羅秀針，鄭金華，林燕燕，吳偉斌

(1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院， 福建 漳州 363000；2.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 福建 福州 350007)

酪胺(Tyramine)又名對(duì)羥基苯乙胺(分子式：C8H11NO，分子量137.18)，為白色或類白色的晶體粉末。酪胺具有多種的生理功能和藥用價(jià)值，常應(yīng)用于治療偏頭痛，制備降血脂藥物、合成診斷嗜鉻細(xì)胞瘤的藥物等[1-4]。酪胺及其衍生物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健及化妝品行業(yè)，市場(chǎng)需求量大[5-7]，價(jià)格較高。

目前酪胺的制備主要通過化學(xué)合成法，但化學(xué)合成法具工藝復(fù)雜、反應(yīng)中間體多、產(chǎn)物提純難、總體回收率較低、成本高和環(huán)境污染嚴(yán)重等問題[8-11]。相對(duì)化學(xué)合成法來(lái)說，生物酶法利用酪氨酸脫羧酶(Tyrosine decarboxylase，TDC)[12]將酪氨酸催化脫羧生成酪胺，具有反應(yīng)條件溫和、周期短、成本較低、高效、綠色等[13]優(yōu)勢(shì)具有廣闊的應(yīng)用前景。

酪氨酸脫羧酶的來(lái)源豐富，研究表明微生物來(lái)源的酪氨酸脫羧酶酶活相對(duì)其他來(lái)源的脫羧酶要高[14-15]。目前已實(shí)現(xiàn)了多種不同來(lái)源的TDC異源表達(dá)，但普遍存在易形成包涵體、酶活低等問題[16]。為了有效解決包涵體問題，本研究將Lactobacillusbrevis來(lái)源的TDC(Gen Bank:JX204286.1)基因密碼子進(jìn)行低翻譯效率優(yōu)化，在E.coliBL21-AI(DE3)中的異源表達(dá)，并通過搖瓶對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，為今后的研究提供一些依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

E.coliJM109、E.coliBL21-AI(DE3)、表達(dá)質(zhì)粒pBAD/His為實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶(SacⅠ和KpnⅠ)、T4連接酶、DNA Marker、蛋白Marker、基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、膠回收試劑盒，購(gòu)自Takara生物技術(shù)有限公司；酪氨酸、磷酸吡哆醛(PLP)、氨芐青霉素(Amp)、L-阿拉伯糖，購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司；5 L發(fā)酵罐，購(gòu)自上海國(guó)強(qiáng)生化工程裝備有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.3 培養(yǎng)基

(1)LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g·L-1，酵母浸粉5 g·L-1，氯化鈉10 g·L-1，pH 7.0 g·L-1。(2)固體LB培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入20 g·L-1的瓊脂粉。(3)重組菌的發(fā)酵液體培養(yǎng)基：牛肉膏10 g·L-1，酵母膏5 g·L-1，葡萄糖2.5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，磷酸氫二鉀2 g·L-1，無(wú)水乙酸鈉5 g·L-1，檸檬酸氫二銨2 g·L-1，硫酸鎂0.58 g·L-1，硫酸錳0.25 g·L-1，吐溫-80 1 mL，pH 6.8，基因工程菌在培養(yǎng)前加終濃度50 mg·L-1的氨芐青霉。

1.4 酪氨酸脫羧酶基因工程菌構(gòu)建

1.4.1目的基因優(yōu)化與合成 利用在線密碼子優(yōu)化網(wǎng)站，將NCBI上發(fā)布的短乳桿菌(Lactobacillusbrevis,EU195891.1,NCBI)中酪氨酸脫酸酶(TDC)基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在密碼子優(yōu)化過程添加稀有密碼子，提高稀有密碼子tRNA豐度，降低翻譯效率[17]。在基因序列兩端引入SacⅠ和KpnⅠ的切位點(diǎn)，優(yōu)化后的基因序列由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行全基因合成，片段長(zhǎng)度為1 893 bp，合成pUC-tdc質(zhì)粒。

1.4.2表達(dá)載體的構(gòu)建 將pUC-tdc/top10甘油菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，提取pUC-tdc質(zhì)粒，用SacⅠ和KpnⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，回收酶切產(chǎn)物，回收的酶切產(chǎn)物與SacⅠ、KpnⅠ雙酶切的pBAD/His載體通過T4連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBAD/His-TDC，挑取陽(yáng)性克隆重組菌驗(yàn)證。

將驗(yàn)證成功的重組菌E.coliJM109-tdc接種到含終濃度50 μg·mL-1Amp的液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r·min-1培養(yǎng)12 h后，提取質(zhì)粒，將pBAD/His-TDC轉(zhuǎn)入E.coliBL21-AI(DE3)感受態(tài)中細(xì)胞，構(gòu)建重組表達(dá)TDC的基因工程菌E.coliBL21-AI(DE3)-tdc。

