劉艷，卓維，黃紅燕，任風(fēng)鳴

（重慶市藥物種植研究所特色生物資源研究與利用川渝共建重點實驗室，重慶 南川 408435）

牛至（Origanum vulgareL.）是唇形科牛至屬一種重要的經(jīng)濟植物，在我國西北、華北及長江流域以南地區(qū)都有分布，生于海拔500～3 600 m的路旁、山坡、林下及草地，歐、亞兩洲及北非也有分布，北美亦有引入［1］。牛至精油具有抑菌消炎、抗氧化、促進(jìn)動物生長、提高動物機體免疫力等作用，是一種理想的抗生素替代品，已是世界范圍內(nèi)公認(rèn)的天然飼料添加劑［2-6］。

牛至在我國雖分布廣泛，但野生資源量較少，近年來隨著需求量的增加，野生資源也因被無序采挖而破壞嚴(yán)重［7］。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號公告，我國從2020年7月1日起禁止使用抗生素類飼料添加劑。畜牧養(yǎng)殖業(yè)體量龐大，隨著“禁抗”令的頒布實施，以牛至精油為代表的“替抗”產(chǎn)品需求將激增，國內(nèi)牛至精油市場缺口將進(jìn)一步拉大。

牛至在西班牙、墨西哥和地中海地區(qū)的飲食中被作為香料長期使用，因此人工種植較多［8-9］。國內(nèi)牛至人工栽培起步晚、規(guī)模小［10］，目前牛至精油生產(chǎn)仍主要依賴野生資源供給，并且在市場流通中混偽品較多，遠(yuǎn)不能滿足規(guī)模化生產(chǎn)的需求［11］。因此，牛至產(chǎn)業(yè)的發(fā)展首先要解決資源匱乏、供應(yīng)不足的瓶頸問題。

目前國內(nèi)牛至種植及繁育方面的研究相對較少，僅有少量育種、人工引種栽培、繁育系統(tǒng)、扦插及組培方面的研究報道［7，12-17］。利用種子繁殖是植物最重要的繁殖方式，對種子萌發(fā)特性及其發(fā)芽影響因素的了解是對其擴繁的基礎(chǔ)，種子萌發(fā)情況的好壞會對種苗培育效率產(chǎn)生直接的影響。本研究開展了不同環(huán)境因子及不同貯藏條件下牛至種子的萌發(fā)試驗，旨在摸清牛至種子在不同萌發(fā)條件下的發(fā)芽情況，為實際生產(chǎn)中利用種子擴繁牛至種苗提供理論依據(jù)，對于擴大牛至資源量，實現(xiàn)牛至產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料

試驗所用牛至種子來源于野外采集，于2019年10～11月及2020年10～11月分別采自云南省麗江、大理等地，采回后搓皮凈種。野外植株經(jīng)重慶市藥物種植研究所劉正宇研究員鑒定為牛至（Origanum vulgareL.）。所采牛至的苞片呈現(xiàn)紫色、花為粉紅色，根據(jù)中牛至亞種的檢索表［18］，此亞種為Origanum vulgareL.ssp.vulgareL.。開展試驗前對種子進(jìn)行消毒，用0.5%的高錳酸鉀溶液浸泡30 min，用蒸餾水清洗3遍備用。

2 研究方法

2.1 不同溫度條件下牛至種子萌發(fā)試驗

于2021年3～4月開展試驗。在培養(yǎng)皿底部鋪墊吸水紙和濾紙，加入適量蒸餾水，挑選大小均勻、飽滿的牛至種子，播撒在濾紙上，用封口膜將培養(yǎng)皿蓋子周圍密封好，保持水分，放進(jìn)RDN-260B型人工氣候箱中進(jìn)行萌發(fā)試驗。設(shè)置5個恒溫條件：①15℃、②20℃、③25℃、④30℃、⑤35℃，光照強度2 500 lx，濕度70%。每個處理50粒，重復(fù)3次。以胚根長至種子一半長度視為萌發(fā)，記錄萌發(fā)時間，在萌發(fā)開始后14 d統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)。

2.2 不同光照強度下牛至種子萌發(fā)試驗

于2021年6～8月開展試驗。培養(yǎng)皿同前處理，設(shè)置7個光強條件：①黑暗、②500 lx、③1 000 lx、④1 500 lx、⑤2 000 lx、⑥2 500 lx、⑦3 000 lx，播撒牛至種子，用封口膜將培養(yǎng)皿蓋子周圍密封好，黑暗處理為用錫箔紙全部包裹培養(yǎng)皿，放進(jìn)人工氣候箱中。溫度25℃，濕度70%。每個處理50粒，重復(fù)3次，萌發(fā)后14 d統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)。

