王嘉麟 許悅雯* 王勝男 邱曉媛 吳鵬鑫 高振華 趙志輝 于 輝 尹福泉**

(1.廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，湛江 524088；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528225)

羔羊斷奶期間，由于外界環(huán)境變化、母子分離以及飼糧改變等，使羔羊產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力和免疫功能下降[1-3]，進(jìn)而降低羔羊抵抗力，影響其生長(zhǎng)發(fā)育。以往，可應(yīng)用抗生素緩解羔羊斷奶應(yīng)激所產(chǎn)生的負(fù)面影響，但隨著我國(guó)飼料“禁抗”法律的實(shí)施，對(duì)于尋找天然抗生素替代品已成為行業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)[4]。巖藻多糖是于1913年從海藻中提取出的一種帶負(fù)電荷和高度吸濕性的硫酸多糖[5-6]，主要來(lái)源于海藻的細(xì)胞外基質(zhì)，核心成分為巖藻糖，并具有中性糖和硫酸基的復(fù)雜分支。大量研究表明，巖藻多糖擁有廣泛的藥理活性和潛在的安全性，如抗癌、抗氧化、抗病毒、抗凝血、抗炎以及增加免疫活性[7-11]等。巖藻多糖作為飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中，能夠提高斷奶仔豬的抗氧化能力和免疫功能，并且對(duì)采食量、腸道形態(tài)及微生物菌群等方面也有促進(jìn)作用[12-13]。我們前期研究結(jié)果表明，飼糧中添加巖藻多糖可提高羔羊生長(zhǎng)性能、抗氧化能力和免疫功能，改善小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)[3]。但是，鮮有巖藻多糖對(duì)反芻動(dòng)物肝臟功能和抗氧化能力以及脾臟抗氧化能力和免疫功能影響的報(bào)道。因此，本研究提出進(jìn)一步假設(shè)，巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊肝臟和脾臟的免疫功能以及抗氧化能力均有積極影響，探究飼糧中添加巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊的器官指數(shù)、肝功能相關(guān)酶活性、肝臟和脾臟抗氧化指標(biāo)以及脾臟免疫指標(biāo)的影響，為巖藻多糖作為天然“替抗劑”改善幼齡反芻動(dòng)物健康提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中使用的巖藻多糖由青島某生物科技有限公司提供，呈黃色粉末狀，具有海藻氣味，純度為98%，硫酸基含量為28.9%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2021年4月至2021年6月在廣東省湛江市雷羊牧業(yè)有限公司進(jìn)行。選用60只健康且體重相近的2月齡斷奶川中黑山羊(去勢(shì)公羔)，隨機(jī)分為4個(gè)組，每組15個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只羊。對(duì)照組(CON組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組(F1、F2和F3組)分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0.1%、0.3%和0.5%的巖藻多糖，巖藻多糖添加水平參考Yang等[3]。預(yù)試期7 d，正試期30 d。羔羊平均初始體重為(12.5±0.5) kg，均在2月齡時(shí)人工斷奶?；A(chǔ)飼糧參照我國(guó)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 861—2004)的營(yíng)養(yǎng)要求配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

在試驗(yàn)開始前打掃羊舍、消毒處理。先進(jìn)行為期7 d的預(yù)試驗(yàn)，預(yù)試驗(yàn)期間對(duì)羔羊編號(hào)、驅(qū)蟲、接種疫苗。每天08：30和17：30各飼喂1次，將每日飼喂的巖藻多糖均勻拌入精料中，先精后粗，自由飲水。飼養(yǎng)期間各組飼喂方式、試驗(yàn)環(huán)境及管理模式均相同。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

1.3 樣品采集

1.3.1 血清樣品采集

在試驗(yàn)第15天和第30天晨飼前，通過(guò)頸靜脈采血，每只羊采血10 mL于促凝采血管中。采血管靜置待有血清析出后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，將血清轉(zhuǎn)移至2.0 mL無(wú)酶管中，-80 ℃保存，用于檢測(cè)肝功能相關(guān)指標(biāo)。

1.3.2 肝臟和脾臟樣品采集

在試驗(yàn)第31天，每組隨機(jī)選擇6只羊，采用頸動(dòng)脈放血法屠宰，屠宰前禁食、禁水12 h，采集肝臟和脾臟組織于2.0 mL無(wú)酶離心管中，編號(hào)，轉(zhuǎn)入液氮中速凍，之后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存，用于檢測(cè)肝臟和脾臟抗氧化指標(biāo)及脾臟免疫指標(biāo)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 肝臟和脾臟指數(shù)

