王路昊，路岳衡，耿貴工，許小寧，喬楓，2*

（1.青海師范大學(xué)青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008；2.青海師范大學(xué)高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院，青海 西寧 810008；3.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；4.青海省農(nóng)業(yè)項(xiàng)目指導(dǎo)服務(wù)中心，青海 西寧 810008）

環(huán)烯醚萜類化合物（Iridoids）是由琉蟻二醛（Iridodial）縮醛而成的一種單萜類化合物［1］。從化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，環(huán)烯醚萜的基本母核為環(huán)烯醚萜醇，具有環(huán)狀烯醚、醇羥基等結(jié)構(gòu)［2］，由于醇羥基性質(zhì)活潑、不穩(wěn)定，易于糖結(jié)合，故天然存在的環(huán)烯醚萜類化合物常與糖相連形成環(huán)烯醚萜苷類結(jié)構(gòu)［3］。環(huán)烯醚萜具有環(huán)戊烷環(huán)烯醚萜和環(huán)戊烷開裂的裂環(huán)環(huán)烯醚萜兩種基本骨架［4］，從結(jié)構(gòu)來看，環(huán)烯醚萜可以分為以下三類：①環(huán)烯醚萜苷類，由C1的羥基與糖類結(jié)合而來，代表成分如京尼平苷、梔子苷，是山梔子（Gardenia jasminoides）中的主要藥用成分，有清熱瀉火的作用［5］；②裂環(huán)烯醚萜苷類，是環(huán)烯醚萜苷中環(huán)戊烷在C7-C8位處開環(huán)衍生而來［3］；③4-位無取代環(huán)烯醚萜苷類，其與普通環(huán)烯醚萜苷的差異在于C4是否有取代基的存在，代表成分如地黃（Rehmannia glutinosa）中的梓醇，具有促進(jìn)血管新生、降低血糖的功效［6］。

環(huán)烯醚萜類化合物最早是在螞蟻的分泌腺中分離得到的［7］，但其在植物界之中分布極為廣泛，如龍膽科（Gentianaceae）的秦艽（Gentiana macrophylla）［8］、川 西 獐 芽 菜（Swertia mussotii）［9］；玄 參 科（Scrophulariaceae）的大花胡麻草（Centranthera grandiflora）［10］、地黃；樟科（Lauraceae）中的山雞椒（Litsea cubeba）［11］；衛(wèi) 矛 科（Celastraceae）的 雷 公 藤（Tripterygium wilfordii）［12］；忍冬科（Caprifoliaceae）中的金銀花（Lonicera japonica）［2］等雙子葉植物之中，是許多中藏藥的主要藥用成分。近年來隨著對(duì)該類化合物的深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有多種生物活性，如唇形科（Lamiaceae）獨(dú)一味（Lamiophlomis rotata）中的山梔苷甲酯和胡麻屬苷等可以顯著抑制神經(jīng)末梢對(duì)疼痛的敏感性，具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用［13］；玄參科胡黃連（Picrorhiza scrophulariiflora）中的胡黃連苷-1和胡黃連苷-2等能夠穩(wěn)定肝細(xì)胞膜、消除自由基，對(duì)于急性和亞急性肝炎造成的肝損傷進(jìn)行保護(hù)，具有保肝利膽的作用［14］；山茱萸科（Cornaceae）山茱萸（Cornus officinalis）中的莫諾苷和馬錢苷可以降低血糖、對(duì)于心功能和血管損傷修復(fù)有明顯功效，常被用來治療糖尿病引起的心血管疾?。?5］；茜草科（Rubiaceae）雞屎藤（Paederia scandens）中的雞屎藤苷酸能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生有顯著的抑制效果，常被用來治療風(fēng)濕骨痛［16］；龍膽科川西獐芽菜中的獐芽菜苦苷具有抗膽堿、保肝、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛等功效，對(duì)胃腸道有解痙止痛的作用，常被用來治療胃腸道疾?。?7］。

