趙麗麗 王迪欣 廖章斌 畢清竹 馬 強(qiáng) 衛(wèi)育良 梁萌青 喬秀亭 程鎮(zhèn)燕* 徐后國*

(1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300392；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，青島 266071)

脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP，也稱為溶質(zhì)載體家族27)廣泛存在于從分枝桿菌到人類的許多生物中，在長鏈脂肪酸(LCFA)和超長鏈脂肪酸(VLCFA)的細(xì)胞攝取和代謝中發(fā)揮著重要作用。已經(jīng)在人類和小鼠中鑒定到6種FATP亞型，即FATP1～FATP6，每種亞型都在攝取特定脂肪酸中起著不同的作用[1-2]。盡管FATP促進(jìn)LCFA攝取的確切機(jī)制仍不十分清楚，但已經(jīng)有人提出FATP可以通過以下幾種方式發(fā)揮作用：1)作為LCFA的直接轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；2)通過酰基輔酶A合成酶激活LCFA；3)作為具有獨(dú)立轉(zhuǎn)運(yùn)和酶活性的雙功能蛋白[3-4]。

FATP已在哺乳動(dòng)物甚至某些無脊椎動(dòng)物中得到廣泛研究[5]。但是，關(guān)于魚類FATP的信息很少。在一些魚類研究中，F(xiàn)ATP表達(dá)僅用作脂質(zhì)積累的指標(biāo)[6-7]。與哺乳動(dòng)物不同，魚類更多地利用脂質(zhì)而不是碳水化合物作為其主要能量來源。脂肪作為三大營養(yǎng)物質(zhì)之一，是魚類生長、發(fā)育和繁殖所必需的營養(yǎng)物質(zhì)[8]。此外，魚類是人類食用的長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，即二十二碳六烯酸(DHA，22∶6n-3)、二十碳五烯酸(EPA，20∶5n-3)和花生四烯酸(ARA，20∶4n-6)的主要來源。因此，闡明魚類體內(nèi)FATP功能有利于闡明其體內(nèi)脂質(zhì)/脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。

在我們之前對(duì)花鱸(Lateolabraxjaponicus)的研究中，已經(jīng)克隆并表征了幾種FATP亞型，即FATP1a、FATP1b、FATP4和FATP6[9]。但是，其他魚類中FATP基因的特征研究非常稀少。本研究旨在對(duì)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)和紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)這2種海洋硬骨魚的FATP基因進(jìn)行研究，這2種魚類也因其特殊的脂質(zhì)儲(chǔ)存模式而成為脂質(zhì)代謝研究的重要模式魚類[10]?？紤]到飼料脂肪水平已在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中被用于調(diào)節(jié)魚類生長和品質(zhì)[11]，本研究除分析2種海洋硬骨魚的FATP基因序列特征和組織分布外，還研究了飼料脂肪水平和饑餓時(shí)間對(duì)FATP表達(dá)的影響，研究結(jié)果將有助于闡明魚類FATP基因的生理機(jī)制及調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 飼養(yǎng)試驗(yàn)和取樣

1.1.1 大菱鲆飼養(yǎng)試驗(yàn)和取樣

在大菱鲆FATP表達(dá)的組織分布研究中，取眼睛、大腦、心臟、鰓、肌肉、肝臟、腎臟、皮膚、鰭周圍皮下組織、脾臟、胃、幽門盲腸、腸13個(gè)組織樣本，腸分別取前腸、中腸和后腸，采自山東省煙臺(tái)市黃海水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司養(yǎng)殖的30條大菱鲆幼魚(體重約20 g，每組10條)。這些魚被用丁香酚麻醉后立即被解剖。組織樣本-76 ℃保存，用于進(jìn)一步提取RNA。

飼喂試驗(yàn)選擇平均初始體重為26 g的大菱鲆幼魚630尾，隨機(jī)分為3組，每組6個(gè)重復(fù)(桶)，每個(gè)重復(fù)35尾，進(jìn)行9周的飼養(yǎng)試驗(yàn)，然后進(jìn)行饑餓試驗(yàn)(30 d)。各組試驗(yàn)飼料脂肪水平分別為8.0%(對(duì)照組)、12.0%和16.0%[12-13]，試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料按照本實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)程序制作[14]，使用前于-20 ℃存放。

