王思甜 鄭麗云 齊 雅 劉志鵬 郭雙雙 侯永清 張正帆 丁斌鷹

(武漢輕工大學動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室，武漢 430023)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)是引起豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)的病原，可引起新生仔豬嘔吐、腹瀉和脫水，感染后死亡率接近100%[1]。目前，我國養(yǎng)豬業(yè)正處于從散養(yǎng)到集約化迅速轉(zhuǎn)變的階段，商品豬運輸流通更加頻繁，為PEDV的傳播和變異制造了更加有利的條件，給我國養(yǎng)殖業(yè)帶來潛在威脅[1]。高劑量(2 000～3 000 mg/kg)氧化鋅(ZnO)可降低斷奶14 d內(nèi)仔豬的腹瀉率[2]。高鋅主要通過抑菌提高機體抗氧化、抗炎癥能力，參與酶和激素合成，加強合成代謝，從而降低腹瀉率，促進仔豬生長[3]。由于土壤鋅富集和畜產(chǎn)品殘留等問題，歐盟決定于2022年全面禁止使用斷奶仔豬高鋅飼糧，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也規(guī)定仔豬斷奶后2周飼糧中ZnO形式的鋅添加量上限為1 600 mg/kg[3-6]。同時，ZnO對PEDV感染仔豬抗腹瀉的作用機制尚不明確。因此，本試驗擬通過建立PEDV感染模型，研究ZnO對新生階段仔豬抗PEDV的影響，為有機鋅等ZnO替代物在幼齡仔豬生產(chǎn)中的應用提供數(shù)據(jù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

PEDV(YN株)由華中農(nóng)業(yè)大學微生物重點實驗室提供。ZnO(含量≥95%)購自南京某生物科技有限公司。

1.2 試驗設計

本試驗采用完全隨機區(qū)組設計，將24頭平均體重為(2.5±0.2) kg的健康7日齡仔豬(杜×長×大)隨機分成4組，分別為對照組、ZnO組、PEDV組和PEDV+ZnO組，每組6個重復，每個重復1頭豬。試驗期12 d，分為感染前(第1～8天)和感染后(第9～12天)2個階段。ZnO組和PEDV+ZnO組每日口腔灌服100 mg/kg BW ZnO，另外2組則每日口腔灌服相同體積的液體代乳料。試驗第9天07：00，PEDV組和PEDV+ZnO組每頭豬灌服1 mL 106TCID50(50%組織培養(yǎng)感染劑量)的PEDV溶液，對照組與ZnO組灌服相同體積磷酸鹽緩沖溶液(PBS)。試驗用代乳料購于中國牧工商集團有限公司，主要成分為全脂奶粉和大豆磷脂，其營養(yǎng)水平見表1，飼喂時添加0.1‰維生素預混料，該維生素預混料可為每千克代乳料提供維生素A 12 500 IU、維生素D32 800 IU、維生素E 30 IU、維生素K 5 mg、維生素B13 mg、維生素B210 mg、維生素B68 mg、煙酸40 mg，維生素B1240 μg、D-泛酸 15 mg、葉酸1 mg、生物素0.08 mg。

表1 代乳料營養(yǎng)水平Table 1 Nutrient levels of milk replacer %

1.3 飼養(yǎng)管理

本試驗在湖北省武漢市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所進行。試驗采用全封閉式豬舍，對照組和ZnO組飼養(yǎng)在一間豬舍，PEDV組與PEDV+ZnO組飼養(yǎng)在另一間豬舍。2間豬舍建筑設計完全一致，試驗期舍內(nèi)溫度為(32±2) ℃，相對濕度為60%～70%。試驗仔豬分欄飼養(yǎng)于2 m×3 m的漏縫式地板圈內(nèi)，每天清掃豬舍1次，并用聯(lián)滅、百盛、百毒殺等消毒液交替噴灑消毒欄舍。試驗代乳料用45～55 ℃的溫水沖泡，分別在07:30、11:00、15:00、18:30、21:00分5次飼喂，在早、中、晚各增喂1次溫水。

1.4 檢測指標與方法

1.4.1 生長性能

于試驗第1、9和12天的07:30空腹稱重，記錄每頭仔豬體重，每天記錄仔豬采食量，并計算平均日增重(average daily gain，ADG)和料重比(feed to gain ratio，F(xiàn)/G)，計算公式如下：

ADG=總增重/試驗天數(shù)；F/G=每頭仔豬總采食量/每頭仔豬總增重。

1.4.2 腹瀉指數(shù)