近年來隨著分子生物技術(shù)和生物化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，對(duì)環(huán)烯醚萜類化合物的活性成分及其生物合成途徑研究也愈發(fā)深入，許多與其生物合成途徑相關(guān)的關(guān)鍵基因也得到了克隆與分析。本文通過對(duì)環(huán)烯醚萜類化合物的生物合成途徑及其相關(guān)酶方面進(jìn)行綜述，以便于其能夠在工業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)中得到更好的開發(fā)與利用。

1 環(huán)烯醚萜類化合物生物合成途徑

環(huán)烯醚萜類化合物的生物合成途徑可以分為三個(gè)階段（見圖1）：前體的形成、萜類骨架的生物合成、后期的化學(xué)修飾。第一階段由甲羥戊酸途徑（Mevalonate pathway，MVA）和非甲羥戊酸途徑又稱2-甲基赤蘚糖-4-磷酸途徑（Methylerythritol 4-phosphate pathway，MEP）合成了反應(yīng)的前體異戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸鹽［18］。MVA途徑主要存在于細(xì)胞質(zhì)之中，因此又可以稱為細(xì)胞質(zhì)途徑，是倍半萜、三萜等萜類化合物生物合成的主要途徑。共有乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶（Acetyl-CoA acetyltransferase，AACT）、羥甲 基戊二 酰 輔酶A合酶（Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase，HMGS）、甲基戊二酰輔酶A還原酶（Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGR）、甲羥戊酸激酶（Mevalonate kinase，MK）、磷酸甲羥戊酸激酶（Phosphomevalonate kinase，PMK）、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶（Diphosphomevalonate decarboxylase，MVD）六 種 酶 參 與 反應(yīng)［19］。MEP途徑主要發(fā)生在質(zhì)體中，是單萜、雙萜等萜類化合物生物合成的主要途徑。共有脫氧木桐糖-5-磷酸合酶（1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS）、5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶（1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR）、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇合酶（2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidylyltransferase，CMS）、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤蘚糖激 酶（4-（Cytidine 5'-diphospho）-2-C-methyl-Derythritol kinase，CMK）、2-甲基赤蘚糖-2，4-環(huán)二磷酸合酶（2-C-Methyl-D-erythritol 2，4-cyclodiphosphate synthase，MCS）、羥甲基丁烯基-4-二磷酸合酶（4-Hydroxy-3-methylbut-2-enyl-diphosphate synthase，HDS）、4-羥基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸還原酶（4-Hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase，HDR）異戊烯二磷酸異構(gòu)酶（Isopentenyl-diphosphate delta-isomerase，IDI）八種酶參與反應(yīng)［20］；第二階段是由這兩個(gè)化合物在一系列酶的催化下形成環(huán)烯醚萜的骨架結(jié)構(gòu)琉蟻二醛，共有香葉基焦磷酸合酶（Geranyl diphosphate synthase，GPPS）、香 葉 醇 合 酶（Geraniol synthase，GES）、香葉醇-10-羥化酶（Geraniol 10-hydroxylase，G10H）、10-羥基香葉醇氧化還原酶（10-Hydroxygeraniol oxidoreductase，10-HGO）、環(huán)烯醚萜合酶（Iridoid synthase，IS）五種酶參與反應(yīng)［21］；第三階段是對(duì)萜類化合物進(jìn)行各種化學(xué)修飾，目前對(duì)環(huán)烯醚萜的后期修飾途徑尚不清楚，對(duì)裂環(huán)環(huán)烯醚萜的后期修飾途徑研究更加深入。共有7-去氧番木鱉酸合成酶（7-Deoxyloganetic acid synthase，7-DLS）、7-去氧番木鱉酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（7-Deoxyloganic acid glucosyltransferase，7-DLGT）、7-去氧馬錢苷酸7-羥化酶（7-Deoxyloganic acid hydroxylase，7-DLH）馬錢苷酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶（Loganic acid methyltransferase，LAMT）、裂環(huán)馬錢苷合酶（Secologanin synthase，SLS）五種酶參與裂環(huán)環(huán)烯醚萜的后期修飾，最終生成裂環(huán)馬錢子苷（Secologanin）。裂環(huán)馬錢子苷是裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷的骨架結(jié)構(gòu)，最終可以在各種酶的作用下生成滇木樨欖苷、獐芽菜苦苷、秦艽苷A等裂環(huán)式環(huán)烯醚萜苷類化合物［22］。