1.4.3目的產(chǎn)物的誘導(dǎo)表達(dá) 將-20℃保存的陽(yáng)性克隆E.coliBL21-AI(DE3)-tdc甘油菌按照1%接種量接種于含終濃度50 μg·mL-1Amp的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)12 h；12 h取出種子液，按照2%接種量接種于含終濃度50 μg·mL-1Amp的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中(250 L的三角瓶中裝液體量為50 mL)，37℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)6 h，溫度降低到30℃，加入誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖(終濃度為2 g·L-1)，誘導(dǎo)12 h后離心收集菌體，SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。

1.5 酪氨酸脫羧酶酶活的檢測(cè)

TDC酶活定義為[12]：在37℃條件下，1 min生成1 mmol·L-1酪胺所需生物催化劑的量。TDC的比活力：每克濕重菌體所具備的酶活力單位(U·g-1)。

TDC酶活測(cè)定[18]：底物溶液5 mmol·L-1酪氨酸0.9 mL，0.1 mmol·L-1PLP的乙酸緩沖液 (0.2 mmol·L-1，pH 5.0)，加入處理好的菌體，在37℃下振蕩反應(yīng) 10 min，然后在100℃金屬浴中放置10 min終止反應(yīng)。用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)反應(yīng)液中生成的酪胺。

HPLC 檢測(cè)酪胺條件[19]為色譜柱：Kromasil C18；流動(dòng)相：0.02 mmol·L-1磷酸氫二鈉-乙腈(體積比 85∶15)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng):225 nm。

1.6 表達(dá)條件優(yōu)化

1.6.1確定最佳誘導(dǎo)溫度 按1.4.3將種子液接入含Amp的發(fā)酵液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)6 h，將培養(yǎng)溫度分別設(shè)置為24、26、28、30、32和34℃，加入誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖(終濃度為2 g·L-1)，誘導(dǎo)表達(dá)12 h，收集菌體，-20℃冷藏24 h后進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.6.2確定L-阿拉伯糖最佳誘導(dǎo)劑用量 取上述最優(yōu)結(jié)果，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L-1的L-阿拉伯糖，誘導(dǎo)表達(dá)12 h，收集菌體，-20℃冷藏24 h后進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.6.3確定添加誘導(dǎo)劑時(shí)間 取上述最優(yōu)結(jié)果，分別于培養(yǎng)4、6、8和10 h加入L-阿拉伯糖，誘導(dǎo)表達(dá)12 h，收集菌體，-20℃冷藏24 h后進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.6.4確定誘導(dǎo)劑作用時(shí)間 取上述最優(yōu)結(jié)果，加入L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為4、6、8、10、12 h，收集菌體，-20℃冷藏24 h后進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.7 5 L發(fā)酵罐放大驗(yàn)證

在搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行重組基因工程菌E.coliBL21-AI(DE3)-tdc 5L發(fā)酵罐的發(fā)酵試驗(yàn)，條件如下：5 L發(fā)酵罐發(fā)酵初體積為2.5 L，移種量為4%，起始通風(fēng)比0.6 v·(vm)-1，起始轉(zhuǎn)速為300 r·min-1，發(fā)酵液中初始葡萄糖為2.5 g·L-1，初始葡萄糖耗完后，濃度控制在1～2 g·L-1，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37℃，發(fā)酵過程中控制溶氧在20%～40%范圍，當(dāng)菌體OD600約為6時(shí)，溫度降低到28℃，加入L-阿拉伯糖(終濃度為1.6.2確定的最佳誘導(dǎo)劑用量)繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集菌體，-20℃冷藏24 h后進(jìn)行酶活測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的構(gòu)建與鑒定

提取重組質(zhì)粒 pBAD/His-TDC，用SacⅠ和KpnⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，見圖1。pBAD/His-TDC 質(zhì)粒雙酶切后出現(xiàn)2條帶，與pBAD/His和tdc基因長(zhǎng)度相符，經(jīng)測(cè)序與NCBI所公布的TDC基因序列相符。

2.2 SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)

重組工程菌E.coliBL21-AI(DE3)-tdc在L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體經(jīng)超聲波破碎進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，以未誘導(dǎo)表達(dá)的樣品作為空白對(duì)照，結(jié)果見圖2，在誘導(dǎo)表達(dá)后的E.coliBL21-AI(DE3)-tdc樣品在相對(duì)分子質(zhì)量63 kD處有明顯的特異性條帶。

注：M為marker，1為原始菌，2為重組菌

2.3 酪胺的液相檢測(cè)

酪胺含量檢測(cè)采用高效液相色譜法，酪胺液相檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)圖譜見圖3，反應(yīng)液中生成的酪胺檢測(cè)圖譜見圖4。