2.3 不同土壤含水率條件下牛至種子萌發(fā)試驗

于2021年4～5月開展試驗。設(shè)置2種土壤條件：Ⅰ土壤、Ⅱ添加沙子的土壤（土壤：細(xì)沙=3：1）。將準(zhǔn)備好的細(xì)土和細(xì)沙進(jìn)行高溫高壓（121℃、105 Pa）滅菌。設(shè)置6個含水率梯度，處理Ⅰ每個培養(yǎng)皿中加入50 g細(xì)土，處理Ⅱ加入30 g細(xì)土和10 g細(xì)沙，混勻，加入蒸餾水，使其含水率分別達(dá)到①10%、②20%、③30%、④40%、⑤50%、⑥60%，播撒牛至種子，用封口膜將蓋子周圍密封好，放進(jìn)人工氣候箱中。設(shè)置光照強度為2 500 lx，溫度25℃，濕度70%。每個處理50粒，重復(fù)3次，萌發(fā)后14 d統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)。

2.4 不同貯藏條件下牛至種子萌發(fā)試驗

牛至種子貯藏試驗采用4種貯藏方式：Ⅰ室溫干藏、Ⅱ室溫沙藏、Ⅲ4℃沙藏、Ⅳ-20℃沙藏。干藏為將種子放入紙袋中，放置在常溫室內(nèi)。沙藏為將種子放入濕沙（濕度5%左右）中，然后分別放置在常溫室內(nèi)、4℃冰箱冷藏、-20℃冰箱冷凍。經(jīng)常加水，保持沙子濕度。新鮮種子采收后即開展一次萌發(fā)試驗，以記錄統(tǒng)計初始種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)。于2019年12月開始貯藏試驗，根據(jù)播種季節(jié)（春播、秋播）設(shè)置分別貯藏①90 d、②120 d、③150 d、④300 d、⑤450 d、⑥660 d，取出部分種子進(jìn)行萌發(fā)試驗，剩余的繼續(xù)貯藏。人工氣候箱溫度設(shè)置為25℃，光照強度2 500 lx，濕度70%。每個處理50粒，重復(fù)3次，萌發(fā)后每天記錄發(fā)芽數(shù)。

2.5 數(shù)據(jù)計算及統(tǒng)計分析

發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、出苗天數(shù)計算方法如下：

出苗天數(shù)（d）=發(fā)芽日期-播種日期。

采用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)計算，使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）及多重比較（LSD法）（P=0.05），數(shù)據(jù)取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同溫度對牛至種子萌發(fā)的影響

試驗結(jié)果顯示，牛至種子在萌發(fā)溫度為20℃和25℃時發(fā)芽率比較高，分別為（88.00±3.46）%和（88.67±8.33）%；在溫度35℃時發(fā)芽率最低，僅為（6.00±2.00）%（圖1A）。就出苗天數(shù)而言，牛至種子在25℃時出苗時間最短，為2 d，在15℃、20℃、30℃及35℃時 出 苗時間 延 長，為4～7 d不等（圖1B）。

圖1 不同溫度條件下牛至種子發(fā)芽率（A）及出苗天數(shù)（B）變化Fig.1 Variation of seed germination rate（A）and emergence days（B）of O.vulgare ssp.vulgare under different temperature conditions

綜合牛至種子發(fā)芽率及出苗天數(shù)來看，在25℃時發(fā)芽情況最好，出苗時間最短且發(fā)芽率高，溫度較低或較高其出苗時間都有所延遲，溫度太高（35℃以上）并不適宜其種子萌發(fā)，因此在播種時最好選擇25℃左右的環(huán)境溫度，能有較好的出苗效果。

3.2 不同光照強度對牛至種子萌發(fā)的影響

牛至種子在黑暗～光照強度3 000 lx下發(fā)芽率均較高，沒有顯著差異（圖2，A），最高達(dá)到（91.33±8.33）%（光照強度2 000 lx）。黑暗～光照強度1 000 lx時出苗天數(shù)為2 d，1 500 lx～3 000 lx時為3 d（圖2，B）。

圖2 不同光照強度下牛至種子發(fā)芽率（A）及出苗天數(shù)（B）變化Fig.2 Variation of seed germination rate（A）and emergence days（B）of O.vulgare ssp.vulgare under different illumination intensity

