白銀龍 牛一兵* 張海華 鞏文洋 曲毅程 龍 娟 王夕國(guó) 鞏元芳 趙惠媛 李素芬** 馮敏山,3**

(1.河北科技師范學(xué)院，秦皇島 066004；2.秦皇島市三晶新農(nóng)飼料有限公司，昌黎 066600；3.河北省碣石皮毛產(chǎn)業(yè)研究院，昌黎 066600)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是人和動(dòng)物腸道中的共生乳酸菌，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酸和抑菌能力[1]，作為抗生素替代品在畜禽養(yǎng)殖中具有廣泛的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌可以提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，維持腸道菌群平衡，且以5×108～1×1010CFU/kg添加水平效果較好[2-4]。糞腸球菌對(duì)育成期藍(lán)狐[5]和生長(zhǎng)期水貂[6]也能起到提高生長(zhǎng)性能和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率以及減少氮排放的作用，且以1×108CFU/kg添加水平效果較理想。益生菌通常被認(rèn)為是通過調(diào)節(jié)腸道菌群促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和健康，但益生菌對(duì)動(dòng)物的使用效果不僅與菌株和添加水平有關(guān)，還受到動(dòng)物本身固有的腸道菌群組成的影響[7]。烏蘇里貉屬雜食性毛皮動(dòng)物，研究發(fā)現(xiàn)采食相同飼糧的烏蘇里貉與藍(lán)狐糞便菌群組成和相對(duì)豐度有顯著差異[8]。但是，至今尚未見到糞腸球菌對(duì)烏蘇里貉生長(zhǎng)性能及腸道菌群影響的研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧添加不同水平糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉生長(zhǎng)性能、氮代謝、血清生化指標(biāo)及糞便菌群的影響，以確定其適量添加水平，并探討糞腸球菌與腸道菌群和貉健康的關(guān)系，為其在貉養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)糞腸球菌

試驗(yàn)用糞腸球菌購(gòu)自山東某生物工程股份有限公司，其有效活菌數(shù)量≥1×1010CFU/g。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和飼糧

試驗(yàn)動(dòng)物為健康、體重[(2.44±0.24) kg]相近的70日齡烏蘇里貉公貉。由于目前我國(guó)沒有統(tǒng)一的烏蘇里貉飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，因此參照本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果[9]配制粗蛋白質(zhì)水平為22%的生長(zhǎng)期貉基礎(chǔ)飼糧，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (as fed-basis) %

續(xù)表1項(xiàng)目Items含量Content賴氨酸Lys1.58蛋氨酸Met0.61蘇氨酸Thr0.85鈣Ca0.97總磷TP0.78

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，糞腸球菌添加水平分別為0(對(duì)照組)、1×108(Ⅰ組)、1×109(Ⅱ組)和1×1010CFU/kg(Ⅲ組)。

將40只公貉隨機(jī)分為4個(gè)組，每組10只，單籠飼養(yǎng)，每籠為1個(gè)重復(fù)。對(duì)照組飼喂不添加糞腸球菌的基礎(chǔ)飼糧，其他3組分別飼喂按上述試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加糞腸球菌的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)預(yù)試期7 d，正試期70 d。試驗(yàn)在河北科技師范學(xué)院動(dòng)物養(yǎng)殖試驗(yàn)場(chǎng)進(jìn)行。

試驗(yàn)期間，以貉自由采食為原則，每天按只稱料，以料∶水為1∶3加水?dāng)嚢杈鶆蚝螅刻?8：00、15：00飼喂2次，自由飲水，采用自然光照。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱重，計(jì)算平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.2.2 樣品采集和制備

基礎(chǔ)飼糧配制現(xiàn)場(chǎng)采樣，放入自封袋中備測(cè)。于112日齡采用全收糞法進(jìn)行消化代謝試驗(yàn)。每天在尿桶中加入20 mL 10%鹽酸固氮，用量筒量取尿液體積，按1/20收集3 d的尿液，-20 ℃凍存。每天收集的糞便按鮮重的10%加入10%鹽酸溶液進(jìn)行固氮，80 ℃下殺菌2 h，再在65 ℃烘干至恒重，制備風(fēng)干樣品。

在消化代謝試驗(yàn)結(jié)束后次日晨飼前2 h采集新鮮糞便。參照陳雙雙[10]報(bào)道的收糞方法，待貉排出糞便后立即用無菌分裝袋收集，防止落地被污染。將2只貉的糞便混合后作為1個(gè)樣品，放入3 mL滅菌管中，液氮速凍，-80 ℃凍存，以備進(jìn)行菌群分析。為探討糞腸球菌是否通過調(diào)節(jié)腸道菌群促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和健康，綜合各組生長(zhǎng)性能、氮代謝和血清生化指標(biāo)，選擇上述指標(biāo)表現(xiàn)最好的Ⅰ組和對(duì)照組貉糞樣送檢。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，后肢靜脈采血5 mL，4 000 r/min離心10 min制備血清，-20 ℃保存，以備分析血清生化指標(biāo)。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定及分析