圖1 植物環(huán)烯醚萜類化合物代謝途徑Fig.1 Plant iridoids metabolic pathway

2 環(huán)烯醚萜類生物合成途徑關(guān)鍵酶的研究

在環(huán)烯醚萜類化合物前體合成的生物過程中有多種酶參與反應(yīng)，其中HMGR、DXS、DXR、HDR與IDI這五種酶在該生物合成過程中具有重要作用，因此本文選取上述五個(gè)參與MVA和MEP途徑的關(guān)鍵酶，以及與萜類骨架生物合成相關(guān)的酶（GPPS、GES、G10H、10-HGO、IS），對(duì)酶與相關(guān)功能基因表達(dá)的研究進(jìn)行綜述。

2.1 前體的形成

2.1.1 甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）

HMGR被視為MVA途徑中最關(guān)鍵的限速酶，可以催化HMG-CoA轉(zhuǎn)化為MVA。在擬南芥（Arabi-dopsis thaliana）植株中，HMGR1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致其矮小、雄性不育［23］；在人參（Panax ginseng）中加入洛伐他丁會(huì)導(dǎo)致不定根中的人參皂苷含量降低［24］，因此HMGR基因在MVA途徑之中極為重要。根據(jù)王家典等［12］的研究，在雷公藤中HMGR基因的過表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致雷公藤中雷公藤甲素的含量顯著上升。這表明HMGR對(duì)植物中萜類物質(zhì)代謝起著重要的調(diào)控作用，可以通過提高HMGR基因的表達(dá)量，來提高下游產(chǎn)物的積累量。

HMGR基因首次是從擬南芥分離得到，而后在丹參（Salvia miltiorrhiza）［25］、雷公藤［12］、滇龍膽（Gentiana rigescens）［26］等藥用植物中被克隆出來。HMGR基因以多基因家族狀態(tài)出現(xiàn)，含有至少兩個(gè)以上的同源基因。如滇龍膽、丹參中存在兩個(gè)；青蒿（Artemisia caruifolia）中發(fā)現(xiàn)三個(gè)；擬南芥中存在四個(gè)。根據(jù)周偉等［26］的研究，HMGR基因的表達(dá)具有時(shí)空特異性和組織特異性。在滇龍膽的根中，HMGR基因的表達(dá)量隨著發(fā)育時(shí)期逐漸升高，在花期達(dá)到頂峰后，逐漸降低。在丹參中，HMGR基因表達(dá)在根中最高，在葉中最低，這與丹參酮的積累量相吻合［25］。

2.1.2 脫氧木桐糖-5-磷酸合酶（DXS）

DXS是MEP途徑中的第一個(gè)限速酶，在植物萜類化合物的生物合成途徑中起著重要作用，其可以催化一分子的丙酮酸與一分子的3-磷酸甘油醛縮合形成5-磷酸脫氧木酮糖。5-磷酸脫氧木酮糖是MEP途徑中的第一個(gè)重要中間體，其可以影響植物次生代謝途徑中萜類化合物的合成，因此可以通過調(diào)控DXS基因的表達(dá)量的高低，進(jìn)而調(diào)控植物中萜類化合物的積累。根據(jù)楊林等［27］的研究，在甘草（Glycyrrhiza uralensis）中DXS基因的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致甘草酸含量的降低，這是因?yàn)樵谳祁惽绑w的生物合成之中，有MEP和MVA兩種合成途徑，其中MEP途徑主要合成單萜、雙萜等萜類化合物，其是以3-磷酸甘油醛和丙酮酸為起始物。甘草酸屬于三萜類化合物，主要由MVA途徑合成，其是以乙酰輔酶A為起始物。DXS基因的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致丙酮酸和3-磷酸甘油醛的含量降低，不利于乙酰輔酶A的積累，從而使MVA途徑受到抑制，令甘草酸含量降低。

