李 欣 牛 慧 詹經緯 關淑文 屠 焰 蔣林樹*

(1.北京農學院動物科學技術學院，奶牛營養(yǎng)學北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農業(yè)科學院飼料研究所，北京 100081)

氧化應激在高產奶牛中非常普遍。奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)的氧化應激和凋亡導致低產奶量、低質牛奶，甚至使奶牛產生疾病，如乳腺炎、乳房水腫和胎盤滯留[1-2]。研究表明，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的過量產生會導致脂質過氧化物分解成丙二醛(malondialdehyde，MDA)，這是氧化應激的標志[3]。作為一種有害的應激源，MDA會導致蛋白質錯誤折疊，并加劇氧化應激反應的嚴重程度[4]。在氧化應激期間，ROS還導致細胞中谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性下降[5]。因此，任何提高抗氧化酶活性，抑制ROS和MDA產生的物質可一定程度緩解氧化應激產生的損傷。核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2,Nrf2)在抗氧化應激過程中扮演著重要角色，該核轉錄因子與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，如炎癥[6]、氧化應激[7]、代謝性疾病[8]等。目前，許多研究已將Nrf2作為抗氧化靶點。Nrf2的激活可以上調其目標抗氧化基因的表達，從而發(fā)揮抗氧化功能，如血紅氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1)、谷氨酰半胱氨酸連接酶調節(jié)亞基(glutamate cysteine ligase modifier subunit,GCLM)和谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)等均受Nrf2的調控[4]。HO-1是Nrf2下游的主要抗氧化蛋白，可以有效地介導抗氧化應激；此外，致病因子如ROS和MDA也被Nrf2激活抑制[9]。在正常生理狀態(tài)下，Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)與Nrf2共存于細胞質中，這種情況下Nrf2沒有抗氧化活性。當Nrf2被激活后與Keap1解離并轉移到細胞核內與核啟動子結合區(qū)抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)相結合，促進其下游靶基因的表達發(fā)揮抗氧化作用[7]。

殼聚糖(chitosan,CS)是一種來源廣泛的具有良好生物相容性的天然高分子化合物堿性多糖，其還具有價格低廉、低致敏性、低毒、生物降解性和生物黏附性，因為它在體內滯留時間和釋放時間長以及可增加機體對藥物的吸收等方面有出色表現(xiàn)，所以已被廣泛用于生物醫(yī)用材料和靶向給藥等領域[10-11]。作為一種衍生于牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin,BLF)的抗菌肽[12]，牛乳鐵蛋白肽(bovine lactoferricin,BLfcin)含有豐富的堿性氨基酸，如精氨酸和賴氨酸，以及疏水性的色氨酸和苯丙氨酸等殘基，乳鐵蛋白(lactoferrin,Lf)的抗菌效果是它的1/400，除此之外，它同樣具有免疫調節(jié)、抗病毒、抗菌以及抗氧化等多重生物功能[13]。BLfcin具有廣譜抗菌的作用，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及無乳鏈球菌等有抑制作用，但它對動物腸道中的有益菌如熒光假單胞菌、雙歧桿菌以及乳酸菌的殺菌作用差甚至無殺菌作用，說明BLfcin對腸道菌的抑制具有選擇性[14-15]。BLfcin可與細菌在分裂或死亡時釋放出的含脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的生物大分子結合，使其失去毒性，阻斷LPS造成機體的炎癥反應[16]。有研究表明，在奶牛飼糧中添加BLfcin可顯著降低隱性乳房炎的發(fā)病率，同時可提高產奶量、乳脂率和乳蛋白率，改善乳品質[17]。據報道，將含有BLfcin的Lf水解物注射到隱性乳房炎奶牛的乳房中可減少患病乳區(qū)乳汁中的細菌數量[18]。劉景喜等[19]給患有隱性乳房炎奶牛灌服BLfcin，結果發(fā)現(xiàn)患病奶牛產奶量增加，且牛奶中的體細胞數降低，說明BLfcin對隱性乳房炎的治療有一定的輔助效果。然而，BLfcin對奶牛乳腺組織內氧化應激的發(fā)生是否有影響，如何發(fā)揮抗氧化作用，尚未見報道。因此，本試驗通過過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)誘導建立BMECs氧化損傷模型，研究載牛乳鐵蛋白-殼聚糖納米粒(BLfcin-NPs)對BMECs氧化應激和凋亡的保護作用，為調控乳腺內氧化還原平衡，進而改善乳腺健康、提升原料乳質量提供理論依據，為BLfcin-NPs作為奶牛預防氧化應激的新制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

