于道德 陳勝林 郭少菁 樊 英,3 王曉璐,3 宋靜靜 劉洪軍,3*

(1.山東省海洋科學研究院，青島 266104；2.濱州市海洋發(fā)展研究院，濱州 256603；3.山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，青島 266104)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是全世界主要的甲殼類養(yǎng)殖物種之一[1]。近年來，隨著對蝦的高密度、集約化養(yǎng)殖，種質退化、養(yǎng)殖環(huán)境惡化和病害等災害造成了不少經濟損失[2-4]。使用激素和抗生素是作為預防和治療病害的傳統(tǒng)方法，但往往導致了致病微生物的進化、藥物殘留以及環(huán)境污染[5-6]。作為抗生素的重要替代物，益生菌具備健康、綠色、安全等特點，普遍應用于蝦蟹類等水珍品養(yǎng)殖過程中[7-9]。

迄今為止，許多常見菌株已被用作對蝦養(yǎng)殖的益生菌，包括枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)和乳酸菌(Lactobacillus)等。其中，枯草芽孢桿菌能夠耐受高溫、高壓、高鹽度、低氧、低水分等不利條件，其生長繁殖可以分泌大量消化酶類，幫助宿主降解、吸收營養(yǎng)物質。Chai等[10]研究發(fā)現(xiàn)，口服芽孢桿菌PC465可以提高凡納濱對蝦的生長性能和存活率。采用枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌作為飼料添加劑，可顯著提高對蝦腸道內芽孢桿菌的豐度，促進對蝦生長發(fā)育[11-13]。本試驗通過向飼料中添加不同水平的枯草芽孢桿菌HSP05，以評估其對凡納濱對蝦生長性能、抗病力和非特異性免疫力的影響，為該菌株在作為飼料添加劑的應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與計數(shù)

枯草芽孢桿菌HSP05為實驗室保藏菌株，從健康養(yǎng)殖3年以上的對蝦養(yǎng)殖池中分離得到。將枯草芽孢桿菌HSP05按1%的比例接種到LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃、165 r/min過夜培養(yǎng)進行活化，隨后逐級擴大培養(yǎng)。3 000 r/min離心20 min，棄掉上清液收集菌體。用適量無菌生理鹽水調整菌株濃度，逐級稀釋添加到飼料制作過程中。

采用平板菌落計數(shù)法進行菌株數(shù)量統(tǒng)計。用磷酸鹽緩沖液(PBS)將菌液稀釋，于LB固體平板上進行涂布，每個梯度涂布3個平板做為平行，挑選合適的稀釋梯度進行計數(shù)，計數(shù)結果取3個平行的平均值。

1.2 試驗設計和飼料制作

挑選大小一致的1 200尾凡納濱對蝦蝦苗，體長(3.0±0.2) cm，隨機分為4個組，每組3個重復，每個重復100尾。各組分別投喂枯草芽孢桿菌HSP05添加量為0(對照組)、105(BS1組)、107(BS2組)、109CFU/g(BS3組)的試驗飼料。試驗期4周。

以魚粉、豆粕和玉米粕為主要蛋白質源，魚油和磷脂油為主要脂肪源，小麥面粉為主要糖源，并補充無機鹽、維生素等配制出基礎飼料，基礎飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料原料經粉碎、80目過篩、混合均勻后，添加不同體積固定濃度的枯草芽孢桿菌HSP05，配制枯草芽孢桿菌HSP05終濃度分別為105、107、109CFU/g的試驗飼料，對照組添加等體積的生理鹽水。飼料原料全部混合均勻后，噴水制備面團，用飼料顆粒機擠壓膨化成型，常溫陰至半干，剪切成1.5 mm×(3～5) mm的顆粒，置陰涼干燥處保存。

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.3 養(yǎng)殖管理

健康的凡納濱對蝦幼蝦購自山東煙臺海陽對蝦養(yǎng)殖場，在試驗前于25～28 ℃和27‰～30‰鹽度的循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周。暫養(yǎng)期間飼喂基礎飼料。隨后挑選大小一致的蝦苗，體長(3.0±0.2) cm，隨機分散到12個玻璃缸(300 L)中開始養(yǎng)殖試驗。養(yǎng)殖周期為4周。

養(yǎng)殖期間每天投喂對蝦4次(06:00、12:00、17:00和22:00)，每天清除殘餌和糞便，并記錄攝食量和健康狀況，每周測定1次體長、體重。養(yǎng)殖全過程不間斷充氣，溶解氧含量不低于5 mg/L，氨氮含量不高于0.03 mg/L。每天換水1次，每次換水占總水量的2/3。