DXS基因最早是從薄荷（Mentha canadensis）分離得到的，隨后在滇龍膽［28］、丹參［29］、甘草［27］等植物中被分離出來。DXS基因可以分為三類：Ⅰ型基因與葉綠素等光合作用相關(guān)的萜類化合物生物合成有關(guān)；Ⅱ型基因參與植物防御功能相關(guān)的萜類化合物的生物合成，如青蒿素；Ⅲ型基因的功能目前研究較少，可能與某些萜類激素的生物合成有關(guān)［30］。根據(jù)楊瀅［29］的研究，在丹參的莖中DXS1基因的表達(dá)量最高，在丹參的根中DXS2基因的表達(dá)量最高，推測(cè)DXS2基因在丹參的萜類物質(zhì)生物合成調(diào)控中起重要作用。

2.1.3 5-磷酸脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶（DXR）

DXR基因最早是在大腸桿菌（Escherichia coli）中發(fā)現(xiàn)，目前已從雷公藤［31］、地黃［32］等多種植物中被分離出來并進(jìn)行克隆分析。該基因通常是以單基因的狀態(tài)出現(xiàn)，但在橡膠樹（Hevea brasiliensis）內(nèi)發(fā)現(xiàn)DXR基因也能以雙基因的狀態(tài)存在［33］。在MEP途徑中，DXR作為第二個(gè)限速酶，作用是將DXP轉(zhuǎn) 為MEP，而MEP是 合 成MEP途 徑 終 產(chǎn) 物DMAPP和IPP的前體物質(zhì)，因此DXR基因的表達(dá)水平對(duì)萜類化合物的生物合成起著重要的調(diào)控作用。根據(jù)朱畇昊等［34］的研究，在地黃中DXR基因在不同組織中的表達(dá)量與地黃的主要藥效成分-梓醇在不同組織中的積累量呈正相關(guān)。

根據(jù)段文韜［35］的研究，DXR還可以作為靶點(diǎn)，進(jìn)行新型抗生素的篩選研究。這主要是因?yàn)樵诖蠖辔⑸锏妮祁惿锖铣芍?，MEP途徑是其唯一的合成途徑，其中就包括許多人類致病微生物，如惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）、肺炎桿菌（Streptococcus pneumoniae）等。因此在理論上具有抑制DXR活性作用的化學(xué)物質(zhì)，就存在潛在的抑菌活性，能夠篩選作為新型抗生素來使用。如鼠李素能通過與DXR的D150氨基酸通過氫鍵作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物，來抑制DXR的活性，進(jìn)而治療大腸桿菌誘導(dǎo)的敗血癥。

2.1.4 4-羥基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸還原酶（HDR）

HDR是MEP途徑中的最后一個(gè)關(guān)鍵酶，其可以催化HMBPP轉(zhuǎn)化為IPP和DMAPP。HDR基因目前已經(jīng)從白花丹參［36］、黃花蒿（Artemisia annua）［37］、秦艽［38］等多種植物中相繼克隆出來并進(jìn)行分析。在白花丹參中過表達(dá)HDR基因，發(fā)現(xiàn)HDR基因的過表達(dá)會(huì)令丹參酮的積累量大幅增加［36］；Botella-pavía等［39］通過對(duì)擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)化過表達(dá)DXS基因和HDR基因的擬南芥，比單轉(zhuǎn)化過表達(dá)DXS基因的擬南芥，紫杉二烯積累量高13倍。以上研究表明HDR基因是MEP途徑中編碼限速酶的關(guān)鍵基因，HDR基因的過表達(dá)以及與其它基因的共同表達(dá)均會(huì)提高下游產(chǎn)物的積累量［37］。