本試驗所用BMECs為東北農業(yè)大學動物生物化學與分子生物學實驗室惠贈；BLfcin-NPs為本實驗室制備，制備方法參見文獻[20]；H2O2購自天津市光復科技發(fā)展有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素/鏈霉素溶液、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)購自Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)為北京沃比森科技有限公司產品；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；MDA、GSH-Px、SOD、CAT檢測試劑盒與二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)熒光探針均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 BMECs氧化損傷模型的構建

1.2.1 細胞分組及處理

在96孔板內培養(yǎng)BMECs，培養(yǎng)12 h待細胞貼壁后，在培養(yǎng)基中加入100 μL濃度分別為0(對照組)、100、200、400、600、800、1 000 μmol/L的H2O2處理細胞0、2、4、6、8、12 h后進行后續(xù)試驗，每組6個重復。

1.2.2 H2O2對BMECs活力的影響

應用MTT試劑盒檢測H2O2對BMECs活力的影響，具體方法依照試劑盒說明書進行操作。將BMECs接種于96孔板中，待細胞密度達到80%～90%后用PBS洗2遍細胞，按照分組分別加入100 μL含有不同濃度(0、100、200、400、600、800、1 000 μmol/L) H2O2的細胞培養(yǎng)液處理不同時間(0、2、4、6、8、12 h)；之后每孔加入10 μL的MTT溶液，在細胞培養(yǎng)箱內繼續(xù)孵育4 h，隨后每孔加入100 μL Formazan溶解液，適當混勻，在細胞培養(yǎng)箱內再繼續(xù)孵育，直至在普通光學顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Formazan溶解液全部溶解，在570 nm下測定吸光度(OD)值，計算細胞活力。

1.2.3 H2O2對BMECs毒性的影響

細胞分組與處理方法同1.2.1，按照乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒(碧云天生物技術有限公司生產)所述方法，使用酶標儀在490 nm波長下檢測樣品OD值，計算細胞毒性。

1.2.4 H2O2對BMECs凋亡的影響

將BMECs接種于6孔板中，待細胞密度達到80%～90%用PBS洗滌2遍后，按分組分別加入2 mL含有不同濃度(0、400、600、800 μmol/L)H2O2的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)6 h。收集細胞，冷PBS洗滌2次，70%預冷乙醇固定24 h，離心5 min后棄掉上清液，洗滌2次；200 μL緩沖液里加入5 μL AnnexinV-FITC檢測液，室溫黑暗條件下染色20 min，然后在4 ℃黑暗條件下染色15 min，再加入10 μL的碘化丙啶(PI)，用流式細胞儀對細胞的凋亡情況進行檢測。

1.2.5 細胞中ROS含量的檢測

細胞分組與處理方法同1.2.4，收集細胞，根據試劑盒說明書進行操作，將DCFH-DA熒光探針加入到細胞培養(yǎng)液中，在37 ℃黑暗中孵育20 min；用PBS沖洗后，滴加DAPI-抗熒光淬滅封片液，用正置熒光顯微鏡觀察拍照，綠色熒光強度越強，表明ROS含量越高。

1.3 BLfcin-NPs抗氧化能力的評價

1.3.1 BLfcin-NPs對BMECs內線粒體膜電位(MMP)的影響

將BLfcin-NPs溶于完全培養(yǎng)基中配制成濃度為500 μg/mL的BLfcin-NPs溶液[20]。將培養(yǎng)好的BMECs接種于六孔板中，隨機分為4組，分別為對照1組(未經處理、正常培養(yǎng)的BMECs)、對照2組(用2 mL濃度為500 μg/mL的BLfcin-NPs溶液預處理BMECs 12 h)、損傷組(用2 mL濃度為400 μmol/L的H2O2細胞培養(yǎng)液處理BMECs 6 h)、保護組(用2 mL濃度為500 μg/mL的BLfcin-NPs溶液預處理BMECs 12 h后，再使用2 mL濃度為400 μmol/L的H2O2細胞培養(yǎng)液處理BMECs 6 h)，每組3個重復。收集細胞，細胞內線粒體膜電位使用JC-1線粒體膜電位分析試劑盒進行檢測，使用流式細胞儀在530 nm處測量線粒體膜電位。

