陳 逸 張一涵 張 靜 屠 焰 王 慧* 蔣林樹*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，奶牛營(yíng)養(yǎng)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081)

動(dòng)物從健康狀態(tài)發(fā)展到疾病狀態(tài)是一個(gè)由量變到質(zhì)變的動(dòng)態(tài)過程，在生產(chǎn)過程中，受到飼糧、管理、環(huán)境等因素的影響，容易導(dǎo)致動(dòng)物體內(nèi)自由基穩(wěn)態(tài)失衡，引起機(jī)體氧化應(yīng)激，受其主導(dǎo)的氧化應(yīng)激-免疫應(yīng)激-炎癥反應(yīng)三方聯(lián)動(dòng)效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物轉(zhuǎn)變?yōu)閬喗】祽B(tài)[1]，使奶牛機(jī)體對(duì)疾病的易感性增加，干預(yù)不當(dāng)則易患乳腺炎等炎癥[2]。炎癥過程常又會(huì)伴隨氧化應(yīng)激的發(fā)生，通過氧化加劇炎癥反應(yīng)，而炎癥介質(zhì)又反過來加重氧化應(yīng)激，形成惡性聯(lián)動(dòng)循環(huán)[1]，進(jìn)一步影響機(jī)體免疫功能，引起機(jī)體損傷，嚴(yán)重影響機(jī)體健康和泌乳性能[3]。

奶牛健康是奶業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)。生產(chǎn)中，乳腺上皮細(xì)胞是有害物質(zhì)侵入乳腺時(shí)的第1道防線，受到泌乳期間高強(qiáng)度的代謝需求的影響，機(jī)體氧化狀態(tài)增強(qiáng)，奶牛乳腺上皮細(xì)胞通透性增加，便于大分子和病原體的通過，引起炎癥反應(yīng)和疾病，最終導(dǎo)致奶牛免疫功能下降，引發(fā)乳房炎[3-4]，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為緩解氧化應(yīng)激對(duì)奶牛乳腺健康的影響，研究緩解奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷的方法成為亟待解決的問題之一。

大豆是世界上最重要的豆類作物，來源廣泛，其富含的大豆蛋白是優(yōu)質(zhì)植物性蛋白的主要來源之一[5]。大豆蛋白酶解得到的大豆活性肽(SBP)具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗炎等作用[6-7]，其作用效果已在豬[8]、雞[9]及魚類[10]的生產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)踐中得以證實(shí)，但SBP在反芻動(dòng)物上的研究尚不充分。因此，本研究在建立奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的基礎(chǔ)上，采用SBP對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，探究SBP對(duì)過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥損傷的保護(hù)作用，為SBP作為天然性抗氧化物質(zhì)在奶牛養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

奶牛乳腺上皮細(xì)胞MAC-T由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。SBP由本實(shí)驗(yàn)室按照Agyei等[11]提出的方法制備并保存，SBP含量≥90%。30% H2O2購(gòu)自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)及青-鏈霉素溶液均購(gòu)自Gibco公司，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。CCK-8細(xì)胞增殖-細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海東仁化學(xué)科技有限公司。丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。SteadyPure通用型RNA提取試劑盒購(gòu)自湖南艾科瑞生物科技公司。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ購(gòu)自日本TaKaRa公司?；钚匝?ROS)檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司?；蛞镉杀本┣婵粕锟萍加邢薰竞铣?，純度方式為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)基及溶液的配制

細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制：將DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基以1∶1的比例混合均勻，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)胞DMEM/F12完全培養(yǎng)基配制：將DMEM培養(yǎng)基、F12培養(yǎng)基、FBS、青-鏈霉素溶液以89∶189∶120∶12的比例混合均勻，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

不同濃度H2O2溶液的配制：30% H2O2濃度約為9 mol/L。將30% H2O2與高壓滅菌超純水以1∶18比例混合，即得到濃度為1 mol/L的H2O2儲(chǔ)備液。隨后將1 mol/L的H2O2儲(chǔ)備液用細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋為0、300、600、900、1 200 μmol/L，作為不同濃度的H2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)基使用。

