羅秀針，鄭金華，林燕燕，吳偉斌

(1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學院， 福建 漳州 363000；2.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學院， 福建 福州 350007)

酪胺(Tyramine)又名對羥基苯乙胺(分子式：C8H11NO，分子量137.18)，為白色或類白色的晶體粉末。酪胺具有多種的生理功能和藥用價值，常應(yīng)用于治療偏頭痛，制備降血脂藥物、合成診斷嗜鉻細胞瘤的藥物等[1-4]。酪胺及其衍生物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健及化妝品行業(yè)，市場需求量大[5-7]，價格較高。

目前酪胺的制備主要通過化學合成法，但化學合成法具工藝復雜、反應(yīng)中間體多、產(chǎn)物提純難、總體回收率較低、成本高和環(huán)境污染嚴重等問題[8-11]。相對化學合成法來說，生物酶法利用酪氨酸脫羧酶(Tyrosine decarboxylase，TDC)[12]將酪氨酸催化脫羧生成酪胺，具有反應(yīng)條件溫和、周期短、成本較低、高效、綠色等[13]優(yōu)勢具有廣闊的應(yīng)用前景。

酪氨酸脫羧酶的來源豐富，研究表明微生物來源的酪氨酸脫羧酶酶活相對其他來源的脫羧酶要高[14-15]。目前已實現(xiàn)了多種不同來源的TDC異源表達，但普遍存在易形成包涵體、酶活低等問題[16]。為了有效解決包涵體問題，本研究將Lactobacillusbrevis來源的TDC(Gen Bank:JX204286.1)基因密碼子進行低翻譯效率優(yōu)化，在E.coliBL21-AI(DE3)中的異源表達，并通過搖瓶對誘導條件進行優(yōu)化，為今后的研究提供一些依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

E.coliJM109、E.coliBL21-AI(DE3)、表達質(zhì)粒pBAD/His為實驗室保藏。

1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶(SacⅠ和KpnⅠ)、T4連接酶、DNA Marker、蛋白Marker、基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒，購自Takara生物技術(shù)有限公司；酪氨酸、磷酸吡哆醛(PLP)、氨芐青霉素(Amp)、L-阿拉伯糖，購自生工生物工程(上海)有限公司；5 L發(fā)酵罐，購自上海國強生化工程裝備有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，購自Bio-Rad公司。

1.3 培養(yǎng)基

(1)LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，pH 7.0 g·L-1。(2)固體LB培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入20 g·L-1的瓊脂粉。(3)重組菌的發(fā)酵液體培養(yǎng)基：牛肉膏10 g·L-1，酵母膏5 g·L-1，葡萄糖2.5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，磷酸氫二鉀2 g·L-1，無水乙酸鈉5 g·L-1，檸檬酸氫二銨2 g·L-1，硫酸鎂0.58 g·L-1，硫酸錳0.25 g·L-1，吐溫-80 1 mL，pH 6.8，基因工程菌在培養(yǎng)前加終濃度50 mg·L-1的氨芐青霉。

1.4 酪氨酸脫羧酶基因工程菌構(gòu)建

1.4.1目的基因優(yōu)化與合成 利用在線密碼子優(yōu)化網(wǎng)站，將NCBI上發(fā)布的短乳桿菌(Lactobacillusbrevis,EU195891.1,NCBI)中酪氨酸脫酸酶(TDC)基因序列進行密碼子優(yōu)化，在密碼子優(yōu)化過程添加稀有密碼子，提高稀有密碼子tRNA豐度，降低翻譯效率[17]。在基因序列兩端引入SacⅠ和KpnⅠ的切位點，優(yōu)化后的基因序列由生工生物工程(上海)有限公司進行全基因合成，片段長度為1 893 bp，合成pUC-tdc質(zhì)粒。

1.4.2表達載體的構(gòu)建 將pUC-tdc/top10甘油菌擴大培養(yǎng)后，提取pUC-tdc質(zhì)粒，用SacⅠ和KpnⅠ對質(zhì)粒進行酶切，回收酶切產(chǎn)物，回收的酶切產(chǎn)物與SacⅠ、KpnⅠ雙酶切的pBAD/His載體通過T4連接酶進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBAD/His-TDC，挑取陽性克隆重組菌驗證。

將驗證成功的重組菌E.coliJM109-tdc接種到含終濃度50 μg·mL-1Amp的液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r·min-1培養(yǎng)12 h后，提取質(zhì)粒，將pBAD/His-TDC轉(zhuǎn)入E.coliBL21-AI(DE3)感受態(tài)中細胞，構(gòu)建重組表達TDC的基因工程菌E.coliBL21-AI(DE3)-tdc。