1.4 樣品采集

使用含有抗凝劑的1 mL無菌注射器從對蝦的圍心腔內抽取血淋巴。其中抗凝劑與血淋巴的混合體積比為1∶1。隨后將血淋巴離心，用PBS調整至血細胞數(shù)量達到106個/mL，進行吞噬活性和呼吸暴發(fā)試驗，每組9個平行。

使用1 mL無菌注射器從對蝦的圍心腔內抽取血淋巴，4 ℃放置過夜后，3 500 r/min離心10 min，收集上清液置于液氮中速凍，儲存于-80 ℃，用于免疫相關酶活性的分析，每組8個平行。

收集對蝦肝胰腺置于液氮速凍，并儲存于-80 ℃，用于消化酶和免疫相關酶活性的分析，每組8個平行。在酶活性測定時，將適量對蝦肝胰腺樣品加入PBS勻漿緩沖液中制成20%的組織勻漿樣品，4 ℃，2 500×g離心10 min，收集上層澄清勻漿液分裝備用。

1.5 侵染試驗

飼養(yǎng)試驗結束后，進行為期1周的副溶血弧菌侵染試驗。每個玻璃缸中留50 L海水和25只凡納濱對蝦，用濃度為107CFU/mL的副溶血弧菌浸浴。侵染期間不換水，投喂添加菌株的飼料，每12 h統(tǒng)計一次死亡情況，及時撈出死蝦和糞便。

1.6 指標測定

1.6.1 生長性能

在養(yǎng)殖試驗過程中，每周、每缸隨機選取8尾對蝦測定其體長(body length，BL)、體重(body weight，BW)。試驗結束后，對各缸對蝦進行計數(shù)，計算存活率(survival rate，SR)、增重率(weight gain rate，WGR)、飽滿度(condition factor，CF)和特定生長率(specific growth rate，SGR)，計算公式如下：

式中：W0為對蝦初始體重；Wt為對蝦終末體重；Lt為對蝦終末體長；T為養(yǎng)殖試驗時間。

1.6.2 血細胞免疫反應測定

1.6.2.1 吞噬活性

試驗方法在Delaporte等[15]的方法基礎上稍作修改，簡述如下：用PBS調整血細胞濃度為106個/mL；取4 μL、25%的熒光微球加入400 μL血細胞中，混合均勻，18 ℃下避光孵育1 h；加入26 μL多聚甲醛終止反應；4 ℃、800×g離心10 min去除游離的熒光微球；加入400 μL PBS重懸血細胞，采用流式細胞儀FL-1通道檢測分析血細胞的綠色熒光。采用血細胞吞噬率，即吞噬微球的血細胞數(shù)目占血細胞總數(shù)的百分比來表征吞噬能力。

1.6.2.2 呼吸爆發(fā)

血細胞呼吸爆發(fā)產生的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)可以將二氫羅丹明123(dihydrorhodamine 123，DHR123)氧化為發(fā)熒光的羅丹明123(rhodamine 123，RHO123)[16]，經流式細胞儀檢測，比較呼吸爆發(fā)吸收峰偏移程度以比較血細胞的呼吸爆發(fā)活性。將對蝦血細胞數(shù)量調整為106個/mL，于25 ℃、黑暗條件下孵育10 min，添加佛波酯(PMA)使其終濃度達到0.1 μg/mL，繼續(xù)孵育10 min后添加DHR123，使DHR123終濃度為2 μg/mL，繼續(xù)孵育30 min。采用流式細胞儀FL-1通道檢測分析呼吸爆發(fā)活性。

1.6.3 酶活性測定

肝胰腺消化酶[淀粉酶(AMS)、蛋白酶(PR)、脂肪酶(LPS)]、轉氨酶[(谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)]、抗氧化相關酶[超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)]活性和血清免疫相關酶[酚氧化酶(PO)、溶菌酶(LZM)]活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定。

1.7 數(shù)據處理與分析

試驗結果以平均值±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據進行單因素方差分析(one-way ANOVE)，采用LSD方差齊性檢驗方法比較各組之間的差異，顯著性水平定義為P<0.05。

2 結 果

2.1 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦生長性能的影響

如表2所示，各組存活率均在75%以上，各組之間無顯著差異(P>0.05)。BS1、BS2和BS3組的終末體重和終末體長顯著高于對照組(P<0.05)，BS1、BS2和BS3組之間無顯著差異(P>0.05)。各組之間飽滿度無顯著差異(P>0.05)。BS1、BS2和BS3組的增重率顯著高于對照組(P<0.05)，BS2組的增重率顯著高于BS3組(P<0.05)。BS1、BS2和BS3組的特定生長率顯著高于對照組(P<0.05)，BS1、BS2和BS3組之間無顯著差異(P>0.05)。