SBP溶液的配制：將SBP以高壓滅菌超純水溶解成10 mg/mL SBP母液，0.22 μm濾膜過濾。10 mg/mL SBP母液用細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至0、0.15、0.30、0.60、1.20、2.40和4.8 mg/mL，作為工作溶液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇與傳代

將MAC-T細(xì)胞從液氮罐中取出，迅速置于提前預(yù)熱的37 ℃水浴鍋中，輕搖使其在1 min內(nèi)解凍，轉(zhuǎn)移至加有6 mL DMEM/F12完全培養(yǎng)基的離心管中，3 000 r/min離心4 min后，棄上清。細(xì)胞沉淀以1 mL完全培養(yǎng)基重懸后轉(zhuǎn)移至含有8 mL DMEM/F12完全培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)皿中，混勻。培養(yǎng)皿置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中復(fù)蘇培養(yǎng)，24 h時(shí)換液，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度≥80%時(shí)，棄去皿中培養(yǎng)基，以4 ℃預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA 2 mL，37 ℃孵育2～3 min以消化細(xì)胞。孵育結(jié)束后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，待大部分細(xì)胞完全消化后加入4 mL DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，3 000 r/min離心4 min，棄上清。細(xì)胞沉淀以適量DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸混勻后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞濃度轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3.2 MAC-T細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立

MAC-T細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立參照金鹿等[12]的方法進(jìn)行。取傳代至3～5代、生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至匯合度≥80%，棄去完全培養(yǎng)基，于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)12～16 h。饑餓培養(yǎng)后的細(xì)胞以PBS清洗2次，加入不同濃度[0(對(duì)照)、300、600、900、1 200 μmol/L]的H2O2誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別處理12和24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ROS水平，MDA、T-SOD、GSH-Px、CAT、T-AOC試劑盒檢測(cè)相應(yīng)抗氧化指標(biāo)。每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.3 SBP適宜作用濃度和作用時(shí)間篩選

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MAC-T細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞匯合度≥80%時(shí)，棄去完全培養(yǎng)基，以PBS清洗細(xì)胞2次，加入以細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至SBP濃度為0(對(duì)照)、0.15、0.30、0.60、1.20、2.40和4.80 mg/mL，分別處理6和12 h。CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率，計(jì)算后確定SBP適宜作用濃度和作用時(shí)間。每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.4 SBP預(yù)處理對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用試驗(yàn)分組

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MAC-T細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、H2O2模型組、SBP處理組。其中對(duì)照組用細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h后，換新鮮的細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h；H2O2模型組先用細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h，再用含有600 μmol/L H2O2的誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理12 h；SBP處理組是先用含0.15、0.30、0.60 mg/mL SBP的細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞6 h后，再用含有600 μmol/L H2O2的誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理12 h。每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔，重復(fù)測(cè)定3次。

1.3.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將細(xì)胞從CO2恒溫培養(yǎng)箱中取出后，棄細(xì)胞處理液，用PBS沖洗2次，加入100 μL檢測(cè)液(90 μL細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10 μL CCK-8)，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD450)。設(shè)定對(duì)照組細(xì)胞存活率為100%，并按照公式計(jì)算各試驗(yàn)組細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)=(各試驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100。

1.3.6 細(xì)胞內(nèi)ROS水平測(cè)定

細(xì)胞內(nèi)ROS水平采用ROS檢測(cè)試劑盒測(cè)定。按照試劑盒說明書，在細(xì)胞中加入10 μmol/L 2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)稀釋液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 min后，用細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗細(xì)胞并將其重新懸浮在PBS中，用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞中熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，用以反映ROS水平。

1.3.7 細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)測(cè)定

取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞后，迅速用細(xì)胞完全培養(yǎng)基終止消化，2 000 r/min離心5 min，用血球計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×106個(gè)/mL，將調(diào)整好密度的細(xì)胞以1 mL/孔接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度≥80%時(shí)，棄去細(xì)胞完全培養(yǎng)基，PBS清洗2次后，對(duì)細(xì)胞按照各組不同處理?xiàng)l件進(jìn)行處理。進(jìn)行不同處理后的細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，以預(yù)冷PBS沖洗細(xì)胞2次后，再加入1 mL預(yù)冷PBS收集用細(xì)胞刮刮取的細(xì)胞，將收集的細(xì)胞吸入1.5 mL離心管中，以1 000 r/min離心10 min，棄掉PBS，加入含終濃度為1 mmol/L PMSF的裂解液0.2 mL，輕柔吹打使細(xì)胞充分裂解，14 000 r/min離心5 min，取上清液依據(jù)試劑盒說明書對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、CAT、T-SOD活性及T-AOC和MDA含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.8 細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)