1.4.3目的產(chǎn)物的誘導表達 將-20℃保存的陽性克隆E.coliBL21-AI(DE3)-tdc甘油菌按照1%接種量接種于含終濃度50 μg·mL-1Amp的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h；12 h取出種子液，按照2%接種量接種于含終濃度50 μg·mL-1Amp的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中(250 L的三角瓶中裝液體量為50 mL)，37℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)6 h，溫度降低到30℃，加入誘導劑L-阿拉伯糖(終濃度為2 g·L-1)，誘導12 h后離心收集菌體，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達情況。

1.5 酪氨酸脫羧酶酶活的檢測

TDC酶活定義為[12]：在37℃條件下，1 min生成1 mmol·L-1酪胺所需生物催化劑的量。TDC的比活力：每克濕重菌體所具備的酶活力單位(U·g-1)。

TDC酶活測定[18]：底物溶液5 mmol·L-1酪氨酸0.9 mL，0.1 mmol·L-1PLP的乙酸緩沖液 (0.2 mmol·L-1，pH 5.0)，加入處理好的菌體，在37℃下振蕩反應(yīng) 10 min，然后在100℃金屬浴中放置10 min終止反應(yīng)。用高效液相色譜(HPLC)檢測反應(yīng)液中生成的酪胺。

HPLC 檢測酪胺條件[19]為色譜柱：Kromasil C18；流動相：0.02 mmol·L-1磷酸氫二鈉-乙腈(體積比 85∶15)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長:225 nm。

1.6 表達條件優(yōu)化

1.6.1確定最佳誘導溫度 按1.4.3將種子液接入含Amp的發(fā)酵液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h，將培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為24、26、28、30、32和34℃，加入誘導劑L-阿拉伯糖(終濃度為2 g·L-1)，誘導表達12 h，收集菌體，-20℃冷藏24 h后進行酶活測定。

1.6.2確定L-阿拉伯糖最佳誘導劑用量 取上述最優(yōu)結(jié)果，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L-1的L-阿拉伯糖，誘導表達12 h，收集菌體，-20℃冷藏24 h后進行酶活測定。

1.6.3確定添加誘導劑時間 取上述最優(yōu)結(jié)果，分別于培養(yǎng)4、6、8和10 h加入L-阿拉伯糖，誘導表達12 h，收集菌體，-20℃冷藏24 h后進行酶活測定。

1.6.4確定誘導劑作用時間 取上述最優(yōu)結(jié)果，加入L-阿拉伯糖誘導表達，誘導表達時間為4、6、8、10、12 h，收集菌體，-20℃冷藏24 h后進行酶活測定。

1.7 5 L發(fā)酵罐放大驗證

在搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進行重組基因工程菌E.coliBL21-AI(DE3)-tdc 5L發(fā)酵罐的發(fā)酵試驗，條件如下：5 L發(fā)酵罐發(fā)酵初體積為2.5 L，移種量為4%，起始通風比0.6 v·(vm)-1，起始轉(zhuǎn)速為300 r·min-1，發(fā)酵液中初始葡萄糖為2.5 g·L-1，初始葡萄糖耗完后，濃度控制在1～2 g·L-1，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37℃，發(fā)酵過程中控制溶氧在20%～40%范圍，當菌體OD600約為6時，溫度降低到28℃，加入L-阿拉伯糖(終濃度為1.6.2確定的最佳誘導劑用量)繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集菌體，-20℃冷藏24 h后進行酶活測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的構(gòu)建與鑒定

提取重組質(zhì)粒 pBAD/His-TDC，用SacⅠ和KpnⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖1。pBAD/His-TDC 質(zhì)粒雙酶切后出現(xiàn)2條帶，與pBAD/His和tdc基因長度相符，經(jīng)測序與NCBI所公布的TDC基因序列相符。

2.2 SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達

重組工程菌E.coliBL21-AI(DE3)-tdc在L-阿拉伯糖誘導表達后，收集菌體經(jīng)超聲波破碎進行SDS-PAGE電泳檢測，以未誘導表達的樣品作為空白對照，結(jié)果見圖2，在誘導表達后的E.coliBL21-AI(DE3)-tdc樣品在相對分子質(zhì)量63 kD處有明顯的特異性條帶。