表2 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦生長性能的影響Table 2 Effects of dietary Bacillus subtilis HSP05 on growth performance of Litopenaeus vannamei

2.2 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦肝胰腺消化酶和轉氨酶活性的影響

如表3所示，BS1、BS2和BS3組的肝胰腺蛋白酶、淀粉酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，BS2和BS3組的肝胰腺蛋白酶、淀粉酶活性顯著高于BS1組(P<0.05)。各組之間肝胰腺脂肪酶活性無顯著差異(P>0.05)。BS1、BS2和BS3組的肝胰腺谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性均顯著低于對照組(P<0.05)，BS2組的肝胰腺谷丙轉氨酶活性顯著低于BS1組(P<0.05)，BS1、BS2和BS3組之間肝胰腺谷草轉氨酶活性無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦肝胰腺消化酶和轉氨酶活性的影響Table 3 Effects of dietary Bacillus subtilis HSP05 on activities of digestive enzyme and transaminase in hepatopancreas of Litopenaeus vannamei U/mg prot

2.3 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦血清和肝胰腺免疫相關酶活性的影響

如表4所示，BS1、BS2和BS3組的血清酚氧化酶和溶菌酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，BS1、BS2和BS3組之間血清酚氧化酶活性無顯著差異(P>0.05)，BS2和BS3組的血清溶菌酶活性顯著高于BS1組(P<0.05)。BS1、BS2和BS3組的肝胰腺過氧化氫酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，BS2和BS3組的肝胰腺過氧化氫酶活性顯著高于BS1組(P<0.05)。BS2和BS3組的肝胰腺超氧化物歧化酶活性顯著高于對照組(P<0.05)，BS3組的肝胰腺超氧化物歧化酶活性顯著高于BS2組(P<0.05)。

2.4 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦血細胞免疫活性的影響

如表5所示，BS1、BS2和BS3組的血細胞吞噬率顯著高于對照組(P<0.05)，BS2和BS3組的血細胞吞噬率顯著高于BS1組(P<0.05)。BS1、BS2和BS3組的呼吸爆發(fā)活性顯著低于對照組(P<0.05)，BS2和BS3組的呼吸爆發(fā)活性顯著低于BS1組(P<0.05)。

表4 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦血清和肝胰腺免疫相關酶活性的影響Table 4 Effects of dietary Bacillus subtilis HSP05 on serum and hepatopancreas immune related enzyme activities of Litopenaeus vannamei

表5 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦血細胞免疫活性的影響Table 5 Effects of dietary Bacillus subtilis HSP05 on blood cell immune activities of Litopenaeus vannamei %

2.5 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦抗病力的影響

如圖1所示，副溶血弧菌侵染持續(xù)3 d時，對照組的存活率就已明顯低于BS1、BS2和BS3組；副溶血弧菌侵染持續(xù)7 d時，對照組的存活率為46.67%，而BS1、BS2和BS3組的存活率均達到82.67%以上，且BS1、BS2和BS3組之間的差異不明顯。

圖1 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦抗病力的影響Fig.1 Effects of dietary Bacillus subtilis HSP05 on disease resistance of Litopenaeus vannamei

3 討 論

3.1 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦生長性能的影響

枯草芽孢桿菌是水產養(yǎng)殖中常用的益生菌株，其豐富的產酶系統(tǒng)可促進飼料中大分子營養(yǎng)物質的利用，促進水產動物的健康生長。本研究結果表明，飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05能顯著提高凡納濱對蝦的終末體長、終末體重、增重率和特定生長率。綜合枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦生長性能的影響，尤其是增重率方面，發(fā)現(xiàn)107CFU/g是促進凡納濱對蝦生長的適宜添加量。這與芽孢桿菌對刺參(Apostichopusjaponicus)[17-18]、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)[19-20]及凡納濱對蝦[21-22]等的研究結果相似。在本試驗中，枯草芽孢桿菌HSP05的促生長效果與其添加量不呈正相關，109CFU/g枯草芽孢桿菌HSP05組的增重率顯著低于107CFU/g枯草芽孢桿菌HSP05組。這可能是由于過量的枯草芽孢桿菌抑制了凡納濱對蝦腸道內其他菌群的生長，導致腸道菌群失衡而造成其生長緩慢，更深層次的原因還有待深入研究。