試驗(yàn)結(jié)束后，取出肝臟和脾臟，吸掉其表面多余血液后分別稱重，并按照以下公式計(jì)算肝臟指數(shù)與脾臟指數(shù)：

肝臟指數(shù)(%)=100×肝臟重量(g)/羊活體重(kg)；脾臟指數(shù)(%)=100×脾臟重量(g)/羊活體重(kg)。

1.4.2 肝功能相關(guān)指標(biāo)

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)活性均使用相應(yīng)試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測(cè)，操作時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

中國(guó)上海，2017年10月26日，惠氏營(yíng)養(yǎng)品孕產(chǎn)婦及嬰幼兒奶粉創(chuàng)新趨勢(shì)品牌BabyNes?12+貝睿思TM中國(guó)大陸概念體驗(yàn)店，在上海時(shí)尚生活新地標(biāo)興業(yè)太古匯盛大開幕。作為配方奶粉市場(chǎng)的高端品牌，來(lái)自瑞士的BabyNes?12+貝睿思TM營(yíng)養(yǎng)系統(tǒng)，旨在為寶寶和媽媽提供科學(xué)創(chuàng)新的喂養(yǎng)方式和營(yíng)養(yǎng)方案。此次，更創(chuàng)新推出概念體驗(yàn)店，開啟了奶粉品類體驗(yàn)式購(gòu)物新模式。作為一名BabyNes?12+貝睿思TM營(yíng)養(yǎng)系統(tǒng)的用戶，正在母乳喂養(yǎng)中的郭晶晶也到現(xiàn)場(chǎng)，見(jiàn)證了這一意義非凡的時(shí)刻，分享再為人母的感受與育兒理念。

1.4.3 肝臟和脾臟抗氧化指標(biāo)

將肝臟和脾臟組織制成10%的勻漿，離心取上清。肝臟和脾臟丙二醛(MAD)、過(guò)氧化氫(H2O2)含量及總抗氧化能力(T-AOC)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性均使用相應(yīng)試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測(cè)，操作時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.4 脾臟免疫指標(biāo)

脾臟腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)含量均使用相應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)檢測(cè)，操作時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel 2019進(jìn)行預(yù)處理，之后使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中添加巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊肝臟和脾臟指數(shù)的影響

如表2所示，各組之間斷奶羔羊的肝臟和脾臟指數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表2 飼糧中添加巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊肝臟和脾臟指數(shù)的影響Table 2 Effects of dietary fucoidan on liver and spleen indexes of weaned goat kids (n=6) %

2.2 飼糧中添加巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊肝功能相關(guān)指標(biāo)的影響

2.3 飼糧中添加巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

如表4所示，與CON組相比，F(xiàn)1、F2和F3組斷奶羔羊肝臟MDA含量分別顯著降低了20.93%、38.95%和38.95%(P<0.05)，且F1組肝臟MDA含量顯著高于F2和F3組(P<0.05)。與CON組相比，F(xiàn)1、F2和F3組斷奶羔羊肝臟H2O2含量分別顯著降低了37.07%、41.97%和55.02%(P<0.05)，且F1和F2組肝臟H2O2含量顯著高于F3組(P<0.05)。與CON組相比，F(xiàn)2和F3組斷奶羔羊肝臟GSH-Px活性分別顯著提高了20.57%和13.80%(P<0.05)，且F1組肝臟GSH-Px活性顯著低于F2和F3組(P<0.05)。各組之間斷奶羔羊肝臟CAT、T-SOD活性和T-AOC差異不顯著(P>0.05)。

表3 飼糧中添加巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊肝功能相關(guān)指標(biāo)的影響 Table 3 Effects of dietary fucoidan on liver function related indexes of weaned goat kids (n=6) U/L

表4 飼糧中添加巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of dietary fucoidan on liver antioxidant indexes of weaned goat kids (n=6)