注：M為marker，1為原始菌，2為重組菌

2.3 酪胺的液相檢測

酪胺含量檢測采用高效液相色譜法，酪胺液相檢測標準圖譜見圖3，反應(yīng)液中生成的酪胺檢測圖譜見圖4。

圖3 酪胺液相檢測標準圖譜

圖4 反應(yīng)液中生成酪胺的檢測圖譜

2.4 誘導條件優(yōu)化

2.4.1確定最佳誘導溫度 誘導溫度對菌體生長速率及蛋白的可溶性表達都很重要，是重組蛋白表達調(diào)控的關(guān)鍵因素之一[20]。由圖5可知，當誘導溫度為26℃時，TDC活性最高；但當誘導溫度繼續(xù)升高，TDC活性開始下降，原因可能是較高的誘導溫度導致目的蛋白合成速率過快，其不能正確折疊而形成“包涵體”。但如果誘導溫度太低，對于菌體的生長也不利。因此，確定最佳誘導溫度為26℃。

圖5 溫度對重組菌誘導表達的影響

2.4.2確定L-阿拉伯糖最佳誘導劑用量 由圖6可知，當L-阿拉伯糖濃度從0.5 g·L-1增加至1.0 g·L-1時酶活上升，最高酶活達152.1 U·g-1，L-阿拉伯糖濃度繼續(xù)增加，表達相對穩(wěn)定，確定L-阿拉伯糖最佳誘導劑用量為1.0 g·L-1。

圖6 L-阿拉伯糖濃度對重組菌誘導表達的影響

2.4.3確定誘導劑添加時間 由圖7可知，4、6 h為對數(shù)中前期添加L-阿拉伯糖效果較好，6 h添加L-阿拉伯糖TDC活性最高，酶活可達166.6 U·g-1，8、10 h為接近穩(wěn)定期，添加誘導劑，TDC表達量下降，確定誘導劑添加時間為6 h。

圖7 誘導劑添加時間對重組菌誘導表達影響

2.4.4確定誘導時長 誘導時間也是影響基因工程菌產(chǎn)物表達的重要因素。誘導時間過短，菌體量過少。誘導時間過長，誘導劑被消耗殆盡，菌體進入衰亡期。本試驗考察誘導時間對TDC活性影響，結(jié)果見圖8，誘導8 h左右，TDC活性最高，達到183.2 U·g-1。

圖8 誘導時長對重組菌誘導表達影響

2.5 發(fā)酵罐放大試驗

由圖9可知，5 L發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)過2 h左右的遲緩期后進入快速增長期，10～14 h為穩(wěn)定期，之后進入衰亡期，在對數(shù)中前期即發(fā)酵6 h開始降溫誘導，TDC開始表達，到培養(yǎng)到14 h時TDC的活性最高，可達192 U·g-1，而后進入衰亡期，18 h TDC的酶活有所下降。5 L發(fā)酵罐放大試驗，發(fā)酵過程條件得到了更好的控制和調(diào)節(jié)，菌株在發(fā)酵罐中發(fā)酵長勢和產(chǎn)量都應(yīng)優(yōu)于搖瓶。菌體濃度可達到18.2 g·L-1，相對于搖瓶發(fā)酵的pH 1.92 g·L-1增長了8.47倍。

圖9 重組菌發(fā)酵罐細胞生長曲線和TDC酶活

3 結(jié)論與討論

本研究利用在線密碼子優(yōu)化網(wǎng)站，在短乳桿菌(Lactobacillusbrevis,EU195891.1,NCBI)中酪氨酸脫酸酶(TDC)基因序列添加稀有密碼子，提高稀有密碼子tRNA豐度，進行密碼子優(yōu)化，降低翻譯效率，有效解決了異源表達TDC易形成包涵體的問題，實現(xiàn)了短乳桿菌來源的TDC基因在E.coliBL21-AI(DE3)中的異源表達，通過搖瓶發(fā)酵對誘導表達TDC的條件進行摸索，在較低溫度26℃下，發(fā)酵6 h,加入1.0 g·L-1L-阿拉伯糖其TDC效率最高，誘導8 h，酶活可達183.2 U·g-1；在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)上，通過5 L發(fā)酵罐放大試驗，發(fā)酵過程條件得到了更好的控制和調(diào)節(jié)，菌株在發(fā)酵罐中發(fā)酵長勢和產(chǎn)量都應(yīng)優(yōu)于搖瓶。TDC酶活達到192 U·g-1，菌體濃度可達到18.2 g·L-1，相對于搖瓶發(fā)酵的1.92 g·L-1增長了8.47倍。與化學合成方法相比，本研究通過重組表達的酪氨酸脫羧酶制備酪胺，綠色環(huán)保，轉(zhuǎn)化效率高，為酪胺的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。