飼糧、糞樣和尿樣中粗蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照GB/T 6432—2018凱氏定氮法。

采用日立7600全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(UN)、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量，試劑購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

糞便總DNA的提取、16s rDNA V3～V4區(qū)擴(kuò)增、測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建及Illumina NovaSeq平臺(tái)高通量測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成。利用Illumina NovaSeq 6000系統(tǒng)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行alpha多樣性和菌群分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SAS 6.12軟件中的ANOVA過程對(duì)所有生長(zhǎng)性能、氮代謝和血清生化指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，方差分析差異顯著者，以LSD法比較平均值間的差異顯著性。采用t檢驗(yàn)比較對(duì)照組和Ⅰ組之間糞便菌群結(jié)構(gòu)的差異顯著性。以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，Ⅰ組和Ⅱ組生長(zhǎng)期烏蘇里貉平均日增重顯著高于對(duì)照組和Ⅲ組(P<0.05)，且Ⅰ組顯著高于Ⅱ組(P<0.05)；Ⅰ組和Ⅱ組料重比顯著低于對(duì)照組和Ⅲ組(P<0.05)；Ⅲ組上述2項(xiàng)指標(biāo)與對(duì)照組相比無顯著差異(P>0.05)。飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉平均日采食量無顯著影響(P>0.05)。

表2 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of dietary Enterococcus faecalis on growth performance of growing Ussuri raccoon dogs

2.2 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉氮代謝的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，3個(gè)糞腸球菌添加組氮沉積量顯著提高(P<0.05)，但3個(gè)糞腸球菌添加組之間無顯著差異(P>0.05)；Ⅰ組和Ⅱ組蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值顯著提高(P<0.05)，Ⅲ組無顯著差異(P>0.05)。飼糧添加糞腸球菌對(duì)粗蛋白質(zhì)消化率和凈蛋白質(zhì)利用率無顯著影響(P>0.05)。

2.3 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，Ⅰ組和Ⅱ組生長(zhǎng)期烏蘇里貉血清ALB含量顯著提高(P<0.05)，Ⅲ組無顯著差異(P>0.05)；3個(gè)糞腸球菌添加組血清UN含量均顯著提高(P<0.05)。飼糧添加糞腸球菌對(duì)其他血清生化指標(biāo)無顯著影響(P>0.05)。

2.4 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉糞便菌群的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，Ⅰ組生長(zhǎng)期烏蘇里貉糞便菌群ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著提高(P<0.05)，香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。由表6可知，生長(zhǎng)期烏蘇里貉糞便菌群相對(duì)豐度在1%以上的門為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門；與對(duì)照組相比，Ⅰ組擬桿菌門相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)，其他3個(gè)門相對(duì)豐度無顯著差異(P>0.05)。由表7可知，生長(zhǎng)期烏蘇里貉糞便菌群屬水平的優(yōu)勢(shì)菌群為普雷沃氏菌屬、糞桿菌屬、光岡菌屬、Catenisphaera和小桿菌屬等；與對(duì)照組相比，Ⅰ組巨球型菌屬相對(duì)豐度顯著提高(P<0.05)，小桿菌屬、Catenisphaera和光岡菌屬相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。

表3 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉氮代謝的影響Table 3 Effects of dietary Enterococcus faecalis on nitrogen metabolism of growing Ussuri raccoon dogs

表4 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉血清生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of dietary Enterococcus faecalis on serum biochemical indices of growing Ussuri raccoon dogs

表5 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉糞便菌群物種多樣性的影響Table 5 Effects of dietary Enterococcus faecalis on species diversity of fecal microbiota of growing Ussuri raccoon dogs

表6 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉糞便優(yōu)勢(shì)菌群門水平相對(duì)豐度的影響Table 6 Effects of dietary Enterococcus faecalis on relative abundance of fecal dominant microbiota at phylum level of growing Ussuri raccoon dogs %

表7 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉糞便優(yōu)勢(shì)菌群屬水平相對(duì)豐度的影響Table 7 Effects of dietary Enterococcus faecalis on relative abundance of fecal dominant microbiota at genus level of growing Ussuri raccoon dogs %

3 討 論

3.1 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉生長(zhǎng)性能的影響

糞腸球菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響并不一致。一些研究表明，糞腸球菌可以改善斷奶仔豬生長(zhǎng)性能[11]，其他研究則認(rèn)為沒有影響仔豬生長(zhǎng)性能指標(biāo)[12]。這些差異可能是由于糞腸球菌的菌株和添加水平不同。研究表明，育成期藍(lán)狐[5]和生長(zhǎng)期水貂[6]飼糧中均以添加1×108CFU/kg糞腸球菌時(shí)生長(zhǎng)性能最高，繼續(xù)提高糞腸球菌添加水平，生長(zhǎng)性能并未進(jìn)一步提高，反而有所降低。本試驗(yàn)中，以飼糧添加1×108CFU/kg糞腸球菌時(shí)貉的生長(zhǎng)性能指標(biāo)表現(xiàn)最好，過量添加則可能破壞了腸道菌群平衡。