3.2 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦肝胰腺消化酶和轉氨酶活性的影響

枯草芽孢桿菌促進對蝦生長可能與其產酸、抗菌肽、胞外酶等小分子活性物質等作用有關。本研究中，飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05能顯著提高凡納濱對蝦肝胰腺蛋白酶、淀粉酶活性，這與胡毅等[23]的研究結果類似，其在凡納濱對蝦飼料中添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌及復合益生菌，結果顯示添加益生菌可提高對蝦腸道消化酶活性，促進對蝦健康生長。此外，谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶升高往往代表著肝胰腺出現(xiàn)炎癥。本試驗中，飼料中添加了枯草芽孢桿菌HSP05顯著降低了凡納濱對蝦肝胰腺谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性，這與Vega-Carranza等[12]、張健等[24]研究結果相似，表明枯草芽孢桿菌HSP0有著改善健康、增強免疫的作用。

3.3 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦非特異性免疫力的影響

凡納濱對蝦免疫能力是細胞免疫和體液免疫協(xié)同作用的結果。酚氧化酶原存在于血細胞內，極微量微生物多糖可引起血細胞的胞吐作用，釋放、激活酚氧化酶原系統(tǒng)，提高機體對病原微生物的抵抗力[25-26]。在本研究中，與對照組相比，BS1、BS2和BS3組凡納濱對蝦血清酚氧化酶和溶菌酶活性顯著上升，這是激活酚氧化酶原系統(tǒng)的必然結果。類似的，謝佳磊等[27]的研究得出，飼料中添加枯草芽孢桿菌(5×109CFU/kg)可以提高克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)血清溶菌酶和酚氧化酶活性。同時，超氧化物歧化酶、過氧化氫酶能夠有效清除氧自由基，避免其造成生物體損傷，在提高對蝦機體免疫能力、增強對蝦疾病防御起重要作用。在本試驗中，BS1、BS2和BS3組肝胰腺過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性均高于對照組，肝胰腺過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性分別在枯草芽孢桿菌HSP05添加量為107和109CFU/g時達到最大值，表明飼喂枯草芽孢桿菌HSP05可提高兩者活性，這與王苓等[28]以枯草芽孢桿菌飼喂凡納濱對蝦后所得結果相似。上述結果表明飼料中添加適量的枯草芽孢桿菌HSP05可提高凡納濱對蝦的非特異性免疫力，或可有助于提高其抗病力。

血細胞免疫反應是機體抵御病原微生物侵襲的重要手段。凡納濱對蝦血細胞的吞噬率隨著枯草芽孢桿菌HSP05添加量增加而增加，原因可能是枯草芽孢桿菌HSP05被攝入后，利用表面抗原或其產生的代謝物調節(jié)對蝦的免疫防御系統(tǒng)，使對蝦血細胞吞噬率提高。Rengpipat等[29]研究結果同樣表明添加芽孢桿菌S11可以激活細胞免疫防御功能。在吞噬作用期間，呼吸爆發(fā)被用來殺死病原菌，特別是依賴于ROS，但是它們的過度產生會干擾包括脂類、蛋白質和核酸在內的生物分子，并產生氧化損傷和氧化應激[30]。在本研究中，飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05可以抑制血細胞呼吸爆發(fā)活性，即血細胞ROS產量被顯著抑制，從而降低過量的ROS對機體的損害。這種對呼吸爆發(fā)的抑制能力可能與過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性提高有關。

3.4 飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05對凡納濱對蝦抗病力的影響

病害問題是造成凡納濱對蝦養(yǎng)殖成功率低的主要原因，存活率是抗病力的外在直觀體現(xiàn)，副溶血弧菌是引起凡納濱對蝦肝胰腺壞死綜合征的致病菌，致死率較高[31-32]。國內外均有研究顯示，用芽孢桿菌飼喂對蝦或對蝦幼體，可用于控制病原菌的感染[8,33-34]。本研究結果與上述結果類似，飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05提高了凡納濱對蝦在副溶血弧菌侵染下的存活率，充分發(fā)揮了免疫防御作用，但枯草芽孢桿菌HSP05的添加量對對蝦抗病力沒有明顯影響。這說明低濃度下的枯草芽孢桿菌HSP05依舊具有抗感染效果。

4 結 論

飼料中添加枯草芽孢桿菌HSP05可促進凡納濱對蝦生長，增強免疫力，提高抗病力。枯草芽孢桿菌HSP05的添加量為107CFU/g時，凡納濱對蝦的生長表現(xiàn)最優(yōu)，非特異性免疫得到有效提高。