結(jié)果表明，黑暗和光照條件下牛至種子均能很好萌發(fā)，光照強度對牛至種子發(fā)芽率影響較小，總體出苗天數(shù)也相近，說明光照強度對其發(fā)芽過程的作用較小，不是影響其種子萌發(fā)的主導(dǎo)因素。光照強度1 500 lx以上時存在一定的影響，出苗時間有所延遲。

3.3 不同土壤含水率對牛至種子萌發(fā)的影響

在處理Ⅰ（土壤）中，牛至種子在土壤含水率50%時發(fā)芽率最高，為（66.00±14.42）%；在10%時發(fā)芽率最低，僅為（6.67±9.87）%（圖3，A）。出苗天數(shù)結(jié)果顯示，土壤含水率10%～20%時出苗很慢，需要10 d時間才能出苗；30%～60%時出苗時間為3～5 d左右（圖3，B）。在處理Ⅱ（土壤：細(xì)沙=3：1）中，牛至種子在土壤含水率10%時未出苗，在20%～60%時發(fā)芽率均較高，40%時發(fā)芽率最高達(dá)到（72.67±9.45）%（圖3，A）。出苗時間較一致，均為4 d（圖3，B）。

圖3 不同土壤含水率條件下牛至種子發(fā)芽率（A）及出苗天數(shù)（B）變化Fig.3 Variation of seed germination rate（A）and emergence days（B）of O.vulgare ssp.vulgare under different soil moisture content

綜合而言，牛至種子在土壤含水率40%～50%左右時發(fā)芽率較高，出苗時間較短，適合萌發(fā)。在土壤含水率10%～20%時發(fā)芽率很低且出苗很慢，因此在實際生產(chǎn)播種時要經(jīng)常澆水，保證足量的水分供應(yīng)。

3.4 不同貯藏方式、時間對牛至種子萌發(fā)的影響

試驗結(jié)果顯示，新采收種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)最高（圖4），說明牛至種子不具明顯的休眠現(xiàn)象。隨著貯藏時間的增加，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)總體呈現(xiàn)降低的趨勢（圖4）。四個處理在貯藏120 d前后，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均出現(xiàn)低谷（圖4），同時均出現(xiàn)發(fā)芽延遲（圖5）。在貯藏0～660 d之間，四個處理的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均呈現(xiàn)波狀分布。處理Ⅰ、Ⅳ呈現(xiàn)降升降的波狀規(guī)律，處理Ⅱ、Ⅲ比處理Ⅰ、Ⅳ波動周期短，頻率高，處理Ⅱ在貯藏450 d和660 d時出現(xiàn)波幅增加，處理Ⅲ在貯藏660 d時出現(xiàn)波幅增加（圖4）。

圖4 不同貯藏條件下牛至種子發(fā)芽率（A）、發(fā)芽勢（B）及發(fā)芽指數(shù)（C）變化Fig.4 Variation of seed germination rate（A），germination energy（B）and germination index（C）of O.vulgare ssp.vulgare under different storage conditions

總體而言，貯藏0～300 d，處理Ⅲ、Ⅳ（低溫貯藏）比處理Ⅰ、Ⅱ（室溫貯藏）的發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)高，貯藏300～660 d，處理Ⅰ、Ⅱ比處理Ⅲ、Ⅳ的發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)高（圖4），說明低溫冷藏或冷凍在1年內(nèi)效果比常溫貯藏好，超過1年后效果下降。

整體出苗時間為3～5 d左右，隨著貯藏時間的增加均呈現(xiàn)出延長的趨勢，-20℃沙藏660 d時出苗時間明顯延長至9 d（圖5）。因此牛至種子貯藏時間不宜過長，貯藏超過2年其出苗時間越來越延遲，不適合應(yīng)用于大批量育苗工作中。

圖5 不同貯藏條件下牛至種子出苗天數(shù)變化Fig.5 Variation of emergence days of O.vulgare ssp.vulgare under different storage conditions

4 討論

4.1 弱光照有可能加快牛至種子萌發(fā)