2.4 飼糧中添加巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊脾臟抗氧化指標(biāo)的影響

如表5所示，與CON組相比，F(xiàn)1、F2和F3組斷奶羔羊脾臟H2O2含量分別顯著降低了10.63%、23.15%和23.09%(P<0.05)，且F1組脾臟H2O2含量顯著高于F2和F3組(P<0.05)。與CON組相比，F(xiàn)2和F3組斷奶羔羊脾臟CAT活性分別顯著提高了10.01%和21.05%(P<0.05)，且F1、F2和F3組之間脾臟CAT活性差異顯著(P<0.05)。與CON組相比，F(xiàn)2和F3組斷奶羔羊脾臟T-SOD活性分別顯著提高了10.32%和13.10%(P<0.05)，且F2和F3組脾臟T-SOD活性顯著高于F1組(P<0.05)。各組之間斷奶羔羊肝臟MDA含量、GSH-Px活性以及T-AOC差異不顯著(P>0.05)。

表5 巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊脾臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of dietary fucoidan on spleen antioxidant indexes of weaned goat kids (n=6)

2.5 飼糧中添加巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊脾臟免疫指標(biāo)的影響

如表6所示，與CON組相比，F(xiàn)1、F2和F3組斷奶羔羊脾臟TNF-α含量分別顯著降低了17.99%、41.93%和46.15%(P<0.05)，且F1組脾臟TNF-α含量顯著高于F2和F3組(P<0.05)。與CON組相比，F(xiàn)1、F2和F3組斷奶羔羊脾臟IL-6含量分別顯著降低了21.11%、41.34%、62.57%(P<0.05)，F(xiàn)2和F3組脾臟IL-1β含量分別顯著降低了22.24%和34.13%(P<0.05)，F(xiàn)1、F2和F3組脾臟IL-2含量分別顯著提高了78.96%、170.56%和271.50%(P<0.05)，F(xiàn)1、F2和F3組脾臟IL-10含量分別顯著提高了23.71%、47.69%、65.69%(P<0.05)，且F1、F2和F3組之間脾臟IL-1β、IL-2、IL-6和IL-10含量差異顯著(P<0.05)。

表6 飼糧中添加巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊脾臟免疫指標(biāo)的影響Table 6 Effects of dietary fucoidan on spleen immune indexes of weaned goat kids (n=6) pg/mg prot

3 討 論

3.1 飼糧中添加巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊肝功能的影響

肝臟是外源性物質(zhì)與藥物代謝的主要器官，ALT、AST和LDH是分布在肝細(xì)胞質(zhì)、線粒體中的重要酶類，其活性是評(píng)價(jià)肝功能的重要指標(biāo)[14]。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，產(chǎn)生的自由基會(huì)破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器，使肝細(xì)胞腫脹甚至壞死，與此同時(shí)ALT、AST和LDH從細(xì)胞釋放入血，引起血清ALT、AST和LDH活性增加[15]，最終殺死有害細(xì)胞。Jeong等[16]和Zhang等[17]研究表明，多糖可有效抑制肝臟損傷所導(dǎo)致的血清ALT、AST和LDH活性的升高，維持肝細(xì)胞膜的穩(wěn)定和加強(qiáng)肝臟組織損傷的修復(fù)，增強(qiáng)抗氧化作用，減輕病理?yè)p傷。而巖藻多糖目前雖然并未明確納入我國(guó)飼料添加劑目錄中，但其對(duì)動(dòng)物除了有抗腫瘤[18-19]、抗糖尿病[20]、抗凝血[21]等藥理作用外，也在肝臟的保護(hù)方面有積極影響[22]。研究發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖可通過(guò)其抗氧化活性改善黃曲霉毒素B1引起的肝臟和腎臟功能損害，其抗氧化活性可有效降低尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)血清ALT和AST活性[23]。本研究結(jié)果中，飼糧中添加巖藻多糖能有效降低血清AST和LDH活性，其中添加0.3%巖藻多糖在第30天時(shí)能顯著降低血清AST活性，添加0.3%和0.5%巖藻多糖在第15天和第30天時(shí)均能顯著降低血清LDH活性。這與Wang等[24]和Jeong等[16]的研究結(jié)果一致，表明巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊肝臟具有積極的保護(hù)作用，增強(qiáng)肝臟功能，有效防止肝臟損傷，穩(wěn)定機(jī)體健康。

