向微微 葉夢珺 候 萌 銀方方 劉雅薇 王銀龍 潘 睿 王金泉

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052)

2020年起，我國施行飼料端禁抗[1]，養(yǎng)殖必須遵循科學、綠色的飼養(yǎng)原則，開發(fā)抗生素替代物是大勢所趨。已有研究證明益生菌是常規(guī)抗生素飼料添加劑的替代品，在反芻動物飼料中添加益生菌可提高胃腸道免疫功能[2-3]，且同源益生菌更有利于宿主健康[4]。彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus，L.curvatus)是益生菌的一種，可產(chǎn)生細菌素，在食物發(fā)酵工業(yè)廣泛應用[5]。Jo等[6]從泡菜中分離了一株彎曲乳桿菌WiKim38，可調(diào)節(jié)免疫反應，誘導樹突狀細胞中抗炎細胞因子白細胞介素-10的產(chǎn)生，并且減輕小鼠腸道炎癥性疾??；Zommiti等[7]研究發(fā)現(xiàn)，雞源彎曲乳桿菌DN317可增加Caco-2細胞對白細胞介素-8和β-防御素2的分泌；此外，Jeung等[8]報道，口服彎曲乳桿菌HY7601可緩解小鼠飲食誘導的肥胖。目前國內(nèi)未見彎曲乳桿菌的相關(guān)報道，且有關(guān)羊源益生菌的研究也鮮見報道。因此，本研究擬從綿羊糞便中分離出具有益生特性、口服安全且無致病性的益生菌，為未來在綿羊養(yǎng)殖業(yè)中的應用打下基礎(chǔ)，以推進綿羊綠色養(yǎng)殖。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

糞便樣品來源于新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院教學用成年雄性新疆細毛羊，飼養(yǎng)于新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院試驗動物房，飼糧為精飼料和苜蓿，自由飲水，試驗羊經(jīng)獸醫(yī)健康認定無抗生素使用史。雄性昆明種小鼠[4周齡，無特定病原體(SPF)級，體質(zhì)量(20±2) g]共44只，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心，自由采食和飲水。

1.1.2 試驗試劑及供試菌

MRS固體及液體培養(yǎng)基、CaCO3、牛膽鹽、伊紅和蘇木素染色液為北京索萊寶科技有限公司，LB培養(yǎng)基、HBI乳酸菌生化鑒定條為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，細菌藥敏紙片(批號：20172400206)為杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品，4%多聚甲醛、中性樹膠為Biosharp品牌，石蠟為上海懿洋儀器有限公司產(chǎn)品，小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、總蛋白檢測試劑盒為武漢伊萊瑞特生物科技有限公司產(chǎn)品，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌菌株為新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院臨床獸醫(yī)學實驗室保存菌株。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

無菌收集綿羊新鮮糞便共計13份樣品。

1.2.2 乳酸菌初分離

無菌稱取綿羊糞便樣品1 g，用9 mL滅菌生理鹽水懸勻，取200 μL上清液接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃下恒溫培育12 h，梯度稀釋，取10-4、10-5和10-6稀釋度的菌液于MRS瓊脂平板上涂布，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h，用接種環(huán)挑取單菌落增菌，后進行劃線純化，革蘭氏染色法觀察乳酸菌形態(tài)，60%甘油與菌液按1∶1保菌，-20 ℃凍存。

1.2.3 分離菌的益生菌潛力篩選

1.2.3.1 耐酸性

將磷酸鹽緩沖液(PBS)的pH分別調(diào)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.4備用。將凍存的乳酸菌分離株活化后，取菌液1 mL，6 000 r/min離心3 min后棄去上清，再分別加入1 mL預調(diào)的不同pH的PBS重懸，37 ℃搖床處理2 h。吸取處理后的菌液200 μL接種到5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床培養(yǎng)16 h，培養(yǎng)結(jié)束后，吸取200 μL到96孔板中，在酶標儀上測其在600 nm處的吸光度(OD600)值[9-10]，樣品測量一式三份，重復3次。

1.2.3.2 耐膽鹽

用蒸餾水配制膽鹽濃度分別為0、0.1%、0.3%、0.5%、1.0%的溶液。挑選耐酸的乳酸菌分離株，取1 mL菌液離心棄上清，用1 mL配制好的不同濃度的膽鹽溶液重懸，37 ℃搖床處理2 h，后續(xù)處理和檢測方法同1.2.3.1。