3.2 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉氮代謝的影響

糞腸球菌能夠提高飼糧中干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和能量的消化率[3]，凈蛋白質(zhì)利用率也得到提高[5-6]。有研究表明，乳酸菌參與機(jī)體包括膽汁酸的肝腸循環(huán)、脂類的吸收、糖異生和蛋白質(zhì)合成[13]。本試驗(yàn)中，3個(gè)糞腸球菌添加組粗蛋白質(zhì)消化率雖未顯著提高，但尿氮排泄量趨于降低，氮沉積量和蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值升高，說明糞腸球菌促進(jìn)了貉體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成和利用。

3.3 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉血清生化指標(biāo)的影響

目前，關(guān)于糞腸球菌對(duì)血清生化指標(biāo)影響的報(bào)道不多。糞腸球菌使哺乳仔豬血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)含量顯著升高，但對(duì)血清UN含量無顯著影響[14]；糞腸球菌使生長(zhǎng)豬血清肌酐含量降低，對(duì)血清GLU、UN和TC含量也無顯著影響[2]。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，Ⅰ組和Ⅱ組血清ALB含量提高，反映了機(jī)體合成蛋白質(zhì)的能力增強(qiáng)，這與本試驗(yàn)中2組氮沉積量提高的結(jié)果相一致；3個(gè)糞腸球菌添加組血清UN含量提高，可能與其采食量提高，導(dǎo)致食入氮量增加有關(guān)。

3.4 飼糧添加糞腸球菌對(duì)生長(zhǎng)期烏蘇里貉糞便菌群的影響

ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)表示菌群的豐富度，香農(nóng)指數(shù)表示菌群的多樣性。多數(shù)研究表明，糞腸球菌能夠提高糞便菌群的豐富度和多樣性[4,15]；但也有試驗(yàn)表明糞腸球菌降低了糞便菌群的豐富度和多樣性[16]。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，Ⅰ組生長(zhǎng)期烏蘇里貉糞便菌群ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著提高，而香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)無顯著差異，說明2組菌群結(jié)構(gòu)相似，但糞腸球菌提高了菌群的豐富度。此外，與Pajarillo等[15]報(bào)道的糞腸球菌使斷奶仔豬糞便中擬桿菌門相對(duì)豐度升高的結(jié)果一致，本研究中Ⅰ組擬桿菌門相對(duì)豐度較對(duì)照組顯著提高，可能與其生長(zhǎng)性能提高有關(guān)。乳酸桿菌作為腸道有益菌，在采用菌落培養(yǎng)方法研究益生菌對(duì)腸道菌群的影響中受到廣泛關(guān)注，并有研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌可以提高糞便乳酸桿菌菌落數(shù)[2-3]。菌落培養(yǎng)方法只檢測(cè)特定的微生物群落，導(dǎo)致研究范圍有限。以細(xì)菌群落分析為目標(biāo)的16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，使大量不能培養(yǎng)的菌種被檢出，從而能夠更廣泛地了解益生菌對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。研究表明，采用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)糞腸球菌可增加糞便中乳桿菌屬的相對(duì)豐度[14]，但也有試驗(yàn)表明糞腸球菌并未使糞便菌群中乳桿菌屬的相對(duì)豐度提高[17]。Hu等[11]利用RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)糞腸球菌不影響糞便中細(xì)菌總數(shù)，但能提高乳桿菌屬的相對(duì)豐度，而利用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)卻未發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬組成和多樣性出現(xiàn)差異。本研究與Hu等[11]一致，也未觀察到糞腸球菌對(duì)乳桿菌屬的影響，這可能與16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)鑒定出的大多數(shù)不能培養(yǎng)的菌種均屬于厚壁菌門有關(guān)[15]。巨球型菌屬是腸道乳酸和糖發(fā)酵菌種，可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和腸道健康具有重要作用[18]。目前對(duì)小桿菌屬、Catenisphaera和光岡菌屬的作用研究很少，但通過16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)在豬糞中發(fā)現(xiàn)了潛在致病性的小桿菌屬菌種[19]。Pajarillo等[15]報(bào)道，糞腸球菌使斷奶仔豬糞便中大腸桿菌和小桿菌屬相對(duì)豐度降低。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，Ⅰ組巨球型菌屬相對(duì)豐度顯著提高，小桿菌屬相對(duì)豐度顯著降低，這提示糞腸球菌可能通過促進(jìn)有益菌的增殖和抑制潛在病原菌的生長(zhǎng)來改善生長(zhǎng)期烏蘇里貉的生長(zhǎng)性能和腸道菌群的平衡。

4 結(jié) 論

飼糧添加糞腸球菌能夠提高生長(zhǎng)期烏蘇里貉生長(zhǎng)性能，改善氮利用率，促進(jìn)有益菌增殖，抑制潛在病原菌生長(zhǎng)，添加水平以1×108CFU/kg較為適宜。