光照強度對種子萌發(fā)具有重要影響，合適的光照環(huán)境是一些植物種子萌發(fā)、幼苗建植的關(guān)鍵［19］。不同植物種子萌發(fā)對光照有不同的需求。趙富王等研究了光照對陜北退耕地植物種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)香青蘭、鐵桿蒿、益母草、菊葉委陵菜和敗醬在光照條件下種子萌發(fā)率顯著高于黑暗條件下，而狗尾草則為相反情況，白羊草、大針茅、杠柳和紫丁香的種子萌發(fā)率在兩種條件下無顯著差異［20］。趙明等通過對六種草地植物的研究發(fā)現(xiàn)，防風(fēng)、角蒿和黃金菊的種子萌發(fā)率不受光照強度影響，而反枝莧、大果琉璃草和紫菀種子喜弱光或中等光照［21］。郭霏等研究表明沙蔥有光休眠現(xiàn)象，為需暗種子［22］。本試驗中，黑暗和光照條件下牛至種子的發(fā)芽率沒有顯著差異，而在光照強度1 500 lx以下時出現(xiàn)出苗時間短的現(xiàn)象，說明較弱光照可能會加快牛至種子萌發(fā)，其生理原因還有待進(jìn)一步研究。

4.2 土壤含水量過高牛至種子種苗存在霉變腐爛風(fēng)險

水分是植物種子萌發(fā)的必要條件。一般來說種子萌發(fā)時的含水量明顯高于貯藏期間的含水量，也高于種子成熟期的含水量，足量的水分使胚內(nèi)的蛋白質(zhì)等大分子及細(xì)胞器活化，促進(jìn)種子萌動［23］。土壤含水率過低會使種子受到水分脅迫，吸水量不足，萌發(fā)率降低，萌發(fā)時間延長［24］。過高的土壤含水量會造成積水環(huán)境，長時間浸泡會導(dǎo)致種子無氧呼吸，霉菌感染，使其腐爛從而降低出苗率［25-26］。我們在試驗過程中發(fā)現(xiàn)土壤含水率50%～60%時，由于培養(yǎng)皿封閉環(huán)境的積水浸泡，培養(yǎng)皿內(nèi)發(fā)霉現(xiàn)象較其他處理明顯，發(fā)霉可能是由于種子消毒、土壤滅菌不徹底或?qū)嶒灢僮鬟^程造成，因此在實際生產(chǎn)中過高的土壤含水率就增加了種子的霉變風(fēng)險。此外還發(fā)現(xiàn)有萌發(fā)的幼苗被浸泡腐爛的現(xiàn)象，也會造成牛至種苗損失，因此在生產(chǎn)育苗時應(yīng)注意排水、通風(fēng)，防止土壤積水。

4.3 貯藏對牛至種子萌發(fā)影響較大

未貯藏的新鮮牛至種子育苗效果最好（圖4-圖5），隨著貯藏時間的增加，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)總體呈現(xiàn)降低的趨勢，因此盡量使用最近采集的種子來進(jìn)行育苗、直播等。貯藏溫度是影響種子壽命的關(guān)鍵因素之一，一般來說，貯藏溫度高、呼吸作用強不利于種子生活力的保持，低溫貯藏時種子的呼吸作用較弱，內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)消耗較慢，能使種子壽命延長［27-28］，但是也有一些研究顯示有常溫貯藏效果優(yōu)于低溫貯藏的情況［29］。本試驗中，牛至種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)在各貯藏條件下，均呈現(xiàn)波狀分布（圖4）。在貯藏0～660 d范圍內(nèi)，貯藏120 d前后均出現(xiàn)出苗時間延長，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)低谷，可能是因為種子在貯藏前期有一定量的活躍有機成分，隨著貯藏時間的延長逐漸消耗或轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定有機成分，影響了發(fā)芽。貯藏120 d以后，隨著細(xì)胞的活動，部分穩(wěn)定有機成分少量活化，一定程度上促進(jìn)了發(fā)芽。因此，牛至種子可能存在輕度的后熟現(xiàn)象，生理驗證有待進(jìn)一步研究。

本研究通過探索不同溫度、光照強度、土壤含水率及不同貯藏方式、時間對牛至種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)牛至種子無明顯休眠現(xiàn)象，最適萌發(fā)溫度為25℃，需要40%～50%左右的土壤含水率，光照強度不是影響萌發(fā)的主導(dǎo)因素，4℃沙藏和-20℃沙藏在1年內(nèi)比室溫干藏和室溫沙藏效果好，之后效果下降。因此在牛至實際生產(chǎn)育苗中，要注意選擇適宜的氣溫及水分條件，播種盡量使用新采集的種子，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數(shù)都較高，出苗時間短，出苗效果好，如剩余種子需要貯藏，可根據(jù)計劃貯藏時間綜合考量貯藏成本和生產(chǎn)需要來選擇適合的貯藏方式。