1.2.3.3 藥敏試驗

挑選耐酸、膽鹽活性優(yōu)異且穩(wěn)定的分離菌，活化增菌后，采用紙片法進行藥敏試驗，共選用14種抗生素(青霉素G、頭孢噻肟、氨芐西林、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、磺胺異惡唑、諾氟沙星、恩諾沙星、萬古霉素、克林霉素、紅霉素)，試驗結(jié)果根據(jù)歐盟藥敏試驗標準(2016)判定。

1.2.3.4 溶血活性

分離菌活化增菌后在血平板上涂布或劃線，觀察菌落周圍是否有溶血性環(huán)。

1.2.3.5 抗菌活性測定

將病原菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌)涂布于LB瓊脂平板，牛津杯放置于LB瓊脂平板上，杯中加入200 μL(108CFU/mL)分離菌液體培養(yǎng)物，培養(yǎng)12 h后測定抑菌圈的直徑。

1.2.4 分離菌的鑒定

1.2.4.1 生化鑒定

用HBI乳酸菌生化鑒定條進行生化反應鑒定，鑒定結(jié)果與《伯杰氏系統(tǒng)細菌手冊》對比后歸類。

1.2.4.2 16S rRNA 基因序列分析

水煮法提取分離菌基因組總DNA，PCR擴增的引物信息見表1，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物質(zhì)量后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序分析，測序結(jié)果上傳于NCBI網(wǎng)站進行序列比對，分析其種屬。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 分離菌生長和產(chǎn)酸曲線測定

按照1%接種量培養(yǎng)菌株，每隔2 h取菌液，檢測OD600值和培養(yǎng)液pH。

1.2.6 分離菌安全性評價

1.2.6.1 灌胃

20只小鼠適應環(huán)境7 d后隨機分為2組，Ⅰ組(對照組)灌胃PBS(0.2 mL)，Ⅱ組(試驗組)灌胃108CFU/mL彎曲乳桿菌Y15(0.2 mL)，持續(xù)10 d[4,11-12]。小鼠自由采食和飲水(不含抗生素)。每天灌胃前記錄小鼠的體重和采食量變化，觀察小鼠毛色、整體精神狀態(tài)及分泌物、排泄物狀況。飼喂結(jié)束后，摘除眼球采集抗凝血和全血，進行血液學參數(shù)(血細胞常規(guī)和血清生化指標)分析；將小鼠處死后取肝臟、脾臟、腎臟稱重，計算臟器指數(shù)[臟器指數(shù)(%)=100×臟器質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)]；采集結(jié)腸組織放入4%多聚甲醛中固定，制作石蠟切片，然后用蘇木精-伊紅(HE)染色，并在顯微鏡下觀察，隨機選10個視野，記錄杯狀細胞數(shù)量[13]。

1.2.6.2 腹腔注射

24只小鼠適應環(huán)境7 d后隨機分為2組，Ⅲ組(對照組)腹腔注射生理鹽水(0.2 mL)，Ⅳ組(試驗組)腹腔注射109CFU/mL彎曲乳桿菌Y15(0.2 mL)，小鼠自由采食和飲水(不含抗生素)，觀察7 d，記錄體重以及臨床狀態(tài)變化。結(jié)束后將小鼠處死，解剖觀察各組織器官是否存在病理變化[12]。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS20.0進行t檢驗，GraphPadPrism9作圖，結(jié)果表示為平均值±標準差，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 乳酸菌初分離

共挑取在MRS固體培養(yǎng)基上呈乳白色，微凸起，表面光滑的單菌落55個(編號Y1～55，Y為“羊”字拼音的首字母縮寫，數(shù)字為挑菌順序)。進一步劃線純化(圖1-A)，革蘭氏染色后其中有5株為呈革蘭氏陽性的長桿狀(圖1-B)。將桿菌進一步純化后于-20 ℃保存。

A：MRS瓊脂平板劃線；B：革蘭氏染色(100×)。A: MRS agar plate streak; B: Gram stain (100×)。圖1 分離菌Y15形態(tài)Fig.1 Morphology of isolated bacteria Y15

2.2 分離菌的益生菌潛力篩選

2.2.1 耐酸性

由表2可知，受試分離菌都能夠在預設的不同pH下存活，包括在pH為3時，OD600值均在1.00左右，選擇對酸性耐受力相對更好的分離菌Y1、Y15、Y18用于進一步篩選試驗。

