張冰琪 李冰心 楊保和 袁明鳳 李婉雁 曹 楠,4 許丹寧 田允波 陳文斌*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣州 510225；2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510225；3.云南快大多畜牧科技有限公司，玉溪 653100；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128)

法氏囊作為鳥(niǎo)類特有的中樞免疫器官，是一種與泄殖腔相連的盲憩室形式的腸道相關(guān)淋巴組織[1-2]。法氏囊腔通過(guò)一條狹窄的法氏囊管與泄殖腔相連，內(nèi)部含有約10 000個(gè)淋巴囊泡[3]。法氏囊囊泡由皮質(zhì)和髓質(zhì)構(gòu)成，囊泡內(nèi)的微環(huán)境為B細(xì)胞的多樣性及其分化、發(fā)育和成熟提供了獨(dú)特的微環(huán)境[4-5]。因此，幼雛法氏囊在中樞和外周免疫系統(tǒng)中發(fā)揮主要作用[6]。如何提高幼雛免疫力一直是養(yǎng)殖業(yè)的研究重點(diǎn)之一。所以，探究雛鵝法氏囊的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制具有非常重要的作用。

Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)作為一種典型的模型識(shí)別受體，廣泛分布在樹(shù)突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞等中，通過(guò)識(shí)別外源病原體而發(fā)揮重要作用[7-8]。例如在B淋巴細(xì)胞中，TLR4通過(guò)酪氨酸激酶對(duì)B細(xì)胞受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與免疫活動(dòng)；在巨噬細(xì)胞中，TLR4識(shí)別病原體后，激活下游信號(hào)通路核因子-κB(NF-κB)，介導(dǎo)免疫反應(yīng)[9-10]。

脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外壁的主要成分，被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別而發(fā)揮作用[11-12]。LPS的刺激能夠促使禽類機(jī)體炎癥的發(fā)生，造成機(jī)體免疫器官損傷，降低機(jī)體免疫水平[13-15]。LPS可以通過(guò)TLR4信號(hào)通路誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的釋放，刺激自由基表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體損傷[16-17]。因此，LPS常被用于構(gòu)建研究動(dòng)物免疫應(yīng)激模型。白術(shù)多糖(polysaccharide ofAtractylodesmacrocephalaKoidz，PAMK)作為傳統(tǒng)中藥“白術(shù)”的重要提取物，具有促進(jìn)免疫器官的生長(zhǎng)發(fā)育、維持機(jī)體細(xì)胞免疫、體液免疫以及黏膜免疫功能的相對(duì)穩(wěn)定等功能[18-21]。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，PAMK可以通過(guò)TLR4-骨髓分化因子88(MyD88)-NF-κB信號(hào)通路緩解LPS誘導(dǎo)的小鼠肝炎，刺激小鼠脾臟中細(xì)胞因子分泌，從而提高機(jī)體免疫力[22-23]。同時(shí)，PAMK可以有效改善LPS誘導(dǎo)的雛鵝腸道菌群紊亂[24]。另外，前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PAMK還可以通過(guò)激活T淋巴細(xì)胞，維持體液和細(xì)胞免疫平衡，進(jìn)而緩解環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的雛鵝免疫抑制[25-26]。除此之外，PAMK在熱應(yīng)激調(diào)節(jié)過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)PAMK可以通過(guò)提高雞脾臟中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)活性，降低丙二醛(MDA)含量，進(jìn)而緩解熱應(yīng)激誘導(dǎo)的雞脾臟損傷[27]。因此，本試驗(yàn)通過(guò)建立LPS誘導(dǎo)的雛鵝法氏囊損傷模型，以探究PAMK在LPS誘導(dǎo)雛鵝法氏囊損傷過(guò)程中對(duì)法氏囊內(nèi)免疫細(xì)胞因子含量、TLR4信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

微孔板分光光度計(jì)(Epoch，BioTek Instruments，美國(guó))；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(ELX800，博騰儀器公司，美國(guó))；分光光度計(jì)(UV-3100，MAPADA公司，中國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7500，Life Technologies，美國(guó))；多功能梯度PCR儀(2720，Life Technologies，美國(guó))；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司，中國(guó))。

1.2 主要藥品和試劑

95% PAMK(西安某生物制劑廠，中國(guó))；注射用LPS(Sigma，美國(guó))；氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó))；預(yù)混型定量用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，中國(guó))；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(白鯊，中國(guó))；TLR4抗體(愛(ài)博泰克，中國(guó))；p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)抗體(Proteintech，美國(guó))；重組c-Jun氨基末端激酶(JNK)抗體(Abcam，英國(guó))；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及處理

選取1日齡雛鵝200只(雌雄各占1/2)，隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組、LPS組、PAMK組及PAMK+LPS組，各組飼糧中PAMK含量分別為0、0、400和400 mg/kg。每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只。預(yù)試期3 d，正試期25 d。

