中寧夏測序成功的一株HRSV經(jīng)分析確定為B亞型中的BA9型。BA基因型毒株首次分離于1998年[13]，1999年首次報道[14]是B亞型中G基因C-末端含有60個核苷酸重復(fù)插入序列的新型基因型，自此以后，BA基因型進化為14個基因型（BA1～14）并在全球出現(xiàn)廣泛流行。BA9基因型首次于日本報道，Dapat等[15]分離自2006—2007年的流行季節(jié)。我國第一個BA9基因型由Song等[7]擴增自2006年的標本。2008—2014年，BA9基因型逐漸流行成為我國優(yōu)勢基因型。黏附蛋白G以膜結(jié)合型和溶解型兩種形式存在，能使病毒吸附于宿主細胞上，導(dǎo)致感染開始。但在缺乏該蛋白的情況下，病毒仍能在體外進行感染，這種感染可能是通過融合蛋白F或胞飲作用完成。G蛋白是RSV結(jié)構(gòu)蛋白中變異最顯著的蛋白，其抗原變異可能是RSV逃避免疫監(jiān)視、引起反復(fù)感染的原因。近年還發(fā)現(xiàn)G蛋白上存在一個CX3C模序，該模序在RSV感染中起著重要作用。因此，了解G蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及免疫表位，對研究RSV的感染機制及研制亞單位疫苗具有重要意義。F蛋白在RSV病毒株間高度保守，但單克隆抗體及疫苗的廣泛使用可能使F蛋白面臨巨大的免疫選擇壓力，導(dǎo)致可逃逸抗體的突變被選擇出來，影響抗體與F蛋白的結(jié)合能力，故利用基因測序技術(shù)選擇相對保守的F蛋白表位作為抗體靶點可減少免疫逃逸的發(fā)生[16]。

總之，寧夏地區(qū)目前尚未有系統(tǒng)完整的呼吸道傳染病監(jiān)測體系，本研究仍處于初步探索階段。寧夏首株HRSV的全基因組同源性分析及系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建為公共衛(wèi)生學研究提供了分子流行病學依據(jù)，但研究涵蓋時間較短。欲全面掌握寧夏地區(qū)呼吸道病毒多病原的流行和遺傳特征，還需后續(xù)進行系統(tǒng)而連續(xù)的監(jiān)測工作。本研究只對一株HRSV進行了全基因組分析，基因型的確定也并不能代表本地區(qū)的優(yōu)勢基因型的流行，仍需要進一步開展持續(xù)性、大規(guī)模的研究。