整個試驗期間每天觀察并記錄仔豬健康狀況和腹瀉發(fā)生情況。按照糞便形態(tài)進行評分，被分為4個等級：0=正常，1=糊狀，2=半液體，3=液體，得分≥2視為腹瀉[7]。按如下公式計算腹瀉指數(shù)：

腹瀉指數(shù)(%)=(每頭仔豬糞便評分之和/觀察總天數(shù))×100。

1.4.3 血清生化指標

于試驗第12天06:00，所有仔豬均口服10%D-木糖(1 mL/kg BW)，1 h后對所有仔豬進行前腔靜脈采血。使用全自動生化分析儀(日立HITEC-7100，日本)，采用試劑盒(購自富士膠片和光純耀化學有限公司)測定血清總膽紅素(TB)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、鈣(Ca)、磷(P)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、直接膽紅素(DB)含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、乳酸脫氫酶(LDH)活性。

1.4.4 腸道屏障功能指標

所有仔豬采血后用50 mg/kg BW戊巴比妥鈉肌肉注射麻醉后屠宰取樣，收集腸道樣品，參照Vilaseca等[8]的方法對腸道損傷進行評分，分為4個等級：0=沒有肉眼可見出血點；1=偶有損傷(腸道有零星有出血點)；2=肉眼可見明顯損傷(腸道出現(xiàn)潰瘍，腸壁變薄變透)；3=腸道潰瘍、糜爛，腸壁嚴重變薄變透并充血。評分后取樣并貯存于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、透明和石蠟包埋后進行切片，蘇木精-伊紅染色后晾干制片。使用光學顯微鏡(Olympus，日本)觀察切片并記錄絨毛高度(villous height，VH)、隱窩深度(crypt depth，CD)以及絨毛表面積(villous area，VA)，計算絨毛高度/隱窩深度比值(VH/CD)。

血清D-木糖含量和二胺氧化酶(DAO)活性均按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書中提供的方法和步驟進行測定。

1.4.5 血清和腸道抗氧化指標

稱取0.16～0.18 g腸道組織，剪碎混勻，按樣本重(g)∶生理鹽水(mL)=1∶9制備10%的組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清，-80 ℃保存用于測定腸道抗氧化指標。按試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)提供的方法，使用多功能酶標儀(Spectra Max M5，Molecular Devices，美國)測定血清和腸道中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性以及總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對感染前仔豬生長性能數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，對感染后的試驗數(shù)據(jù)進行雙因素方差分析(two-way ANOVA)，當組間差異顯著時，采用Duncan氏法進行多重比較。以P<0.05作為差異顯著性的評定標準，0.05≤P<0.10時表示有顯著趨勢。試驗結(jié)果用平均值±標準差表示。

2 結(jié) 果

2.1 ZnO對新生階段仔豬生長性能的影響

由表2可見，PEDV感染前，灌服ZnO后仔豬F/G顯著降低(P<0.05)，ADG有提高的趨勢(P=0.057)。由表3可見，仔豬感染PEDV后ADG顯著下降(P<0.05)，F(xiàn)/G顯著升高(P<0.05)；灌服ZnO有提高感染后仔豬ADG的趨勢(P=0.051)，并顯著降低F/G(P<0.05)；灌服ZnO和感染PEDV對仔豬F/G存在交互效應(P<0.05)。

表2 ZnO對PEDV感染前新生階段仔豬生長性能的影響Table 2 Effects of ZnO on growth performance of neonatal piglets before infected with PEDV (n=6)

表3 ZnO對PEDV感染新生階段仔豬生長性能的影響Table 3 Effects of ZnO on growth performance of neonatal piglets infected with PEDV (n=6)

2.2 ZnO對PEDV感染新生階段仔豬腹瀉指數(shù)的影響

試驗全期對照組和ZnO組仔豬均未出現(xiàn)腹瀉。由表4可知，仔豬感染PEDV后腹瀉指數(shù)顯著升高(P<0.05)，而灌服ZnO顯著降低感染PEDV仔豬腹瀉指數(shù)(P<0.05)。

表4 ZnO對PEDV感染新生階段仔豬腹瀉指數(shù)的影響Table 4 Effects of ZnO on diarrhea index of neonatal piglets infected with PEDV (n=6)

2.3 ZnO對PEDV感染新生階段仔豬血清生化指標的影響

由表5可知，仔豬感染PEDV后血清TC、P、LDL、HDL含量和ALT、ALP、GGT、LDH活性顯著下降(P<0.05)，血清GLU含量顯著升高(P<0.05)；灌服ZnO能顯著降低仔豬血清ALT活性(P<0.05)，顯著增加血清GGT活性(P<0.05)；灌服ZnO和感染PEDV對仔豬血清LDH活性存在交互作用(P<0.05)。