飼喂試驗(yàn)在煙臺(tái)市天源水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司的流式海水系統(tǒng)中進(jìn)行，試驗(yàn)魚亦購自該公司。飼喂試驗(yàn)開始前，在聚乙烯桶(500 L)中飼養(yǎng)試驗(yàn)魚，并飼喂商業(yè)飼料7 d，以適應(yīng)試驗(yàn)條件。在飼喂試驗(yàn)開始時(shí)，將試驗(yàn)魚隨機(jī)分配到18個(gè)聚乙烯桶中。在試驗(yàn)期間，每天2次(07:30和17:30)人工投喂至明顯飽食。每天用虹吸的方式清洗試驗(yàn)桶，將剩余的飼料和糞便吸出。飼喂試驗(yàn)結(jié)束后，在試驗(yàn)魚禁食24 h后，每個(gè)桶隨機(jī)取6尾魚的肝臟樣本。

飼喂試驗(yàn)結(jié)束后，在對(duì)照組的每個(gè)桶中隨機(jī)抽取20尾魚，進(jìn)行后續(xù)的饑餓試驗(yàn)。在接下來的饑餓期，分別在4個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，即第0天(飼喂期結(jié)束為第0天)、第10天、第20天、第30天分別隨機(jī)抽取6尾魚的肝臟樣本。所有采集的組織樣本均立即冷凍于液氮中，然后在-76 ℃保存?zhèn)溆?。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，水溫為13.2～15.2 ℃，鹽度為27～29 g/L，pH為7.5～8.0，溶解氧濃度為6～8 mg/L。

1.1.2 紅鰭東方鲀飼養(yǎng)試驗(yàn)和取樣

在紅鰭東方鲀FATP表達(dá)的組織分布研究中，取肝臟、肌肉、大腦、腸、心臟、眼睛、皮膚和脾臟8個(gè)組織樣品，采自煙臺(tái)市黃海水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司養(yǎng)殖的15只紅鰭東方鲀幼魚(體重約20 g，每組5條魚)收集。組織的采樣方式與大菱鲆試驗(yàn)一致。

飼喂試驗(yàn)選擇平均初始體重為19.5 g的紅鰭東方鲀幼魚900尾，隨機(jī)分為3組，每組6個(gè)重復(fù)(網(wǎng)箱)，每個(gè)重復(fù)50尾，進(jìn)行9周的飼養(yǎng)試驗(yàn)，然后進(jìn)行饑餓試驗(yàn)(30 d)。紅鰭東方鲀和大菱鲆的脂肪需求水平相似[15-16]，因此試驗(yàn)采用與大菱鲆試驗(yàn)飼料相似的試驗(yàn)飼料。各組試驗(yàn)飼料脂肪水平分別為8.0%(對(duì)照組)、12.0%和16.0%，試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料按照本實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)程序制作[14]，使用前于-20 ℃存放。

飼喂試驗(yàn)在唐山市海都水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司進(jìn)行，試驗(yàn)魚亦購自該公司。飼喂試驗(yàn)開始前，在室內(nèi)水泥池(6.2 m×6.2 m×1.8 m)中飼養(yǎng)，并投喂商品飼料14 d，以適應(yīng)試驗(yàn)條件。在適應(yīng)期，為了防止同類相食，魚的下齒尖端被剪掉。在飼喂試驗(yàn)開始時(shí)，將試驗(yàn)魚隨機(jī)分配到水泥池中的18個(gè)網(wǎng)箱(1.4 m×1.4 m×1.0 m)中。在大的水體中放置網(wǎng)箱有利于保持魚所需要的低水溫。在試驗(yàn)期間，每天2次(06:00和18:00)人工投喂至明顯飽食。每次飼喂后更換80%的飼養(yǎng)水。飼喂試驗(yàn)結(jié)束后，在試驗(yàn)魚禁食24 h后，每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取6尾魚的肝臟樣本。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

飼喂試驗(yàn)結(jié)束后，從對(duì)照組的每個(gè)網(wǎng)箱中隨機(jī)抽取30尾魚，進(jìn)行后續(xù)的饑餓試驗(yàn)。在接下來的饑餓期，分別在6個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)，即第0天(飼喂期結(jié)束當(dāng)天為第0天)、第1天、第4天、第9天、第16天、第31天分別隨機(jī)抽取3尾魚的肝臟樣本。所有采集的組織樣本均立即冷凍于液氮中，然后在-76 ℃保存?zhèn)溆?。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，水溫為20～23 ℃，鹽度為22～30，pH為7.4～8.2，溶解氧為5～7 mg/L。