圖3 酪胺液相檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)圖譜

圖4 反應(yīng)液中生成酪胺的檢測(cè)圖譜

2.4 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

2.4.1確定最佳誘導(dǎo)溫度 誘導(dǎo)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)速率及蛋白的可溶性表達(dá)都很重要，是重組蛋白表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因素之一[20]。由圖5可知，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為26℃時(shí)，TDC活性最高；但當(dāng)誘導(dǎo)溫度繼續(xù)升高，TDC活性開始下降，原因可能是較高的誘導(dǎo)溫度導(dǎo)致目的蛋白合成速率過快，其不能正確折疊而形成“包涵體”。但如果誘導(dǎo)溫度太低，對(duì)于菌體的生長(zhǎng)也不利。因此，確定最佳誘導(dǎo)溫度為26℃。

圖5 溫度對(duì)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的影響

2.4.2確定L-阿拉伯糖最佳誘導(dǎo)劑用量 由圖6可知，當(dāng)L-阿拉伯糖濃度從0.5 g·L-1增加至1.0 g·L-1時(shí)酶活上升，最高酶活達(dá)152.1 U·g-1，L-阿拉伯糖濃度繼續(xù)增加，表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，確定L-阿拉伯糖最佳誘導(dǎo)劑用量為1.0 g·L-1。

圖6 L-阿拉伯糖濃度對(duì)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的影響

2.4.3確定誘導(dǎo)劑添加時(shí)間 由圖7可知，4、6 h為對(duì)數(shù)中前期添加L-阿拉伯糖效果較好，6 h添加L-阿拉伯糖TDC活性最高，酶活可達(dá)166.6 U·g-1，8、10 h為接近穩(wěn)定期，添加誘導(dǎo)劑，TDC表達(dá)量下降，確定誘導(dǎo)劑添加時(shí)間為6 h。

圖7 誘導(dǎo)劑添加時(shí)間對(duì)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)影響

2.4.4確定誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng) 誘導(dǎo)時(shí)間也是影響基因工程菌產(chǎn)物表達(dá)的重要因素。誘導(dǎo)時(shí)間過短，菌體量過少。誘導(dǎo)時(shí)間過長(zhǎng)，誘導(dǎo)劑被消耗殆盡，菌體進(jìn)入衰亡期。本試驗(yàn)考察誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)TDC活性影響，結(jié)果見圖8，誘導(dǎo)8 h左右，TDC活性最高，達(dá)到183.2 U·g-1。

圖8 誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)重組菌誘導(dǎo)表達(dá)影響

2.5 發(fā)酵罐放大試驗(yàn)

由圖9可知，5 L發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)過2 h左右的遲緩期后進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，10～14 h為穩(wěn)定期，之后進(jìn)入衰亡期，在對(duì)數(shù)中前期即發(fā)酵6 h開始降溫誘導(dǎo)，TDC開始表達(dá)，到培養(yǎng)到14 h時(shí)TDC的活性最高，可達(dá)192 U·g-1，而后進(jìn)入衰亡期，18 h TDC的酶活有所下降。5 L發(fā)酵罐放大試驗(yàn)，發(fā)酵過程條件得到了更好的控制和調(diào)節(jié)，菌株在發(fā)酵罐中發(fā)酵長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量都應(yīng)優(yōu)于搖瓶。菌體濃度可達(dá)到18.2 g·L-1，相對(duì)于搖瓶發(fā)酵的pH 1.92 g·L-1增長(zhǎng)了8.47倍。

圖9 重組菌發(fā)酵罐細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和TDC酶活

3 結(jié)論與討論

本研究利用在線密碼子優(yōu)化網(wǎng)站，在短乳桿菌(Lactobacillusbrevis,EU195891.1,NCBI)中酪氨酸脫酸酶(TDC)基因序列添加稀有密碼子，提高稀有密碼子tRNA豐度，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，降低翻譯效率，有效解決了異源表達(dá)TDC易形成包涵體的問題，實(shí)現(xiàn)了短乳桿菌來(lái)源的TDC基因在E.coliBL21-AI(DE3)中的異源表達(dá)，通過搖瓶發(fā)酵對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)TDC的條件進(jìn)行摸索，在較低溫度26℃下，發(fā)酵6 h,加入1.0 g·L-1L-阿拉伯糖其TDC效率最高，誘導(dǎo)8 h，酶活可達(dá)183.2 U·g-1；在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)上，通過5 L發(fā)酵罐放大試驗(yàn)，發(fā)酵過程條件得到了更好的控制和調(diào)節(jié)，菌株在發(fā)酵罐中發(fā)酵長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量都應(yīng)優(yōu)于搖瓶。TDC酶活達(dá)到192 U·g-1，菌體濃度可達(dá)到18.2 g·L-1，相對(duì)于搖瓶發(fā)酵的1.92 g·L-1增長(zhǎng)了8.47倍。與化學(xué)合成方法相比，本研究通過重組表達(dá)的酪氨酸脫羧酶制備酪胺，綠色環(huán)保，轉(zhuǎn)化效率高，為酪胺的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。