收集6孔板中的細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒說明書提取RNA，并用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，采用熒光定量PCR法檢測(cè)炎癥相關(guān)基因誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)及白細(xì)胞介素-8(IL-8)的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

熒光定量PCR采用2步法，反應(yīng)條件為：95 ℃延伸5 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)?；虻囊镄蛄幸姳?，由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2013初步整理后，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立

2.1.1 H2O2對(duì)MAC-T細(xì)胞存活率的影響

不同濃度(300、600、900、1 200 μmol/L)的H2O2在體外作用于MAC-T細(xì)胞12和24 h后，對(duì)細(xì)胞存活率的影響結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，300 μmol/L H2O2刺激細(xì)胞12 h對(duì)細(xì)胞存活率無顯著影響(P>0.05)，刺激24 h后細(xì)胞存活率仍在對(duì)照組的96%以上；600、900、1 200 μmol/L H2O2分別刺激MAC-T細(xì)胞12和24h后均極顯著降低了細(xì)胞存活率(P<0.01)，600、900、1 200 μmol/L H2O2刺激細(xì)胞12 h后其細(xì)胞存活率分別為對(duì)照組的80.0%、78.3%、74.9%，刺激細(xì)胞24 h后其細(xì)胞存活率分別為對(duì)照組的60.9%、54.9%和45.9%。由以上結(jié)果可知，H2O2對(duì)MAC-T細(xì)胞存活率呈劑量和時(shí)間依賴性抑制。

表1 基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“*”表示與對(duì)照組(0 μmol/L H2O2)相比差異顯著(P<0.05)，數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“**”表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。圖2至圖4同。Compared with the control group (0 μmol/L H2O2), data columns with “*” represented significant difference (P<0.05), and with “**” represented extremely significant difference (P<0.01). The same as Fig.2 to Fig.4.圖1 H2O2對(duì)MAC-T細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effects of H2O2 on viability of MAC-T cells

2.1.2 H2O2對(duì)MAC-T細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

高濃度H2O2對(duì)細(xì)胞存活率的抑制作用表明細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)會(huì)在一定程度上誘發(fā)細(xì)胞損傷，因此，本研究對(duì)體外條件下不同濃度H2O2處理下細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度(300、600、900、1 200 μmol/L)的H2O2分別刺激細(xì)胞12和24 h均極顯著提高了細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P<0.01)，且600 μmol/L H2O2組細(xì)胞內(nèi)ROS水平約為對(duì)照組的3倍。結(jié)合H2O2對(duì)細(xì)胞存活率的影響，以600 μmol/L H2O2作為建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的作用濃度。

圖2 H2O2對(duì)MAC-T細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.2 Effects of H2O2 on ROS level in MAC-T cells

2.1.3 H2O2對(duì)MAC-T細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響

以600 μmol/L H2O2對(duì)MAC-T細(xì)胞分別體外處理12和24 h，細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的變化結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，600 μmol/L H2O2刺激細(xì)胞12和24 h均可極顯著降低細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、CAT、T-SOD活性(P<0.01)，極顯著提高細(xì)胞內(nèi)MDA含量(P<0.01)，且刺激12 h比刺激24 h作用效果明顯；但T-AOC只在600 μmol/L H2O2刺激細(xì)胞12 h時(shí)極顯著降低(P<0.01)，而在H2O2刺激細(xì)胞24 h時(shí)無顯著變化(P>0.05)。綜合以上結(jié)果，后續(xù)選擇600 μmol/L H2O2刺激MAC-T細(xì)胞12 h作為細(xì)胞體外條件下產(chǎn)生氧化應(yīng)激的條件。

圖3 H2O2對(duì)MAC-T細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of H2O2 on antioxidant indexes in MAC-T cells