1.2 RNA提取、cDNA合成、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)分析

肝臟樣本的總RNA采用RNAiso Plus[寶生物工程(大連)有限公司]提取，并根據(jù)使用手冊(cè)使用Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR試劑盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

采用qRT-PCR檢測不同魚類組織中以及不同營養(yǎng)狀態(tài)下FATPmRNA的相對(duì)表達(dá)量。所有被研究的FATP的完整蛋白質(zhì)編碼區(qū)(CDS)均可在GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得。根據(jù)GenBank中FATP序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，由擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成(表2)。根據(jù)我們之前的篩選試驗(yàn)，以β2微球蛋白(B2M)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和延伸因子1α(EF1α)作為大菱鲆研究的內(nèi)參基因，以β-actin和核糖體蛋白L19(RPL19)作為紅鰭東方鲀研究的內(nèi)參基因[17]。根據(jù)目標(biāo)模板6步4倍稀釋系列標(biāo)準(zhǔn)曲線估計(jì)，所有引物的擴(kuò)增效率在95%～105%，線性回歸系數(shù)(R2)>0.99。采用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit Ⅱ和定量PCR儀(Roche LightCycler 96，瑞士)進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系由2 μL cDNA模板、10 μL SYBR Green Pro Taq HS Premix Ⅱ、0.8 μL正向引物、0.8 μL反向引物和6.4 μL無菌水組成。程序如下：95 ℃ 30 s，然后依次進(jìn)行95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s的40個(gè)循環(huán)。在擴(kuò)增階段后進(jìn)行熔化曲線分析(從65 ℃增加到97 ℃，6.4 ℃/min)，以確認(rèn)唯一的產(chǎn)物條帶。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)。根據(jù)2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量[18]。

表2 PCR引物序列Table 2 Primers sequences of PCR

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

氨基酸多序列比對(duì)采用BioEdit軟件進(jìn)行。利用ClustalW軟件對(duì)FATPcDNA序列進(jìn)行相似性分析。用ExPASy Compute pI/MW(http://web.expasy.org/compute_pi/)對(duì)推斷出的氨基酸序列特征進(jìn)行分析。利用SMART程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)和PROSITE程序(http://kr.expasy.org/prosite/)預(yù)測氨基酸序列中的功能位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域。使用鄰接法基于氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并使用MEGA 4.1軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

所有mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著者采用Tukey氏法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著。魚類各組織中FATP的mRNA相對(duì)表達(dá)量僅用平均值表示，因?yàn)椴煌M織間的組內(nèi)差異較大(有時(shí)不同組織間的數(shù)量級(jí)差異太多，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)無法通過方差齊性檢驗(yàn))。

2 結(jié) 果

2.1 序列分析

由圖1可見，大菱鲆FATP1、FATP4和FATP6的完整編碼序列分別編碼648、643和618個(gè)氨基酸的多肽，紅鰭東方鲀FATP1、FATP4和FATP6的完整編碼序列分別編碼647、643和623個(gè)氨基酸的多肽。預(yù)測的分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)分別為在69.1～73.0 ku和7.89～9.00。大菱鲆和紅鰭東方鲀的FATP序列均有1個(gè)或2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。所有的大菱鲆和紅鰭東方鲀FATP都有1個(gè)保守的單磷酸腺苷(AMP)結(jié)合域，位于C端(對(duì)于FATP1和FATP4是YIYTSGTTGMPK；對(duì)于FATP6是YIFTSGTTGLPK)，而脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域僅在大菱鲆和紅鰭東方鲀FATP4中存在，但在FATP1和FATP6中不存在。大菱鲆和紅鰭東方鲀的FATP1和FATP4與斑馬魚(80.3%～83.6%)和人類(64.8%～70.6%)的同源性較高，而與尼羅羅非魚(48.7%～78.5%)的同源性較低。

由圖2可見，系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示FATP1、FATP4和FATP6分別聚類在一起。大菱鲆和紅鰭東方鲀的FATP1與其他硬骨魚的FATP1b聚類得更近。在魚類/哺乳動(dòng)物分化之前，F(xiàn)ATP亞家族可能已經(jīng)從一個(gè)共同的祖先分化出來，但大菱鲆FATP6聚類在遠(yuǎn)離其他硬骨魚和人類FATP6的地方。其他的FATP亞家族，如FATP2、FATP3和FATP5，需要在后續(xù)的研究中進(jìn)行分析。