表5 ZnO對PEDV感染新生階段仔豬血清生化指標的影響Table 5 Effects of ZnO on serum biochemical indexes of neonatal piglets infected with PEDV (n=6)

2.4 ZnO對PEDV感染新生階段仔豬腸道評分和腸道吸收相關(guān)指標的影響

由表6可知，仔豬感染PEDV后十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的腸道評分以及血清DAO活性顯著提高(P<0.05)，血清D-木糖含量顯著降低(P<0.05)；灌服ZnO能顯著降低仔豬空腸腸道評分和血清DAO活性(P<0.05)，顯著增加血清D-木糖含量(P<0.05)；灌服ZnO和感染PEDV對仔豬空腸腸道評分和血清DAO活性存在交互作用(P<0.05)。

表6 ZnO對PEDV感染新生階段仔豬腸道評分和腸道吸收相關(guān)指標的影響Table 6 Effects of ZnO on intestinal score and intestinal absorption-related indexes of neonatal piglets infected with PEDV (n=6)

2.5 ZnO對PEDV感染新生階段仔豬腸道形態(tài)的影響

由表7可知，仔豬感染PEDV后空腸和十二指腸VH，十二指腸、空腸、回腸VA顯著下降(P<0.05)，空腸、回腸CD顯著下降(P<0.05)，結(jié)腸CD顯著增加(P<0.05)，十二指腸和回腸VH/CD顯著下降(P<0.05)；灌服ZnO顯著提高仔豬十二指腸、空腸和回腸VH和CD(P<0.05)，顯著提高仔豬十二指腸、空腸VA(P<0.05)；灌服ZnO和感染PEDV對仔豬空腸CD和VA以及十二指腸VH/CD存在交互作用(P<0.05)。

表7 ZnO對PEDV感染新生階段仔豬腸道形態(tài)的影響Table 7 Effects of ZnO on intestinal morphology of neonatal piglets infected with PEDV (n=6)

續(xù)表7項目Items-ZnO-PEDV+PEDV+ZnO-PEDV+PEDVP值P-valuePEDVZnOPEDV×ZnO空腸Jejunum23158.10±3634.04b10355.88±3045.54c36244.51±7948.18a13516.66±2802.27c<0.0010.0010.021回腸Ileum25161.34±3881.3212297.98±2843.9124575.99±3926.3314190.55±3609.80<0.0010.6670.417絨毛高度/隱窩深度VH/CD十二指腸Duodenum2.28±0.18a1.72±0.12c2.08±0.09b1.88±0.18c<0.0010.7170.010空腸Jejunum2.04±0.071.87±0.342.01±0.051.88±0.090.0510.9190.817回腸Ileum2.02±0.041.78±0.112.03±0.081.90±0.10<0.0010.0890.112

2.6 ZnO對PEDV感染新生階段仔豬血清和腸道抗氧化指標的影響

由表8可知，仔豬感染PEDV后血清GSH-Px和T-SOD活性顯著下降(P<0.05)；灌服ZnO能顯著提高PEDV感染仔豬血清CAT活性(P<0.05)。灌服ZnO和感染PEDV對仔豬血清CAT活性存在交互作用(P<0.05)。

表8 ZnO對PEDV感染新生階段仔豬血清抗氧化指標的影響Table 8 Effects of ZnO on serum antioxidant indexes of neonatal piglets infected with PEDV (n=6)

由表9可知，仔豬感染PEDV后十二指腸和空腸GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)；灌服ZnO能顯著提高PEDV感染仔豬空腸GSH-Px活性(P<0.05)。仔豬感染PEDV后空腸CAT活性顯著下降(P<0.05)；灌服ZnO能顯著提高PEDV感染仔豬空腸CAT和T-SOD活性(P<0.05)。灌服ZnO和感染PEDV對仔豬空腸GSH-Px和T-SOD活性存在交互作用(P<0.05)。灌服ZnO顯著降低了PEDV感染仔豬十二指腸MDA含量(P<0.05)。仔豬感染PEDV后空腸T-AOC顯著下降(P<0.05)。灌服ZnO和感染PEDV對仔豬十二指腸MDA含量與結(jié)腸H2O2含量以及空腸GSH-Px和T-SOD活性、T-AOC存在交互作用(P<0.05)。