1.3.2 BLfcin-NPs對BMECs內氧化應激指標的影響

按照1.3.1的步驟將BMECs進行培養(yǎng)、分組和處理。使用細胞刮刀將處理后的細胞從6孔板壁上刮下，按照SOD、GSH-Px、CAT和MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所生產)說明，使用酶標儀分別在550、420、405和532 nm的吸收波長下測定OD值，計算SOD、GSH-Px、CAT活性和MDA含量。

1.3.3 BLfcin-NPs對BMECs內抗氧化和凋亡相關基因mRNA表達的影響

按照1.3.1的步驟將BMECs進行培養(yǎng)、分組和處理。BMECs內總RNA采用Trizol法提取，用Nanodrop分光光度計(DS-11型，北京倍輝科技有限公司)檢測RNA的純度與濃度，OD260/OD280的值在1.8～2.0可用于后續(xù)試驗分析。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GADPH)作為內參基因，采用實時熒光定量PCR儀檢測抗氧化和凋亡相關基因的mRNA相對表達量。測定的基因主要包括Nrf2、HO-1、NQO1、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine aspastic acid-specific protease-3,Caspase-3)，其引物序列見表1。試驗重復測定3次，各目的基因的mRNA相對表達量用2-△△Ct法計算得出。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

試驗結果用平均值±標準誤(mean±SE)表示。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中的one-way ANOVA程序進行單因素方差分析，P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 BMECs氧化損傷模型的構建

2.1.1 H2O2對BMECs活力的影響

采用MTT法檢測了不同濃度H2O2處理不同時間對BMECs活力的影響，結果如圖1所示。0 h時，各濃度H2O2組細胞活力與對照組相比差異均不顯著(P>0.05)；2 h時，除1 000 μmol/L H2O2組細胞活力較對照組顯著下降(P<0.05)外，其他濃度H2O2組細胞活力與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；4 h時，200、800和1 000 μmol/L H2O2組細胞活力較對照組顯著降低(P<0.05)；6 h時，與對照組相比，100和200 μmol/L H2O2顯著降低了細胞活力(P<0.05)，400～1 000 μmol/L H2O2極顯著降低了細胞活力(P<0.01)；與對照組相比，所有濃度H2O2處理8或12 h時均極顯著降低了細胞活力(P<0.01)。綜上所述，用H2O2處理6 h時細胞活力開始出現(xiàn)穩(wěn)定地下降趨勢，H2O2濃度達到400 μmol/L時即開始極顯著下降。

表1 基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes

數據柱標注“*”表示與對照組(0 μmol/L)相比差異顯著(P<0.05)，標注“**”表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖2和圖4同。Compared with the control group (0 μmol/L), data columns with “*” mean significant difference (P<0.05), and with “**” mean extremely significant difference (P<0.01). The same as Fig.2 and Fig.4.圖1 不同濃度H2O2處理不同時間對BMECs活力的影響 Fig.1 Effects of different concentrations of H2O2 treated with different time on viability of BMECs

2.1.2 H2O2對BMECs毒性的影響

如圖2所示，在所有作用時間和濃度下，H2O2對BMECs的細胞毒性呈現(xiàn)作用時間和濃度依賴式的增加。低濃度(0～200 μmol/L)的H2O2對細胞毒性作用較小，未達到10%，高濃度(1 000 μmol/L)的H2O2對細胞毒性作用較大。為防止對細胞造成不可逆轉的損傷，綜合MTT試驗結果，后續(xù)試驗選擇400～800 μmol/L的H2O2處理BMECs 6 h。

2.1.3 H2O2對BMECs中ROS含量的影響

為了檢測H2O2對BMECs造成氧化損傷后細胞內ROS含量的變化，利用DCFH-DA探針將細胞內ROS染色并用正置熒光顯微鏡觀察，結果如圖3所示。與0 μmol/L H2O2處理的對照組相比，用400～800 μmol/L H2O2處理BMECs后的綠色熒光強度增強，表明ROS含量增加，且呈劑量依賴性。

圖2 不同濃度H2O2處理不同時間對BMECs細胞毒性的影響Fig.2 Effect of different concentrations of H2O2treated with different time on cytotoxicity of BMECs

圖3 不同濃度H2O2對BMECs中ROS含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of H2O2 on ROS content in BMECs