在養(yǎng)殖期間保證馬岡鵝自由飲水和進(jìn)食，各組間飼養(yǎng)管理無(wú)差異性。LPS組和PAMK+LPS組雛鵝分別于24、26和28日齡腹腔注射濃度為2 mg/kg LPS，對(duì)照組和PAMK組分別注射等量生理鹽水，28日齡注射1 h后，每組隨機(jī)選取15只雛鵝采集法氏囊樣品。小鵝基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1，中鵝基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表2。

1.4 樣品采集

在試驗(yàn)第25天，用藥處理1 h后進(jìn)行采樣。每組隨機(jī)選取3只雛鵝，采集法氏囊組織樣品，保存于10%中性緩沖福爾馬林中備用；每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取2只雛鵝，采集法氏囊組織樣品進(jìn)行稱重，組織樣保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 法氏囊重量測(cè)定

在試驗(yàn)第25天，取新鮮雛鵝的法氏囊器官，用生理鹽水沖洗2～3次，然后用濾紙擦干表面，進(jìn)行稱重。

1.6 法氏囊組織學(xué)觀察

法氏囊于10%中性緩沖福爾馬林中固定48 h后，石蠟包埋，切割成5 μm切片，蘇木精-伊紅(HE)染色。光學(xué)顯微鏡鏡檢，采用CaseViewer軟件采集圖像，分別于200×和400×放大倍數(shù)下觀察法氏囊組織結(jié)構(gòu)。

表1 小鵝基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet for goslings (air-dry basis) %

表2 中鵝基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet for medium geese (air-dry basis) %

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

運(yùn)用Trizol試劑提取各組雛鵝法氏囊中的總RNA。分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA質(zhì)量，然后運(yùn)用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將各樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR Green Master Mix PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL、RNase Free dH2O 7 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，1個(gè)循環(huán)。內(nèi)參基因?yàn)棣?肌動(dòng)蛋白(β-actin)，所用引物序列見(jiàn)表3。每個(gè)樣本分別同時(shí)做目的基因和內(nèi)參基因，均做3個(gè)重復(fù)以消除加樣誤差，記錄各基因擴(kuò)增所需的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 3 Primer sequences for RT-qPCR

1.8 Western blot檢測(cè)

采用組織快速裂解緩沖液提取各組雛鵝法氏囊組織中的總蛋白，隨后運(yùn)用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)各組樣品蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，隨后將樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%的脫脂奶粉中封閉2 h后，分別4 ℃孵育TLR4(1∶2 000)、p38 MAPK(1∶2 000)、JNK(1∶1 000)一抗過(guò)夜，二抗孵育1 h后，使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)量檢測(cè)，并通過(guò)Image J軟件進(jìn)行量化分析。

1.9 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)

每0.1 g法氏囊組織加0.9 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，破碎儀破碎后，2 000×g離心5 min后取上清待用。使用試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測(cè)組織上清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和總抗氧化能力(T-AOC)。

1.10 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，隨后用Tukey法進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示。GraphPad Prism 5.0被用來(lái)將數(shù)據(jù)可視化。P<0.05代表統(tǒng)計(jì)分析差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 PAMK可以緩解LPS誘導(dǎo)的雛鵝法氏囊損傷

形態(tài)學(xué)觀察顯示，與LPS組相比，PAMK+LPS組的法氏囊器官大小明顯上升(圖1-A)；稱量結(jié)果顯示，LPS組的法氏囊重量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，添加PAMK后，法氏囊重量明顯上調(diào)，但與LPS組相比沒(méi)有顯著差異(P>0.05)(圖1-B)。

組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，LPS組法氏囊囊泡排列紊亂，囊內(nèi)出現(xiàn)大量空泡。另外，與對(duì)照組和PAMK組相比，LPS組囊泡的皮質(zhì)面積與髓質(zhì)面積比顯著降低(P<0.05)。同時(shí)，與LPS組相比，PAMK+LPS組的法氏囊形態(tài)學(xué)變化明顯，主要體現(xiàn)在囊泡內(nèi)細(xì)胞整齊、囊泡內(nèi)空泡數(shù)量明顯降低及囊泡的皮質(zhì)面積與髓質(zhì)面積比升高(圖1-C，圖1-D)。

2.2 PAMK可以緩解LPS誘導(dǎo)雛鵝法氏囊中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)上調(diào)

LPS組細(xì)胞因子的mRNA相對(duì)表達(dá)量均不同程度高于對(duì)照組，其中IL-6、IL-1β和TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。PAMK+LPS組IL-10、IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于LPS組(P<0.05)。PAMK組IL-6、IL-10和TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖2)。

2.3 PAMK可以緩解LPS誘導(dǎo)的雛鵝法氏囊中TLR4信號(hào)通路激活

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS組法氏囊TLR4信號(hào)通路中TLR4、TRAF6、IKKε、IκBα和JNK的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高對(duì)照組(P<0.05)。PAMK+LPS組中TLR4、MyD88、p38MAPK和IκBα的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于LPS組(P<0.05)(圖3)。