3 討 論

本試驗中仔豬感染PEDV后出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和脫水癥狀，平均日增重顯著降低，與PEDV感染癥狀相符[9]。研究表明，ZnO能保持小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，促進腸絨毛生長和腸黏膜損傷修復，增加緊密連接蛋白表達，緩解腸道形態(tài)和通透性的改變，具有收斂作用，可避免病原附著和腹瀉[10]。本試驗中，灌服ZnO后感染PEDV仔豬料重比與腹瀉評分顯著降低，說明ZnO能有效改善PEDV感染引起的生長性能下降。與本試驗結(jié)果一致，Zhang等[7]研究表明，灌服100 mg/kg BW ZnO可以改善PEDV感染仔豬的生長性能，降低腹瀉率。

表9 ZnO對PEDV感染新生階段仔豬腸道抗氧化指標的影響Table 9 Effects of ZnO on intestinal antioxidant indexes of neonatal piglets infected with PEDV (n=6)

動物血清生化指標受飼糧營養(yǎng)水平的影響，可以間接反映機體自身營養(yǎng)水平和健康狀況[11]。AST和ALT作為肝臟組織細胞中主要的氨基轉(zhuǎn)移酶，直接影響幼齡畜禽體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝水平[12]。本試驗結(jié)果表明，感染PEDV后，仔豬血清中ALT和ALP活性顯著下降，說明PEDV感染可能導致仔豬蛋白質(zhì)代謝水平下降。血清中TC含量可反映機體對脂肪代謝的能力，HDL和LDL是運輸膽固醇的載體，對維持機體脂類代謝穩(wěn)定起重要作用[13]。本研究結(jié)果表明，PEDV感染導致仔豬血清HDL、LDL和TC含量下降，說明PEDV感染可能阻礙了營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運。此外，本試驗結(jié)果還表明，PEDV感染后仔豬血清GLU含量顯著升高，LDH活性顯著下降，說明PEDV感染使機體的糖代謝能力下降，灌服ZnO并沒有緩解PEDV感染導致的糖代謝能力下降。

血清DAO活性和D-木糖含量可作為反映腸道屏障功能損傷的理想指標[14-15]。本試驗中，仔豬感染PEDV后，血清中DAO活性顯著升高，D-木糖含量顯著下降，說明仔豬的腸道黏膜因感染PEDV受到損傷，影響了仔豬的腸道吸收功能。同時，感染PEDV后，仔豬十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸的腸道評分顯著升高，說明PEDV感染導致仔豬腸道屏障功能損傷，灌服ZnO能有效緩解感染PEDV引起的空腸腸道評分上升。

PEDV感染仔豬會發(fā)生腹瀉，從而導致小腸黏膜萎縮、絨毛變短、隱窩加深[15-16]。有研究表明，ZnO可顯著提高斷奶仔豬的VH，降低CD，提高VH/CD[17]。湯俊[18]研究表明，仔豬在感染輪狀病毒后十二指腸和回腸CD下降。本試驗中，仔豬PEDV感染后，十二指腸和空腸VH顯著下降，結(jié)腸CD顯著升高，十二指腸、空腸和回腸VA以及十二指腸和回腸VH/CD顯著下降。灌服ZnO后，感染PEDV仔豬空腸VA顯著上升，說明ZnO能有效緩解仔豬感染PEDV引起的腸黏膜萎縮。

機體受到外界刺激后會產(chǎn)生大量氧自由基，從而導致機體受到氧化損傷，動物可經(jīng)過GSH-Px、CAT和T-SOD等抗氧化酶清除氧自由基[19-24]。MDA含量則用來判斷機體脂質(zhì)過氧化和細胞損傷程度，可作為體內(nèi)氧化應激的標志[25]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞外自由基的清除反應及機體體內(nèi)抗氧化劑之間的相互協(xié)作可通過T-AOC的強弱反映[26-27]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，仔豬感染PEDV后，血清GSH-Px活性顯著下降，十二指腸和空腸GSH-Px活性顯著上升。仔豬灌服ZnO后，血清CAT活性顯著上升，十二指腸MDA含量和結(jié)腸H2O2含量顯著下降，可能是PEDV感染導致仔豬機體發(fā)生自身免疫，從而使GSH-Px活性上升；血清CAT和T-SOD活性顯著下降，十二指腸和空腸T-AOC顯著下降，空腸MDA含量呈降低趨勢，說明PEDV感染可以引發(fā)機體氧化應激反應，造成氧化損傷。而灌服ZnO具有緩解感染PEDV引起的回腸GSH-Px活性下降與結(jié)腸H2O2含量上升以及空腸T-AOC下降的作用。

4 結(jié) 論

灌服100 mg/kg BW ZnO緩解了由感染PEDV導致的新生階段仔豬生長性能的下降，提高了腸道屏障功能和機體抗氧化能力。