表2 分離菌經(jīng)不同pH處理后存活的OD600值Table 2 Survival OD600 values of isolated bacteria treated with different pH

2.2.2 耐膽鹽

由表3可知，分離菌株Y1、Y15、Y18耐受膽鹽能力均較強。

表3 分離菌經(jīng)不同膽鹽濃度處理后存活的OD600值Table 3 Survival OD600 values of isolated bacteria treated with different bile salt concentrations

2.2.3 藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果見圖2及表4。分離菌Y1、Y15、Y18之間具有相似的抗生素耐藥性和敏感性，耐受鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、磺胺異惡唑、諾氟沙星、恩諾沙星、萬古霉素，對青霉素G、頭孢噻肟、氨芐西林和克林霉素敏感。

圖2 分離菌部分藥敏試驗Fig.2 Partial susceptibility testing of isolated bacteria

2.2.4 溶血活性

由圖3可知，分離菌Y1、Y15、Y18均無溶血活性。

2.2.5 抗菌活性

由表5可知，3株分離菌Y1、Y15、Y18對金黃色葡萄球菌均有一定的抑制效果，其中分離菌Y15抑制效果最佳；此外，分離菌Y15對大腸桿菌的抑制效果最佳，3株分離菌對沙門氏菌均無明顯的抑制效果。

2.3 分離菌的鑒定

2.3.1 生化鑒定

分離菌Y15生化結(jié)果中七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、水楊苷、菊糖、乳糖和核糖試驗為陽性，甘露醇、山梨醇、蔗糖、棉子糖和1%馬尿酸鈉試驗為陰性，初步確定分離菌Y15為乳桿菌屬的彎曲乳桿菌。

表4 分離菌藥敏試驗結(jié)果Table 4 Drug susceptibility test results of isolated bacteria mm

A：Y1；B：Y15；C：Y18。圖3 分離菌在血瓊脂平板上形態(tài)Fig.3 Morphology of isolate bacteria on blood agar plates

2.3.2 16S rRNA基因序列分析

分離菌Y15總DNA的PCR擴增產(chǎn)物片段大小約為1 500 bp(圖4)，測序結(jié)果制作進化樹(圖5)，分離菌Y15與NCBI上已發(fā)布的彎曲乳桿菌基因組序列同源性極高，因此確定該分離菌為彎曲乳桿菌，將其命名為彎曲乳桿菌Y15。

2.4 彎曲乳桿菌Y15生長和產(chǎn)酸曲線

彎曲乳桿菌Y15在0～3 h為生長遲緩期，4 h開始進入對數(shù)期，直到16 h達到穩(wěn)定期，后保持到24 h，自開始生長培養(yǎng)液pH逐漸降低，4 h開始pH迅速下降直到16 h，到24 h趨于平穩(wěn)(圖6)。

表5 分離菌抑菌試驗結(jié)果Table 5 Bacteriostatic test results of isolated bacteria mm

M：DNA分子量標準DL2000；1：陰性對照；2：陽性對照；3：Y15。M: DNA Maker DL2000; 1: negative control; 2: positive control; 3: Y15.圖4 分離菌Y15 16S rRNA基因擴增鑒定結(jié)果Fig.4 Results of 16S rRNA gene amplification and identification of isolated bacterium Y15

2.5 彎曲乳桿菌Y15安全性評價

2.5.1 灌胃

2.5.1.1 小鼠剖檢及結(jié)腸切片

灌胃彎曲乳桿菌Y15過程中，2組小鼠毛色、精神狀態(tài)和糞便均正常，口、鼻、耳及肛門處無異常分泌物。如圖7所示，剖檢觀察時，小鼠腹腔內(nèi)主要器官均無明顯肉眼可見病變，2組之間無明顯眼觀差異；在顯微鏡下觀察，2組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，未觀察到明顯病理變化，Ⅱ組結(jié)腸組織中杯狀細胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)。

圖5 分離菌Y15和乳酸桿菌屬關(guān)系進化樹Fig.5 Evolutionary tree of relationship between isolate bacterium Y15 and Lactobacillus

2.5.1.2 生長性能

從表6可以看出，2組小鼠的體重、平均日增重、體重增長率及平均日采食量無顯著差異(P>0.05)。

2.5.1.3 臟器指數(shù)