2.2 SBP對(duì)MAC-T細(xì)胞存活率的影響

為確定SBP在體外作用于MAC-T細(xì)胞的安全劑量和適宜作用時(shí)間，以不同濃度SBP分別作用MAC-T細(xì)胞6和12 h，CCK-8試劑盒檢測(cè)SBP對(duì)MAC-T細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，以濃度為0.15和0.30 mg/mL的SBP處理6 h可極顯著提高細(xì)胞存活率(P<0.01)；而當(dāng)處理12 h時(shí)，0.15 mg/mL的SBP對(duì)細(xì)胞存活率無顯著影響(P>0.05)，0.30 mg/mL的SBP雖對(duì)細(xì)胞存活率有顯著影響(P<0.05)，但仍為對(duì)照組的96.0%。將SBP濃度升高至0.60 mg/mL處理細(xì)胞6 h時(shí)，對(duì)細(xì)胞存活率無顯著影響(P>0.05)，但處理12 h時(shí)，細(xì)胞存活率下降為對(duì)照組的92.1%，極顯著降低了細(xì)胞存活率(P<0.01)。以濃度為1.20、2.40和4.80 mg/mL的SBP處理6 h，雖與對(duì)照組相比細(xì)胞存活率極顯著降低(P<0.01)，但仍為對(duì)照組的90%以上，而當(dāng)以同濃度的SBP處理12 h時(shí)，細(xì)胞存活率僅分別為對(duì)照組的77.0%、60.1%和48.0%，極顯著降低了細(xì)胞存活率(P<0.01)。綜合以上結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)選擇以濃度為0.15、0.30和0.60 mg/mL的SBP在體外對(duì)MAC-T細(xì)胞處理6 h進(jìn)行預(yù)保護(hù)。

圖4 SBP對(duì)MAC-T細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of SBP on viability of MAC-T cells

2.3 SBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞氧化損傷的緩解作用

2.3.1 SBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

不同濃度SBP在體外對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響如圖5所示。結(jié)果顯示，與H2O2模型組相比，0.15、0.30和0.60 mg/mL SBP對(duì)細(xì)胞預(yù)處理后均極顯著降低了細(xì)胞內(nèi)ROS水平(P<0.01)，且SBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷的緩解作用呈劑量依賴性。以上結(jié)果表明，SBP在體外對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，可一定程度上逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷。

2.3.2 SBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響

不同濃度SBP在體外對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響如圖6所示。結(jié)果顯示，與H2O2模型組相比，0.15、0.30和0.60 mg/mL SBP對(duì)細(xì)胞預(yù)處理后極顯著提高了氧化損傷細(xì)胞內(nèi)GSH-Px、CAT、T-SOD活性(P<0.01)，顯著或極顯著提高了T-AOC(P<0.05或P<0.01)，極顯著降低了MDA含量(P<0.01)。以上結(jié)果表明，SBP在體外可提高細(xì)胞抗氧化酶活性，緩解H2O2誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞氧化應(yīng)激。

2.3.3 SBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響

為驗(yàn)證細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)是否會(huì)同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥的發(fā)生，本研究對(duì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)和炎癥因子的mRNA相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，如圖7所示。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H2O2模型組細(xì)胞內(nèi)炎癥介質(zhì)(COX-2、iNOS、MCP-1)和促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平均極顯著提高(P<0.01)。與H2O2模型組相比，0.15、0.30和0.60 mg/mL SBP對(duì)細(xì)胞預(yù)處理后均極顯著降低了細(xì)胞內(nèi)炎癥介質(zhì)(COX-2、iNOS、MCP-1)和促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β)mRNA的相對(duì)表達(dá)水平(P<0.01)。以上結(jié)果表明，在體外，H2O2誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞氧化應(yīng)激可通過提高炎癥介質(zhì)和炎癥因子的表達(dá)水平，引發(fā)炎癥反應(yīng)；而SBP預(yù)處理則可通過降低炎癥介質(zhì)和炎癥因子的表達(dá)水平，緩解由氧化應(yīng)激誘發(fā)的細(xì)胞炎癥損傷。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“*”表示與對(duì)照組(0 μmol/L H2O2+0 mg/mL SBP)相比差異顯著(P<0.05)，數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“**”表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“#”表示與H2O2模型組(600 μmol/L H2O2+0 mg/mL SBP)相比差異顯著(P<0.05)，數(shù)據(jù)柱標(biāo)注“##”表示與H2O2模型組相比差異極顯著(P<0.01)。圖6和圖7同。Compared with the control group (0 μmol/L H2O2+0 mg/mL SBP), data columns with “*” represented significant difference (P<0.05), and with “**” represented extremely significant difference (P<0.01). Compared with the H2O2 model group (600 μmol/L H2O2+0 mg/mL SBP), data columns with “#” represented significant difference (P<0.05), and with “##” represented extremely significant difference (P<0.01). The same as Fig.6 and Fig.7.圖5 SBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.5 Effects of SBP on ROS level in MAC-T cells induced by H2O2