2.2 大菱鲆和紅鰭東方鲀FATP的組織分布

由圖3和圖4可見，在大菱鲆中，F(xiàn)ATP1在大腦、心臟、腎臟和眼睛中mRNA相對(duì)表達(dá)量較高，在鰭、脾臟、胃和幽門盲腸中mRNA相對(duì)表達(dá)量中等，在皮膚中mRNA相對(duì)表達(dá)量較低；FATP4和FATP6主要表達(dá)于消化道，在幽門盲腸和前腸中mRNA相對(duì)表達(dá)量較高，F(xiàn)ATP6在中腸中mRNA相對(duì)表達(dá)量較低。紅鰭東方鲀的FATP也有類似的組織分布，但紅鰭東方鲀的FATP6幾乎只在肝臟中表達(dá)。

2.3 飼料脂肪水平對(duì)大菱鲆和紅鰭東方鲀肝臟FATP mRNA表達(dá)的影響

由圖5可見，飼料脂肪水平對(duì)大菱鲆和紅鰭東方鲀的肝臟FATP1、FATP4和FATP6的mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著影響(P>0.05)。與對(duì)照組相比，飼料脂肪水平為16.0%組菱鲆的肝臟FATP4和FATP6的mRNA相對(duì)表達(dá)量略有升高，飼料脂肪水平為16.0%組的紅鰭東方鲀的肝臟FATP1和FATP6的mRNA相對(duì)表達(dá)量略有升高。

2.4 饑餓時(shí)間對(duì)大菱鲆和紅鰭東方鲀肝臟FATP mRNA表達(dá)的影響

由圖5可見，隨著饑餓時(shí)間的延長，大菱鲆的肝臟FATP1、FATP4和FATP6的mRNA相對(duì)表達(dá)量大致呈上升趨勢(shì)；大菱鲆第30天的肝臟FATP1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于第0天、第10天和第20天(P<0.05)。

隨著饑餓時(shí)間的延長，紅鰭東方鲀第16天和第31天的肝臟FATP1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于第0天、第1天、第4天和第9天(P<0.05)，第9天和第31天的肝臟FATP4的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于第0天、第1天和第4天(P<0.05)，第16天的肝臟FATP6的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于第0天、第1天、第4天、第9天和第31天(P<0.05)。

利用ClustalX對(duì)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。相同的用黑色表示，相似的用灰色表示。引入間隙(-)以最大化對(duì)齊?？缒そY(jié)構(gòu)域有下劃線或虛下劃線(如果2物種不同的話，虛線代表大菱鲆)。單磷酸腺苷結(jié)合域用框標(biāo)記，脂質(zhì)運(yùn)載蛋白結(jié)構(gòu)域用星號(hào)標(biāo)記。Hs：人類；Dr：斑馬魚；On：尼羅羅非魚；Sm：大菱鲆；Tr：紅鰭東方鲀；1：脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1；4：脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4；6：脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白6。The amino acid sequences were aligned using ClustalX. Identical residues were shaded black and similar residues were shaded grey. Gaps (-) were introduced to maximize the alignment. The transmembrane domains were underlined or dash underlined (dash for turbot if different between the two species). The boxes marked the AMP binding domains, and the asterisks mark the lipid carrier protein domains. Hs: Homo sapiens; Dr: Danio rerio; On: Oreochromis niloticus; Sm: Scophthalmus maximus; Tr: Takifugu rubripes; 1: FATP1, 4: FATP4, 6: FATP6.圖1 大菱鲆、紅鰭東方鲀、尼羅羅非魚、斑馬魚和人類的FATP氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Comparison of FATP amino acid sequences from Scophthalmus maximus, Takifugu rubripes, Oreochromis niloticu, Danio rerio and Homo sapiens

Homo sapiens：人；Danio rerio：斑馬魚；Larimichthys crocea：大黃魚；Salmo salar：大西洋鮭；Lateolabrax japonicus：花鱸；Scophthalmus maximus：大菱鲆；Takifugu rubripes：紅鰭東方鲀；FATP：脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 fatty acid transport protein。水平分枝長度為每個(gè)位點(diǎn)氨基酸取代率。這些數(shù)字表示在1 000次bootstrap迭代后所呈現(xiàn)的樹拓?fù)浔粡?fù)制的頻率。The horizontal branch length was amino acid substitution rate per site. The numbers represented the frequencies with which the tree topology presented here was replicated after 1 000 bootstrap iterations.圖2 FATP的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of FATP