從表7可以看出，與Ⅰ組比較，灌胃彎曲乳桿菌Y15的小鼠肝臟指數(shù)明顯減少(P<0.05)，對脾和腎臟指數(shù)均無顯著影響(P>0.05)。

圖6 彎曲乳桿菌Y15生長和產(chǎn)酸曲線Fig.6 Growth and acid production curves of Lactobacillus curvatus Y15

2.5.1.4 血液學參數(shù)

從表8可以看出，2組小鼠血常規(guī)指標、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性和尿素氮含量均無顯著差異(P>0.05)。與Ⅰ組相比，灌胃彎曲乳桿菌Y15顯著增加了小鼠血清總蛋白含量(P<0.05)。

2.5.2 腹腔注射

如圖8所示，腹腔注射后的7 d內(nèi)觀察期間Ⅲ組和Ⅳ組小鼠的體重均無顯著差異(P>0.05)，未見異常癥狀和死亡，小鼠剖檢腹腔內(nèi)臟器無明顯眼觀病理變化。

3 討 論

3.1 彎曲乳桿菌益生特性篩選

益生特性篩選是評估益生菌生物活性的主要方法，潛在的益生菌須具有的特性：耐酸性、膽鹽耐受性、無獲得性耐藥、有對潛在致病菌的抗菌活性和無溶血活性[14]。據(jù)報道，從奶酪中分離的彎曲乳桿菌A61不耐酸，在pH=6.0的環(huán)境中即生長較慢[15]，但本試驗中分離出的彎曲乳桿菌Y15當pH從6.0下降到3.0時，菌株仍然能夠保持其生長活力，說明此分離菌具有優(yōu)異的耐酸性。Jo等[6]從泡菜中分離的彎曲乳桿菌DN317可在1%的膽汁中保持活性[6]，本試驗獲得的羊源彎曲乳桿菌Y15能在膽鹽濃度0.1%增加到1.0%過程中存活，對膽鹽具有高耐受性，與上述試驗結(jié)果一致。綜合其良好的耐酸、耐膽鹽的能力，本試驗獲得的羊源彎曲乳桿菌Y15具有可制備成口服制劑的潛力。

A：Ⅰ組剖檢；B：Ⅱ組剖檢；C：Ⅰ組結(jié)腸切片(200×)；D：Ⅱ組結(jié)腸切片(200×)；E：杯狀細胞數(shù)量。圖E中數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。A: autopsy of group I; B: autopsy of group Ⅱ; C: colon section of group I (200×); D: colon section of group Ⅱ (200×); E: number of goblet cells.In the figure E, value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05).圖7 小鼠剖檢及結(jié)腸切片F(xiàn)ig.7 Autopsy and colon section of mice

表6 灌胃彎曲乳桿菌Y15對小鼠生長性能的影響Table 6 Effects of gavage of Lactobacillus curvatus Y15 on growth performance of mice

表7 灌胃彎曲乳桿菌Y15對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 7 Effects of gavage of Lactobacillus curvatus Y15 on organ indexes of mice %

表8 灌胃彎曲乳桿菌Y15對小鼠血液學參數(shù)的影響Table 8 Effects of gavage of Lactobacillus curvatus Y15 on hematological parameters of mice

A：小鼠體重；B：Ⅲ組剖檢；C：Ⅳ組剖檢。圖A中數(shù)據(jù)點標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)。A: body weight of mice; B: autopsy of group Ⅲ; C: autopsy of group Ⅳ.In the figure A, value points with different small letter mean significant difference (P<0.05), while with no letter mean no significant difference (P>0.05).圖8 小鼠的體重及剖檢 Fig.8 Body weight and autopsy of mice

抗生素耐藥性是評估菌株安全性的重要指標，彎曲乳桿菌DN317對氨芐西林、克林霉素和紅霉素敏感[6]，與本試驗結(jié)果一致。Gevers等[16]研究發(fā)現(xiàn)，彎曲乳桿菌對四環(huán)素有耐藥性，但本次分離的彎曲乳桿菌Y15對四環(huán)素表現(xiàn)敏感，說明其安全性高。溶血活性是判斷益生菌安全性的重要標準，益生菌菌株應缺乏溶血活性[17]。本次從綿羊糞便中分離出的彎曲乳桿菌Y15不具有溶血活性，這與Jung等[17]的試驗結(jié)果一致。