3.2 飼糧中添加巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊肝臟和脾臟抗氧化能力的影響

在畜禽生產(chǎn)中，由于自然環(huán)境、外界因素以及體內(nèi)物質(zhì)代謝的影響，動(dòng)物機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量自由基。然而，過(guò)多的自由基則會(huì)氧化機(jī)體正常細(xì)胞和組織，繼而抑制各種抗氧化酶的活性，引起各種疾病的發(fā)生[25]，導(dǎo)致畜禽生長(zhǎng)性能下降和飼養(yǎng)成本的增加，不利于畜牧業(yè)的發(fā)展。有研究表明，攝入多糖能夠提高機(jī)體清除自由基的能力，維持體內(nèi)氧化還原的動(dòng)態(tài)平衡[26-27]。本研究結(jié)果表明，飼糧中添加巖藻多糖能提高肝臟GSH-Px活性，降低肝臟MDA和H2O2含量，且肝臟CAT活性也呈上升趨勢(shì)。相似的，楊晉[28]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加巖藻多糖可以提高仔豬血清SOD、GSH-Px和CAT活性，并降低血清MDA含量。此外，本研究結(jié)果同樣與Yang等[3]、Zhao等[29]和Song等[30]的研究結(jié)果一致。此外，飼糧中添加巖藻多糖能提高脾臟CAT和T-SOD活性，降低脾臟H2O2含量，這與郭廣振等[4]、姜秀梅等[31]和劉功成等[32]的研究結(jié)果一致。這些研究結(jié)果表明，巖藻多糖能夠減輕機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，增強(qiáng)超氧陰離子自由基的清除效率，提高脾臟細(xì)胞內(nèi)H2O2的催化分解，防止過(guò)高含量的H2O2對(duì)機(jī)體組織造成損傷。但是，本研究表明巖藻多糖對(duì)于斷奶羔羊肝臟和脾臟指數(shù)并無(wú)顯著影響，這與郭廣振等[4]研究結(jié)果不盡相同，可能與飼糧種類、巖藻多糖添加量和飼喂次數(shù)等因素不同有關(guān)?？偟膩?lái)說(shuō)，飼糧中添加巖藻多糖能夠提高斷奶羔羊肝臟和脾臟的抗氧化能力。

3.3 飼糧中添加巖藻多糖對(duì)斷奶羔羊脾臟免疫功能的影響

脾臟為機(jī)體中最重要的免疫器官，在脾臟等防御器官受到刺激時(shí)會(huì)產(chǎn)生并分泌一系列細(xì)胞免疫因子，其主要參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)和炎癥應(yīng)答[33]。炎癥是免疫系統(tǒng)對(duì)潛在有害刺激的最初反應(yīng)，各種外來(lái)抗原可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞向接觸部位遷移，產(chǎn)生并釋放如一氧化氮(NO)、TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子增強(qiáng)單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞向損傷部位趨化，提高或激活炎性應(yīng)答，增加了組織損傷的風(fēng)險(xiǎn)，從而促進(jìn)炎癥的延長(zhǎng)[34-36]。而產(chǎn)生的IL-2和IL-10等抗炎因子會(huì)控制炎性反應(yīng)，從而使機(jī)體免疫狀態(tài)不受損害。因此，抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生或功能是控制炎癥的關(guān)鍵機(jī)制。大量研究表明，過(guò)度的炎癥會(huì)破壞機(jī)體健康的組織結(jié)構(gòu)，而多糖具有提高脾臟免疫抗炎功能的作用，可激活各種免疫細(xì)胞以及分泌多種細(xì)胞因子，為天然的免疫調(diào)節(jié)劑[32,37-38]。如Lee等[39]研究發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖通過(guò)下調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)和促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平，顯著抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞中的NO產(chǎn)生；Ni等[40]同樣發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖能抑制前列腺素E2(PGE2)以及促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的合成，從而降低炎癥反應(yīng)，提高免疫能力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加巖藻多糖能降低羔羊脾臟中促炎因子TNF-α、IL-6與IL-1β含量，這與上述試驗(yàn)結(jié)果一致，并提高脾臟中抗炎因子IL-2與IL-10含量，這與Choi等[41]和路垚等[42]的研究結(jié)果一致。由此可見(jiàn)，巖藻多糖能夠減少促炎因子的產(chǎn)生，進(jìn)而減少炎性應(yīng)答，降低組織受傷幾率，還能提高抗炎因子的生成，從而調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)羔羊脾臟免疫功能，進(jìn)而整體提高并改善羔羊的免疫功能。

4 結(jié) 論

飼糧中添加巖藻多糖能夠有效改善斷奶羔羊的肝功能，提高肝臟和脾臟抗氧化能力，增強(qiáng)脾臟免疫功能。在本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加0.3%巖藻多糖為宜。