3 討 論

正常生理情況下，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生、清除、利用等活動(dòng)能在嚴(yán)格地調(diào)控下維持動(dòng)態(tài)平衡，一旦平衡被打破，就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，影響到基因的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)、器官的功能以及細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和壞死等許多生理和病理過程，導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展[1,13]。研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)內(nèi)源的抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px等組成的酶類抗氧化系統(tǒng)是機(jī)體內(nèi)的初級(jí)抗氧化防御系統(tǒng)，可將氧自由基代謝為水，減少H2O2、脂質(zhì)和磷脂氫過氧化物侵害，抵抗ROS積累產(chǎn)生的有害影響[14-15]。MDA是脂質(zhì)過氧化物代謝產(chǎn)物，其含量反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映細(xì)胞的損傷程度，T-AOC則可反映清除自由基的能力，該類酶抗氧化劑對(duì)于炎癥性疾病期間防御氧化性細(xì)胞損傷至關(guān)重要[16]。

H2O2作為一種重要的ROS，極易透過細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)鐵離子通過芬頓(Fenton)反應(yīng)形成高活性的自由基，導(dǎo)致一系列反應(yīng)，因其易于獲得且性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，已成為研究細(xì)胞氧化損傷的重要工具[12,17]，本研究中也利用H2O2成功構(gòu)建了MAC-T細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。

SBP具有較強(qiáng)的抗氧化活性[10,18]。Yi等[19]研究表明，SBP可抑制H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞ROS的生成及谷胱甘肽(GSH)含量的減少，并能提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性。曾松榮等[18]研究顯示，大豆肽可顯著提高小鼠血清溶菌酶活性和抗菌活力，顯著提高CAT活性，降低MDA含量。本研究中，0.15、0.30和0.60 mg/mL SBP極顯著降低了MAC-T細(xì)胞內(nèi)ROS水平，極顯著提高了GSH-Px、CAT、T-SOD活性和T-AOC，極顯著降低了MDA含量，說明適宜濃度的SBP能有效緩解H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化能力，與前人文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

乳腺上皮細(xì)胞除了具有泌乳功能以外，也能表達(dá)多種模式識(shí)別受體，從而誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)的釋放[20-21]。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)可分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子[22-23]，還可提高氧化損傷細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)水平[23-24]，TNF-α與IL-1β協(xié)同作用，進(jìn)而刺激二級(jí)細(xì)胞因子IL-6的分泌和表達(dá)[23,25]，IL-8是趨化因子，可趨化多形核白細(xì)胞(PMN)向炎癥部位游出，參與局部的免疫反應(yīng)，與細(xì)胞應(yīng)激之間存在正相關(guān)[26]。研究表明，炎癥因子的產(chǎn)生可直接造成細(xì)胞損傷，IL-1β、TNF-α水平的提高可引起奶牛乳腺上皮細(xì)胞間緊密連接通透性增高，抑制上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白之一閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)的產(chǎn)生[23,27]。

4 結(jié) 論

在H2O2誘導(dǎo)體外MAC-T細(xì)胞氧化應(yīng)激模型基礎(chǔ)上，SBP可降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平，提高GSH-Px、CAT、T-SOD活性和T-AOC，降低MDA含量，抑制炎癥相關(guān)基因iNOS、COX-2、MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-8及IL-1β的表達(dá)，從而緩解H2O2誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥損傷。

圖7 SBP對(duì)H2O2誘導(dǎo)的MAC-T細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of SBP on expression of genes related to inflammation in MAC-T cells induced by H2O2