HDR基因的表達(dá)水平還存在組織差異性，在秦艽等植物的不同組織中，表達(dá)量具有很大差異。岑文等［38］對(duì)秦艽進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明HDR基因在秦艽的根、莖、葉和花中均有表達(dá)，在花中的表達(dá)量最高，根中表達(dá)量其次，葉和莖中沒有明顯差異。但在丹參中HDR基因的表達(dá)模式與秦艽不同，其在葉中的表達(dá)量要顯著高于根中的表達(dá)量，這可能與胡蘿卜素等萜類化合物在不同植物組織器官中的積累量不同有關(guān)［36］。

2.1.5 異戊烯二磷酸異構(gòu)酶（IDI）

IDI在MVA和MEP途徑中均存在，其可以催化IPP和DMAPP相互轉(zhuǎn)化，維持兩者之間的比率。IPP和DMAPP的比率可以影響合成的下游產(chǎn)物的種類，當(dāng)比率為1：1時(shí)合成單萜類化合物，當(dāng)比率更高時(shí)將合成倍半萜、二萜或多萜類化合物，因此IDI是萜類生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶［40］。

目前已經(jīng)從靈芝（Ganoderma lucidum）［41］、川貝母（Fritillaria cirrhosa）［42］、滇龍膽［43］等植物中分離并克隆出IDI基因。根據(jù)目前的研究，IDI作為萜類生物合成途徑中的關(guān)鍵基因，其過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致下游產(chǎn)物含量增加。如在卷葉貝母鱗莖誘導(dǎo)的愈傷組織中過表達(dá)IDI基因，能有效提高卷葉貝母中生物堿含量［42］；在杜仲（Eucommia ulmoides）中過表達(dá)IDI基因，會(huì)導(dǎo)致反式異戊二烯的合成增加；在大腸桿菌中導(dǎo)入IDI基因，會(huì)使其番茄紅素含量增加。IDI基因的表達(dá)還會(huì)受到內(nèi)源和外源因素影響。在滇龍膽中，IDI基因在葉中表達(dá)量最高，莖內(nèi)表達(dá)量最低［43］；在川貝母中，IDI基因在鱗莖表達(dá)量最高，根中表達(dá)量最低［42］；在靈芝中，茉莉酸甲酯會(huì)誘導(dǎo)IDI基因的表達(dá)量增加；在麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）中，高溫干旱等逆境均會(huì)誘導(dǎo)IDI基因的表達(dá)量發(fā)生改變。

2.2 骨架的生物合成

2.2.1 香葉基焦磷酸合酶（GPPS）

GPPS可以催化IPP和DMAPP形成GPP。GPP是單萜類化合物合成的前體，也是后續(xù)化合物生合成的基礎(chǔ)，因此GPPS是萜類化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。GPPS在自然界中以同源和異源二聚體兩種形式存在。其中同源二聚體以兩個(gè)相同的亞基組成，主要存在于裸子植物和被子植物中。異源二聚體由一大一小兩種亞基構(gòu)成，目前僅在金魚草（Antirrhinum majus）、山雞椒等被子植物中被發(fā)現(xiàn)［32］。異源二聚體的大小兩種亞基均屬于異戊二烯蛋白轉(zhuǎn)移酶家族成員，大亞基（GPPS.LSU）與香葉基香葉基焦磷酸合酶（GGPPS）的蛋白質(zhì)序列相似性能達(dá)50%，小亞基（GPPS.SSU）僅有20%［11］。