2.1.4 H2O2對BMECs凋亡的影響

如圖4所示，與對照組相比，400～800 μmol/L H2O2處理均造成細胞凋亡。早期凋亡率，400 μmol/L H2O2組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，600和800 μmol/L H2O2組與對照組相比均差異極顯著(P<0.01)；晚期凋亡率，400～800 μmol/L H2O2組與對照組相比均差異極顯著(P<0.01)。因此，后續(xù)試驗選擇400 μmol/L的H2O2處理BMECs 6 h構建BMECs氧化損傷模型。

2.2 BLfcin-NPs抗氧化能力的評價

2.2.1 BLfcin-NPs對BMECs內線粒體膜電位的影響

如圖5所示，對照2組與對照1組相比線粒體膜電位下降比例無顯著變化(P>0.05)，但損傷組與對照1組相比線粒體膜電位下降比例顯著升高(P<0.05)；保護組的線粒體膜電位下降比例與損傷組相比顯著降低(P<0.05)。上述結果說明BLfcin-NPs可通過降低線粒體膜電位來發(fā)揮對BMECs的保護作用。

2.2.2 BLfcin-NPs對BMECs內氧化應激指標的影響

如圖6所示，對照1組和對照2組CAT、GSH-Px和SOD活性顯著高于損傷組(P<0.05)，而MDA含量顯著低于損傷組(P<0.05)；保護組CAT、GSH-Px和SOD活性較損傷組顯著升高(P<0.05)，而保護組MDA含量與損傷組相比顯著降低(P<0.05)。圖6-A顯示保護組CAT活性與對照1組和對照2組相比無顯著變化(P>0.05)；圖6-B顯示保護組SOD活性顯著低于對照1組和對照2組(P<0.05)；圖6-C顯示對照1組與對照2組GSH-Px活性無顯著差異(P>0.05)，但對照2組GSH-Px活性顯著高于保護組(P<0.05)；圖6-D顯示保護組MDA含量顯著高于對照1組和對照2組(P<0.05)。

A：流式細胞儀檢測Annexin V/PI雙染結果；B：BMECs凋亡率。A: the results of Annexin V/PI double staining by flow cytometry; B: the apoptosis rate of BMECs.圖4 不同濃度H2O2對BMECs凋亡的影響Fig.4 Effects of different concentrations of H2O2 on apoptosis of BMECs

2.2.3 BLfcin-NPs對BMECs內抗氧化相關基因mRNA表達的影響

如圖7所示，與對照1組相比，對照2組Nrf2的mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)，但HO-1的mRNA相對表達量顯著下降(P<0.05)，NQO1的mRNA相對表達量無顯著變化(P>0.05)；損傷組Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA相對表達量較對照1組和對照2組均顯著降低(P<0.05)；保護組的Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA相對表達量與損傷組相比均顯著升高(P<0.05)。

2.2.4 BLfcin-NPs對BMECs內凋亡相關基因mRNA表達的影響

如圖8所示，對照1組與對照2組相比，損傷組Bcl2的mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，而保護組Bcl2的mRNA相對表達量則較損傷組顯著升高(P<0.05)；損傷組Bax的mRNA相對表達量較對照1組與對照2組顯著升高(P<0.05)，保護組Bax的mRNA相對表達量則較損傷組顯著降低(P<0.05)；損傷組Caspase-3的mRNA相對表達量較對照1組與對照2組顯著升高(P<0.05)，保護組Caspase-3的mRNA相對表達量較損傷組顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

代謝需求的增加使BMECs易發(fā)生氧化應激，進而導致乳腺損傷，這是導致牛奶產量和質量下降的主要原因。在BMECs發(fā)生氧化應激時，細胞內產生過量的ROS和MDA，超過閾值的MDA可以導致蛋白質錯誤折疊并加劇氧化應激反應的嚴重程度[21]，甚至引起B(yǎng)MEC凋亡[3]。因此，抑制ROS、MDA和其他致病因子的產生是預防奶牛乳腺發(fā)生氧化應激的有效措施。SOD、CAT和GSH-Px是重要的抗氧化防御酶，可抵御細胞內由于應激造成的ROS含量升高。SOD是最重要的抗氧化酶，因為其通過將超氧陰離子自由基催化為氧和H2O2來減弱ROS的作用，之后CAT和GSH-Px將H2O2轉化為氧和水[22]?？寡趸富钚缘南抡{導致氧化還原失衡，加劇氧化應激損傷。本研究結果發(fā)現(xiàn)，添加BLfcin-NPs可有效抑制BMECs內MDA的產生，并提高氧化損傷后SOD、CAT和GSH-Px的活性。由此可知，BLfcin-NPs可通過提高BMECs內抗氧化酶的活性來降低氧化損傷程度。