E：眼睛 eye；B：大腦 brain；H：心臟 heart；G：鰓 gill；M：肌肉 muscle；L：肝臟 liver；K：腎臟 kidney；Sk：皮膚 skin；Su：鰭周圍皮下組織 subcutaneous tissue around the fin；Sp：脾臟 spleen；St：胃 stomach；P：幽門盲腸 pyloric caecum；AI：前腸 anterior intestine；MI：中腸 mid intestine；HI：后腸 hind intestine。FATP1：脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1 fatty acid transport protein 1；FATP4：脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4 fatty acid transport protein 4；FATP6：脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白6 fatty acid transport protein 6。下圖同 the same as below。圖3 大菱鲆FATP組織分布Fig.3 Tissue distribution of FATP in Scophthalmus maximus

3 討 論

3.1 FATP序列特征分析

大菱鲆和紅鰭東方鲀的FATP序列特征與其他物種相似[19]。同時(shí)，跨膜結(jié)構(gòu)域普遍存在于2種魚的FATP序列中。盡管由于FATP蛋白的疏水特性與脂肪酸相互作用強(qiáng)烈導(dǎo)致跨膜結(jié)構(gòu)域的數(shù)量難以預(yù)測，但大多數(shù)FATP序列都有1～4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域[20]。然而，我們之前的一項(xiàng)研究表明，花鱸FATP6沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，因此不能作為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體[9]。類似的結(jié)果在大造橋蟲(Ascotisselenaria)的FATP也被發(fā)現(xiàn)[5]。保守的AMP結(jié)合域也普遍存在于2種魚的FATP序列中，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ谶\(yùn)輸功能都是必不可少的。AMP結(jié)合域在所有已知的FATP中都已發(fā)現(xiàn)。它能傳遞?；o酶A合成酶活性，其內(nèi)部的突變會(huì)破壞FATP的LCFA轉(zhuǎn)運(yùn)活性[21-22]。與AMP結(jié)構(gòu)域不同的是，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)僅在大菱鲆和紅鰭東方鲀FATP4中存在，在FATP1和FATP6中不存在。脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域通常存在于運(yùn)輸疏水小分子的蛋白質(zhì)中，這種結(jié)構(gòu)域在哺乳動(dòng)物和斑馬魚之間高度保守[23]。是否具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域表明不同F(xiàn)ATP亞型之間的功能差異化。與之相對(duì)應(yīng)的是，大菱鲆和紅鰭東方鲀FATP6與其FATP1和FATP4的同源性較低(<40%)，預(yù)示了可能的較大功能差異。

E：眼睛 eye；B：大腦 brain；H：心臟 heart；M：肌肉 muscle；L：肝臟 liver；Sk：皮膚 skin；Sp：脾臟 spleen；I：腸 intestine。圖4 紅鰭東方鲀FATP組織分布Fig.4 Tissue distribution of FATP in Takifugu rubripes

數(shù)據(jù)柱標(biāo)相同小寫字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Value columns with the same small letter of no letter mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.圖5 飼料脂肪水平對(duì)大菱鲆和紅鰭東方鲀肝臟FATP表達(dá)的影響Fig.5 Effects of dietary lipid level on liver FATP expression of Scophthalmus maximus and Takifugu rubripes

3.2 大菱鲆和紅鰭東方鲀FATP的組織分布

我們之前的一項(xiàng)研究表明，花鱸FATP的組織分布模式完全不同，F(xiàn)ATP1a在大腦、肝臟、眼睛中mRNA相對(duì)表達(dá)量較高，F(xiàn)ATP1b在鰓中mRNA相對(duì)表達(dá)量極高，而FATP6在幾乎所有組織中mRNA相對(duì)表達(dá)量都很低[9]。與花鱸FATP1相似，大菱鲆和紅鰭東方鲀?cè)诟缓琇C-PUFA的組織，即大腦、眼睛和肝臟中mRNA相對(duì)表達(dá)量較高，表明魚類FATP1可能在LC-PUFA的運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。人類和小鼠的研究表明，F(xiàn)ATP1能夠促進(jìn)脂質(zhì)從骨骼肌和脂肪組織向肝臟的再分配[24-25]。在大西洋鮭魚(Salmosalar)中，在內(nèi)臟脂肪中觀察到高表達(dá)的FATP1，其次是紅肌、白肌和心臟，但在肝臟中檢測不到FATP1表達(dá)[26]。這與在紅鰭東方鲀身上觀察到的情況有很大的不同。這種差異可能與紅鰭東方鲀主要用肝臟儲(chǔ)存脂肪有關(guān)[27]。