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS組TLR4和JNK的蛋白表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，p38 MAPK的蛋白表達(dá)量也一定程度上調(diào)，但是差異不顯著(P>0.05)。同時(shí)，與LPS組相比，添加PAMK能顯著降低法氏囊內(nèi)TLR4和p38 MAPK的蛋白表達(dá)量(P<0.05)(圖4)。

圖3 PAMK對(duì)LPS誘導(dǎo)的雛鵝法氏囊TLR4信號(hào)通路及其相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of PAMK on mRNA relative expression levels of TLR4 signaling pathway and related genes of bursa of Fabricius in goslings induced by LPS

2.4 PAMK對(duì)LPS誘導(dǎo)的法氏囊氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和PAMK組相比，LPS組法氏囊T-AOC和SOD活性均顯著降低(P<0.05)(圖5)。PAMK可以顯著緩解LPS誘導(dǎo)的SOD活性降低(P<0.05)；同時(shí)，與對(duì)照組相比，PAMK組SOD活性也顯著升高(P<0.05)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，多種多糖都可不同程度提高免疫器官指數(shù)，增強(qiáng)其免疫能力，一般認(rèn)為，免疫器官重量增加意味著機(jī)體免疫機(jī)能提高[28-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，PAMK可以有效緩解LPS誘導(dǎo)雛鵝法氏囊重量降低。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LPS可以導(dǎo)致雛鵝法氏囊小結(jié)結(jié)構(gòu)疏松，排列紊亂，出現(xiàn)大量細(xì)胞空泡，髓質(zhì)區(qū)面積相對(duì)增大，皮質(zhì)區(qū)面積相對(duì)減小。這將誘導(dǎo)B細(xì)胞輸出減少，法氏囊免疫功能降低[32]。值得注意的是，PAMK可以有效緩解LPS誘導(dǎo)的法氏囊組織結(jié)構(gòu)損傷。這說(shuō)明PAMK有助于維持雛鵝的免疫能力。

圖4 PAMK對(duì)LPS誘導(dǎo)的雛鵝法氏囊TLR4信號(hào)通路及其相關(guān)基因的蛋白表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of PAMK on protein expression of TLR4 signaling pathway and related genes ofbursa of Fabricius in goslings induced by LPS

圖5 PAMK對(duì)LPS誘導(dǎo)的雛鵝法氏囊氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Fig.5 Effects of PAMK on oxidative stress indexes of bursa of Fabricius in goslings induced by LPS

TLR4是在免疫細(xì)胞表面上的重要自然免疫受體之一，在炎癥發(fā)生以及免疫系統(tǒng)激活中發(fā)揮重要作用[33-34]。LPS作為TLR4的特異性刺激劑，可通過(guò)激活TLR4信號(hào)通路調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS組雛鵝法氏囊中TLR4及其通路相關(guān)基因的表達(dá)均高于對(duì)照組；PAMK可以有效緩解LPS誘導(dǎo)的TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游基因p38MAPK的mRNA相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PAMK可以顯著緩解LPS誘導(dǎo)IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量的上升。眾所周知，IL-1β是一種有效的促炎細(xì)胞因子，IL-1β的釋放代表著炎性反應(yīng)的發(fā)生[35-36]。IL-6作為一種典型的維持體內(nèi)平衡的細(xì)胞因子，在機(jī)體被感染或發(fā)生損傷時(shí)會(huì)大量釋放參與免疫調(diào)控[37-38]。同時(shí)，作為免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，TNF-α在炎癥以及其他疾病的刺激下也能通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡的途徑影響免疫系統(tǒng)的發(fā)育和正常功能[39-40]。上述結(jié)果表明，PAMK可能通過(guò)TLR4信號(hào)通路緩解LPS誘導(dǎo)雛鵝法氏囊的炎性細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量上升。

值得注意的是，LPS介導(dǎo)的炎癥發(fā)生會(huì)誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子表達(dá)量上升，產(chǎn)生過(guò)量的自由基以引發(fā)氧化應(yīng)激，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生損傷[41-43]。前期研究發(fā)現(xiàn)，PAMK可以調(diào)節(jié)雛鵝肝臟組織中MDA含量、SOD和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性等抗氧化指標(biāo)的變化[44]。但是，關(guān)于PAMK對(duì)雛鵝法氏囊氧化應(yīng)激的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)法氏囊氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS顯著抑制了法氏囊中SOD的活性。同時(shí)，與LPS組相比，PAMK單獨(dú)或與LPS共同作用都能顯著提高法氏囊中SOD活性。SOD作為生物體抗氧化水平的重要指標(biāo)之一，可以通過(guò)多種機(jī)制清除自由基以達(dá)到抗氧化目的[45-46]。這表明PAMK對(duì)LPS誘導(dǎo)的雛鵝法氏囊氧化應(yīng)激也有一定的緩解作用。

4 結(jié) 論

綜上所述，PAMK是通過(guò)TLR4/p38 MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)，以減輕LPS誘導(dǎo)的雛鵝法氏囊損傷，維持法氏囊組織結(jié)構(gòu)的完整性，從而提高雛鵝法氏囊的免疫應(yīng)答能力。