H2O2：過氧化氫 hydrogen peroxide；BLfcin-NPs：載牛乳鐵蛋白肽-殼聚糖納米粒 bovine lactoferrin chitosan nanoparticles；+：添加 added；-：不添加non-added。下圖同 the same as below。數據柱標注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Data columns with the same letter mean no significant difference (P>0.05), while with different letter mean significant difference (P<0.05). The same as below.圖5 BLfcin-NPs對BMECs內線粒體膜電位的影響Fig.5 Effects of BLfcin-NPs on mitochondrial membrane potential in BMECs

圖6 BLfcin-NPs對BMECs內氧化應激指標的影響Fig.6 Effects of BLfcin-NPs on oxidative stress indexes in BMECs

圖7 BLfcin-NPs對BMECs內抗氧化相關基因mRNA表達的影響Fig.7 Effects of BLfcin-NPs on mRNA expression of antioxidant-related genes in BMECs

圖8 BLfcin-NPs對BMECs內凋亡相關基因mRNA表達的影響Fig.8 Effects of BLfcin-NPs on mRNA expression of apoptosis-related genes in BMECs

線粒體是細胞內產生ROS的主要細胞器同時ROS會直接影響其功能，過量的ROS會對線粒體蛋白質和結構造成氧化損傷，從而導致線粒體功能障礙[23-24]。線粒體裂變和融合的不平衡與線粒體功能障礙的若干生理指標有關，包括減少線粒體膜電位、呼吸、氧化磷酸化和ROS的生成[25]。因為過量ROS的產生會破壞呼吸鏈以致于增加線粒體的通透性，從而導致線粒體膜電位的下降[26-27]。本試驗利用H2O2處理BMECs發(fā)生氧化損傷時，線粒體膜電位顯著降低，但用BLfcin-NPs進行預處理的BMECs損傷后線粒體膜電位升高。細胞凋亡也會致使線粒體膜電位降低[28]。線粒體損傷過程中有大量的ROS和細胞色素C釋放，這會加劇凋亡過程的發(fā)生[29]，因此，有效預防或緩解線粒體損傷是預防細胞凋亡的主要方法。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax是一種重要的促凋亡蛋白，這些蛋白在線粒體膜的表面定位，它們的比例被認為是線粒體滲透損傷的重要指標，反映細胞的凋亡狀態(tài)[30]。Bcl-2拮抗Bax保持線粒體膜滲透性，Bcl-2有效地防止細胞色素C的釋放，活化Caspase-3，抑制細胞凋亡[31-32]。本試驗檢測了BLfcin-NPs對Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達的影響，結果表明，BLfcin-NPs可通過提高BMECs中Bcl-2 mRNA的表達并抑制Bax和Caspase-3 mRNA的表達，來減輕線粒體損傷，維持線粒體通透性，防止氧化損傷時細胞凋亡的發(fā)生。

Nrf2是體內調節(jié)抗氧化基因表達的重要轉錄調節(jié)因子[33]。Nrf2在細胞質內與Keap1偶聯(lián)，這種情況下Nrf2沒有抗氧化活性，當Nrf2受到應激源刺激被激活后與Keap1解離發(fā)生核移位，進入細胞核內與ARE反應原件相結合，促進其下游基因的表達[34-35]。因此，激活Nrf2-ARE信號通路中的Nrf2是防止機體產生各種應激和引發(fā)疾病的重要方法。HO-1是Nrf2下游的主要抗氧化蛋白，可有效發(fā)揮抗氧化性能。此外，Nrf2的活化也抑制了致病因子ROS和MDA的產生。ROS導致Nrf2的積累并促進其核轉位啟動了參與抗氧化基因的轉錄，BLfcin-NPs顯著提高H2O2誘導產生氧化損傷的BMECs中Nrf2信號通路關鍵調控基因Nrf2、HO-1和NQO-1的mRNA表達，通過激活Nrf2-ARE信號通路抑制ROS生成，提高抗氧化酶活性，從而抑制H2O2誘導的BMECs氧化損傷。

4 結 論

BLfcin-NPs緩解了H2O2誘導的BMECs氧化損傷，增強了細胞中抗氧化酶的活性和抗氧化相關基因的表達，提高了線粒體活性并減少了細胞的凋亡。