圖6 饑餓時(shí)間對(duì)大菱鲆和紅鰭東方鲀肝臟FATP表達(dá)的影響Fig.6 Effects of starvation time on liver FATP expression of Scophthalmus maximus and Takifugu rubripes

不同物種腸道中普遍存在高表達(dá)的FATP4，推測FATP4在食物脂質(zhì)吸收中發(fā)揮作用[19,28]，盡管FATP4促進(jìn)脂肪酸攝取的機(jī)制在不同的研究中存在一定的爭議[29-30]。小鼠FATP4在LC-PUFA激活和?；o酶A合成酶中發(fā)揮作用[31]。在不同的研究中，除腸外，F(xiàn)ATP4在大腦內(nèi)的高表達(dá)也是一致的[9,32-33]，證實(shí)了FATP4在運(yùn)輸大腦中富含的LC-PUFA中的作用[34]。

FATP6作為哺乳動(dòng)物心臟中的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，在心臟與另一種FATP——CD36共定位，增加LCFA的攝取[35]。在大菱鲆消化道和紅鰭東方鲀肝臟中FATP6的高表達(dá)表明了FATP6在不同物種間的功能差異。

3.3 飼料脂肪水平對(duì)大菱鲆和紅鰭東方鲀肝臟FATP mRNA表達(dá)的影響

考慮到FATP在脂質(zhì)運(yùn)輸中的作用，通常假設(shè)高飼料脂肪水平會(huì)上調(diào)FATPmRNA的表達(dá)。在大鼠肌肉中的FATP1中確實(shí)觀察到了這一點(diǎn)[36]。在大西洋鮭魚的前脂肪細(xì)胞分化過程中也觀察到FATP1表達(dá)的上調(diào)[6]。低表達(dá)的FATP1、FATP4和FATP6甚至被用來指示飼料添加劑對(duì)草魚的降脂作用[7]。然而，本研究中并沒有在所有FATP中觀察到高脂飼料對(duì)FATP表達(dá)的顯著上調(diào)。與對(duì)照組相比，飼料脂肪水平為16.0%組菱鲆的肝臟FATP4和FATP6的mRNA相對(duì)表達(dá)量略有升高，飼料脂肪水平為16.0%組的紅鰭東方鲀的肝臟FATP1和FATP6的mRNA相對(duì)表達(dá)量略有升高。

在尼羅羅非魚的試驗(yàn)中[37]，高飼料脂肪水平在60 d時(shí)上調(diào)了腸道中FATP1的表達(dá)，但在90 d時(shí)下調(diào)了該基因的表達(dá)，表明這種影響具有時(shí)間依賴性[38]。在大黃魚飼養(yǎng)10周的試驗(yàn)中，觀察到高飼料脂肪水平下調(diào)了肌肉中FATP1的表達(dá)，但對(duì)腹膜內(nèi)脂肪組織中FATP1的表達(dá)無顯著影響[39]。在斑馬魚中，觀察到FATP表達(dá)對(duì)高脂飼料的更復(fù)雜的反應(yīng)[40]。高飼料脂肪水平上調(diào)了肝臟和腸道中FATP2和FATP4的表達(dá)，下調(diào)了肌肉中FATP1b、FATP2和FATP4的表達(dá)[40]。FATP表達(dá)對(duì)飼料脂肪水平的復(fù)雜響應(yīng)可能與FATP的雙向功能有關(guān)。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)ATP1主要參與脂肪酸的攝取，而不是脂肪酸的外排，但其他對(duì)小鼠和敘利亞倉鼠的研究表明，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體也可能介導(dǎo)脂肪酸的外排，即促進(jìn)向細(xì)胞外的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)[41-42]。