益生菌能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，刺激機體的免疫反應，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性[18]。彎曲乳桿菌可產(chǎn)生細菌素，表現(xiàn)出廣譜的抑菌活性[19]。Castilho等[20]發(fā)現(xiàn)，彎曲乳桿菌對李斯特菌具有很高的抑菌活性。本研究中，彎曲乳桿菌Y15在體外能夠抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長。

3.2 彎曲乳桿菌Y15的生長特性

測定微生物生長和代謝產(chǎn)物生成曲線有助于選擇最佳生長條件以及了解微生物的生長特性[21]。研究表明，乳酸菌37 ℃培養(yǎng)時，6～16 h為對數(shù)期[22]，且生長過程中2～16 h能快速產(chǎn)酸，培養(yǎng)液pH可低至4[23]，對數(shù)期的菌株活力較好，通常選取該時期的菌用于益生菌制劑的制備[24]。彎曲乳桿菌Y15作為一種乳酸菌，本試驗結(jié)果顯示其在37 ℃培養(yǎng)時，4 h即可進入對數(shù)期且持續(xù)時間長，生長特性與前人的研究基本一致，表明其具有用于開發(fā)益生菌制劑的潛力。

3.3 彎曲乳桿菌Y15的安全性

潛在的益生菌投入使用前，需證明其食用安全性和非致病性[25]。Han等[26]通過急性和亞慢性毒性試驗證明彎曲乳桿菌WiKim 38對SD大鼠無毒性作用。Choi等[27]研究了彎曲乳桿菌發(fā)酵奶對大鼠模型中牙周疾病和腸道健康的影響，Park等[28]發(fā)現(xiàn)彎曲乳桿菌可降低大鼠高膽固醇血癥，但國內(nèi)外文獻少見其小鼠體內(nèi)安全性評價。在其他益生菌的安全性研究中，Lazarenko等[29]給小鼠連續(xù)7 d灌胃干酪乳桿菌IMV B-728，結(jié)果顯示，該菌株無毒性，并能促進腸道健康微生物群的建立，是一種安全的益生菌；王楠等[11]通過7 d的口服急性毒性試驗證明了人源益生性鏈球菌的安全性。本試驗給小鼠持續(xù)灌胃10 d羊源彎曲乳桿菌Y15，發(fā)現(xiàn)其對小鼠生長和飲食、循環(huán)血細胞的功能均無不良影響。有研究顯示，結(jié)腸部位杯狀細胞能夠產(chǎn)生黏蛋白，對腸黏膜具有重要的保護作用，且利于糞便的排出[13]。彎曲乳桿菌Y15顯著增加了結(jié)腸組織中杯狀細胞的數(shù)量，說明其可增強腸道黏膜屏障功能。相對于對照組，灌胃彎曲乳桿菌Y15的小鼠肝臟指數(shù)顯著降低，為4.70%，國內(nèi)對SPF級昆明小鼠臟器質(zhì)量的測定結(jié)果顯示肝臟指數(shù)在4%～5%[30]，本試驗結(jié)果在此范圍內(nèi)，表明彎曲乳桿菌Y15未對小鼠臟器產(chǎn)生不良影響。此外，血清生化指標結(jié)果顯示試驗組的血清總蛋白含量比對照組高，但文獻顯示該值在正常范圍內(nèi)[31]，其升高的原因可能是由于彎曲乳桿菌Y15誘導了免疫系統(tǒng)的活躍。腹腔注射是評估細菌對動物致病性的常用方法[32]。潘艷等[12]給小鼠腹腔注射109CFU的微生態(tài)菌懸液以探究其致病性。本試驗中，腹腔注射彎曲乳桿菌Y15后，7 d觀察期間，小鼠的生理狀態(tài)均正常，無發(fā)病和死亡，解剖后小鼠體內(nèi)臟器均無異常，說明彎曲乳桿菌Y15無致病性。

4 結(jié) 論

羊源彎曲乳桿菌Y15具有良好的耐酸、耐膽鹽特性，且在體外抑菌試驗中顯示出抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長的效果，對多種常見抗生素敏感，無溶血活性，具有良好的安全性，可顯著增加小鼠結(jié)腸組織中杯狀細胞的數(shù)量，具有良好的益生特性。