GPPS基因目前已經(jīng)從川西獐芽菜［9］、青葉膽（Swertia mileensis）［44］、山雞椒［11］等植物中分離克隆出來，并進(jìn)行分析。GPPS基因的表達(dá)與下游產(chǎn)物的積累量呈正相關(guān)。在川西獐芽菜中，GPPS基因在葉中表達(dá)量最高，與葉中環(huán)烯醚萜類化合物含量較高的結(jié)論相符合［9］。根據(jù)曹佩等［11］的研究，過表達(dá)GPPS基因，能夠增加山雞椒中單萜類化合物的量；GPPS基因具有組織表達(dá)特異性。在地黃中，GPPS基因在葉片與塊根中高表達(dá)，在葉柄中低表達(dá)［32］；在青葉膽中，GPPS基因的表達(dá)量隨發(fā)育時(shí)期增加而增加，在苗期最低，果期達(dá)到巔峰。GPPS基因的表達(dá)量還會(huì)受到外界因素的誘導(dǎo)。在青葉膽中，茉莉酸甲酯會(huì)誘導(dǎo)GPPS基因表達(dá)量逐漸增加，高鹽環(huán)境會(huì)抑制GPPS基因的表達(dá)，適當(dāng)?shù)母珊得{迫也會(huì)增加GPPS基因表達(dá)量［44］。

2.2.2 香葉醇合酶（GES）

GES是單萜化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，可以催化GPP生成香葉醇。香葉醇是一種直鏈單萜醇，也是大多藥用及香料植物產(chǎn)生香味的主要化學(xué)成分。目前GES基因已經(jīng)從四季桂（Osmanthus fragrans）［45］、蜘蛛香（Valeriana jatamansi）［46］、滇龍膽［47］、廣藿香（Pogostemon cablin）［48］等植物中提取分離出來，并進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)GES基因的表達(dá)具備組織特異性和時(shí)空特異性。在四季桂中，GES基因在花和葉片等組織中均表達(dá)，花中的表達(dá)量要高于葉片，GES在花中的表達(dá)量會(huì)直接影響香葉醇的積累［45］；在廣藿香的葉中，GES在老葉中表達(dá)量最高，在嫩葉中表達(dá)量最低，而在廣藿香的莖中，GES在各個(gè)時(shí)期的表達(dá)都很低或不表達(dá)［48］；蜘蛛香中，GES在莖中表達(dá)量最高，在新生葉中表達(dá)量最低。GES表達(dá)量還會(huì)受到外界因素的刺激。滇龍膽和蜘蛛香中GES的表達(dá)均會(huì)受到茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)。當(dāng)蜘蛛香受到茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，GES表達(dá)會(huì)在48 h后達(dá)到最高，72 h后逐漸降低［46］。

2.2.3 香葉醇-10-羥化酶（G10H）

G10H是細(xì)胞色素P450單加氧酶家族中CYP76B亞家族的成員之一，也是環(huán)烯醚萜類化合物生物合成途徑的關(guān)鍵酶［49］，具有催化香葉醇轉(zhuǎn)變?yōu)?0-羥基香葉醇的功能。目前G10H基因已經(jīng)從廣藿香［50］、秦艽［51］、蜘蛛香［49］等植物中分離克隆出來。G10H基因cDNA全長(zhǎng)在1 533～1 662 bp，編碼495～510個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)無跨膜或部分跨膜區(qū)域［22］。目前研究已證明G10H的表達(dá)量對(duì)于下游產(chǎn)物的積累具有重要的調(diào)節(jié)作用。在長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）中G10H表達(dá)量與文多靈、長(zhǎng)春質(zhì)堿的總積累量呈顯著正相關(guān)［52］；在滇龍膽中G10H表達(dá)量與裂環(huán)烯醚萜積累呈正相關(guān)［47］；在川西獐芽菜中過表達(dá)G10H基因，會(huì)令獐芽菜苦苷積累量增高［53］。G10H表達(dá)量還具有組織特異性，在廣藿香中G10H在成熟葉中表達(dá)量最高，與川西獐芽菜G10H表達(dá)模式相似，但與滇龍膽、秦艽中G10H表達(dá)模式相差較遠(yuǎn)［50］。