與飼料脂肪水平的研究相比，更多的魚類研究揭示了FATP表達(dá)對(duì)飼料中不同脂肪來源或脂肪酸組成的響應(yīng)[9,43]。與魚油相比，大西洋鮭魚飼料中的植物油混合物下調(diào)了白色肌肉和內(nèi)臟白色脂肪組織中FATP1的表達(dá)，但對(duì)心臟、紅肌和肌隔中FATP1的表達(dá)沒有顯著影響[26]。最近一項(xiàng)在金頭鯛(Sparusaurata)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的研究顯示，亞麻油酸(LA)和亞麻酸(ALA)以及它們的混合物能夠使FATP1的表達(dá)明顯上調(diào)，這被認(rèn)為能夠使得這些脂肪酸處理過的細(xì)胞中的脂質(zhì)含量能夠升高[44]。在大黃魚中，與魚油相比，飼料中富含亞麻油也能上調(diào)肝臟FATP1的表達(dá)[45]。另一項(xiàng)對(duì)黃顙魚(PelteobagrusFulvidraco)原代肝細(xì)胞的研究表明，棕櫚酸(PA)和油酸(OA)傾向于下調(diào)FATP4的表達(dá)[46]。在雌性斑馬魚發(fā)育卵巢和金鯧魚(Trachinotusovatus)肝臟中，LC-PUFA分別上調(diào)FATP4和FATP6的表達(dá)[47-48]。FATP表達(dá)對(duì)飼料的復(fù)雜反應(yīng)也可能與每個(gè)FATP都有特定的配體和親和力有關(guān)。此外，膜FATP作為代謝活動(dòng)變化的復(fù)雜反應(yīng)也有很大關(guān)系[49]。當(dāng)然，本試驗(yàn)中，因?yàn)轱暳现舅降纳仙殡S著飼料中α-淀粉含量的下降，因此，雖然尚未有研究闡述淀粉對(duì)FATP表達(dá)的影響，但是這個(gè)影響因素也值得關(guān)注。

3.4 饑餓時(shí)間對(duì)大菱鲆和紅鰭東方鲀肝臟FATP mRNA表達(dá)的影響

在脂肪酸被靶向β-氧化的組織中，需要FATP來促進(jìn)脂肪酸的攝取和沉積[50-51]。本試驗(yàn)中肝臟相關(guān)FATP表達(dá)結(jié)果說明大菱鲆和紅鰭東方鲀的肝臟是脂肪酸β-氧化的重要部位。饑餓對(duì)FATP表達(dá)的刺激在其他物種中也有觀察到。斑馬魚肝臟FATP1a，腸道FATP4和FATP6以及肌肉FATP1b、FATP4和FATP6的表達(dá)在饑餓條件下顯著上調(diào)[40]。在銀鯧(Pampusargteus)幼魚中，即使是短期(<6 d)的饑餓也會(huì)上調(diào)肝臟中FATP1的表達(dá)[52]。另一項(xiàng)對(duì)虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的研究表明，禁食(15、25和35 d)增加了白肌、紅肌和脂肪組織中FATP1的mRNA相對(duì)表達(dá)量[53]。然而，在大西洋鮭魚中，禁食2周后，脂肪組織中FATP1的mRNA相對(duì)表達(dá)量減少，表明脂肪酸攝取和沉積減少[54]。不同研究中FATP1對(duì)饑餓的不同反應(yīng)可能是由于不同物種和組織間的FATP功能多樣化所致。例如，增加小鼠骨骼肌FATP1表達(dá)的目標(biāo)是氧化脂肪酸，但魚類組織的情況可能不同[50]。令人遺憾的是，本研究沒有包括其他FATP亞型，即FATP2、FATP3和FATP5。未來的研究需要致力于這些FATP亞型在魚體中的特征研究。

4 結(jié) 論

① 大菱鲆和紅鰭東方鲀FATP表達(dá)的組織分布模式不同，但FATP表達(dá)對(duì)飼料脂肪水平和饑餓時(shí)間的響應(yīng)相似。

② 大菱鲆FATP1在大腦、心臟、眼睛和腎臟中高表達(dá)，而紅鰭東方鲀FATP1在肝臟中高表達(dá)。大菱鲆FATP6在幽門盲腸和前腸中高表達(dá)，而紅鰭東方鲀FATP6僅在肝臟中高表達(dá)。

③ 在大菱鲆和紅鰭東方鲀中，飼料脂肪水平對(duì)肝臟FATP的表達(dá)均無顯著影響。饑餓可上調(diào)紅鰭東方鲀肝臟FATP1、FATP4和FATP6以及大菱鲆肝臟FATP1的表達(dá)。