2.2.4 10-羥基香葉醇氧化還原酶（10-HGO）

10-HGO是依賴NADPH的細(xì)胞色素P450單萜氧化酶，能夠催化10-羥基香葉醇生成10-含氧香葉醛，成為合成下游產(chǎn)物裂環(huán)馬錢子苷的原料，是裂環(huán)烯醚萜類化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶。目前10-HGO基因已經(jīng)從地黃［32］、紫草（Lithospermum erythrorhizon）［54］、山梔子［55］等植物中提取分離出來。根據(jù)萬云［54］的研究，在擬南芥中過表達(dá)硬紫草的10-HGO基因，會(huì)令細(xì)胞活躍程度增加、物質(zhì)運(yùn)輸能力加強(qiáng)，推測(cè)10-HGO基因?qū)ψ喜葜凶喜輰幍纳锖铣捎写龠M(jìn)作用。根據(jù)劉文曉［32］的研究，10-HGO基因的表達(dá)量會(huì)因生長(zhǎng)時(shí)期和組織器官不同而出現(xiàn)差異。在地黃根和莖中10-HGO6的表達(dá)量會(huì)隨地黃的生長(zhǎng)而降低，而在其葉中，10-HGO6的表達(dá)量隨其生長(zhǎng)而增加。

2.2.5 環(huán)烯醚萜合酶（IS）

IS環(huán)烯醚萜類化合物的生物合成的關(guān)鍵酶，是孕酮P5-β還原酶（P5βR）家族的成員。該酶與以香葉基焦磷酸為反應(yīng)底物的單萜環(huán)化酶不同，其可以催化鏈狀單萜10-含氧香葉醛先轉(zhuǎn)化為烯醇化合物，再經(jīng)Michael反應(yīng)環(huán)化為環(huán)狀單萜nepetalactol，nepetalactol是所有環(huán)烯醚萜苷類化合物的前體物質(zhì)。

IS基因最早是從長(zhǎng)春花中分離得到的，隨后在地黃［56］、大花胡麻草［10］等植物中被克隆出來。IS基因的發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要，其為通過生物技術(shù)手段，合成環(huán)烯醚萜類化合物提供了可能［57］。根據(jù)楊超飛等［56］的研究，IS基因的表達(dá)具有組織特異性，并會(huì)受到外源因素的影響。RgIS3基因在地黃的葉中表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織，與地黃中環(huán)烯醚萜類成分積累量相一致，推測(cè)是地黃中環(huán)烯醚萜成分合成酶的主要編碼基因。地黃的毛狀根經(jīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)后，IS基因的表達(dá)呈先上升后降低的趨勢(shì)，在12 h后到最高。在大花胡麻草中，IS基因在葉中表達(dá)量最高，其次是莖，在根中最低，在花中不表達(dá)［10］。

3 展望

環(huán)烯醚萜類化合物是許多中藏藥的主要藥用成分，具有諸多生物活性，在工業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。研究其代謝通路與關(guān)鍵酶及其編碼基因，有助于調(diào)控代謝產(chǎn)物合成方向，培育目標(biāo)成分含量較高的植株，對(duì)提高藥材品質(zhì)及產(chǎn)量具有重要的意義。

目前對(duì)于中藏藥環(huán)烯醚萜類化合物生物合成途徑，尤其是萜類修飾階段相關(guān)的酶及其編碼基因研究較少。此外，環(huán)烯醚萜類化合物的合成調(diào)控十分復(fù)雜，如底物的前饋調(diào)控、產(chǎn)物的反饋調(diào)控、多基因的聯(lián)合作用等，因此還有許多調(diào)控機(jī)制尚未探明，對(duì)于特定性狀調(diào)控的遺傳機(jī)制亟待研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，在未來的研究中通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因組學(xué)等方法，對(duì)相關(guān)酶及其編碼基因的功能、結(jié)構(gòu)與表達(dá)調(diào)控等方面進(jìn)行深入研究，以此闡明環(huán)烯醚萜類化合物的合成調(diào)控與遺傳機(jī)制，利用基因工程手段，提高中藏藥中環(huán)烯醚萜類產(chǎn)物積累，為篩選高品質(zhì)藥材提供理論依據(jù)。