李 帥 溫曉鹿 蔣宗勇 王 麗 高開國 肖 昊

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 農(nóng)業(yè)部華南動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，廣州 510640)

營養(yǎng)、管理、高溫等應(yīng)激因素以及繁殖時(shí)期的高合成代謝狀態(tài)會(huì)造成母豬機(jī)體代謝旺盛，產(chǎn)生氧化應(yīng)激[1]。研究表明，妊娠后期和泌乳期母豬機(jī)體氧化應(yīng)激嚴(yán)重，其會(huì)使母豬泌乳性能、產(chǎn)仔性能、仔豬成活率及健康水平降低[2]。因此，對妊娠或泌乳階段母豬進(jìn)行營養(yǎng)干預(yù)，如通過飼糧外源添加抗氧化劑和自由基清除劑，可通過母豬胎盤或乳汁方式傳遞抗氧化物質(zhì)來增強(qiáng)仔豬抗氧化能力，并改善母豬繁殖性能。

異黃酮-S(isoflavones-s，ISO-S)為純度99%的大豆異黃酮，是黃酮類的一種亞類化合物，常溫下性質(zhì)穩(wěn)定，在大豆中含量較多，主要分為游離型苷元和結(jié)合型糖苷兩大類。其主要成分包括染料木黃酮、黃豆黃苷、大豆苷元和生物鏈霉素A[3-4]，已被證明具有多種生物學(xué)特性，作為天然的植物雌激素[5]，具有抗氧化[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]、抗癌[8-9]以及抗炎癥[10-11]的功能。由于異黃酮可抑制自由基的產(chǎn)生并清除，誘導(dǎo)增強(qiáng)內(nèi)源抗氧化酶活性，近年來異黃酮的抗氧化作用已引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加異黃酮可增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，顯著緩解氧化應(yīng)激損傷；能有效緩解母豬氧化應(yīng)激，改善母豬乳腺發(fā)育，提高泌乳量和乳品質(zhì)，從而增加仔豬斷奶重和成活率[12]。同時(shí)，通過體外細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑異黃酮可緩解豬乳腺上皮細(xì)胞的氧化損傷，促進(jìn)細(xì)胞的增殖[13]。然而，關(guān)于補(bǔ)充ISO-S對母豬繁殖、免疫、泌乳性能的影響，以及其抗氧化功能能否傳遞給哺乳仔豬的研究報(bào)道仍很有限。因此，本試驗(yàn)旨在研究在妊娠后期及泌乳期母豬飼糧中添加ISO-S對母豬繁殖性能、抗氧化能力、免疫功能的影響，為緩解母豬氧化應(yīng)激、提高泌乳性能和改善仔豬生長發(fā)育提供可靠參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

ISO-S，純度為99%，由廣東某飼料科技有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧

試驗(yàn)選取20頭健康長大二元母豬配種后，按照體況、胎次均衡的原則將其為2組，每組10頭，每個(gè)重復(fù)1頭。對照組(CON組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，ISO-S組在基礎(chǔ)飼糧中添加40 mg/kg ISO-S。參考NRC(2012)母豬營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)配制妊娠期和泌乳期母豬玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)按規(guī)?；i場操作規(guī)程進(jìn)行，母豬在同一豬舍內(nèi)飼養(yǎng)。妊娠母豬限飼，泌乳母豬自由采食，自動(dòng)飲水器供水，每天準(zhǔn)確記錄母豬的采食量及母豬、仔豬健康情況，保持豬舍通風(fēng)、衛(wèi)生。妊娠第75天開展試驗(yàn)，試驗(yàn)期至斷奶結(jié)束。妊娠第75～90天每天每頭母豬飼喂2.4 kg飼糧；妊娠第91～115天每天每頭母豬飼喂2.8 kg飼糧。在整個(gè)試驗(yàn)期間出現(xiàn)母豬返情、流產(chǎn)、疾病和健康異常等不能客觀反映試驗(yàn)現(xiàn)象的母豬給予淘汰。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

續(xù)表1項(xiàng)目Items含量Contents妊娠期Gestationperiod泌乳期Lactationperiod總鈣TCa0.620.90總磷TP0.430.63有效磷AP0.260.41

1.4 采集樣本

1.4.1 血樣采集

母豬每頭都采樣，并在母豬妊娠第30、50、70、90、110天和哺乳第14天08:00空腹從耳緣靜脈采血10 mL到肝素鈉抗凝管中，3 500 r/min、低溫離心15 min，分離血清，-20 ℃保存。在哺乳第14天，每組每頭母豬中所有仔豬進(jìn)行稱重求平均值后，選取與平均體重相近的仔豬公、母各1只，共14只進(jìn)行采血，血樣3 500 r/min、低溫離心15 min，制備血清于-20 ℃保存。

1.4.2 乳樣采集

收集母豬分娩后2 h內(nèi)和哺乳第14天乳汁。從母豬的前、中、后乳頭收集混合乳樣20 mL，-80 ℃冰箱保存待測。初乳直接采取，常乳采前每頭母豬注射2 mL縮宮素。

1.4.3 腸道樣本采集

哺乳第21天，對每組每頭母豬的所有仔豬進(jìn)行稱重后取平均值，選取與平均體重相近的仔豬公、母各1只，共14只進(jìn)行屠宰后取腸道樣本，使用蘇木精-伊紅染色檢測空腸和回腸形態(tài)。在脫水、包埋、切片和染色后，用計(jì)算機(jī)輔助顯微鏡(尼康ECLIPSE E200，日本)測量絨毛高度、隱窩深度，計(jì)算絨毛高度/隱窩深度。在空腸、回腸組織切片上，選5個(gè)典型視野(絨毛完整、走向平直)，測量每100個(gè)腸上皮細(xì)胞中的杯狀細(xì)胞數(shù)。

1.5 指標(biāo)測定

1.5.1 繁殖性能

母豬正常分娩后記錄：窩總仔數(shù)、窩活仔數(shù)、窩死胎數(shù)、初生窩重、初生個(gè)體重。記錄母豬采食量及斷奶仔豬窩重，并計(jì)算平均日增重(ADG)、平均日增窩重、平均日采食量(ADFI)。

1.5.2 免疫指標(biāo)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)檢測初乳中分泌性免疫球蛋白A(SIgA)含量，使用試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)檢測初乳免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量。

1.5.3 抗氧化指標(biāo)

采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定母豬和仔豬血清、母豬初乳中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，丙二醛(MDA)含量和總抗氧化能力(T-AOC)。

1.5.4 乳成分

乳成分采用乳成分自動(dòng)分析儀(UL40AC，杭州浙大優(yōu)創(chuàng)科技有限公司)測定，測定指標(biāo)包括乳蛋白、乳脂肪、總?cè)楣腆w、非脂乳固體、乳糖含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2019初步整理后，使用Graph Prime 8進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，結(jié)果以平均值±均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05

2 結(jié) 果

2.1 ISO-S對母豬繁殖性能的影響

由表2可見，與對照組相比，飼糧中添加ISO-S顯著提高了泌乳期母豬ADFI(P<0.05)；仔豬ADG有增加趨勢(P=0.076 5)；平均日增窩重、窩死胎數(shù)、仔豬初生個(gè)體重、窩總仔數(shù)均無顯著變化(P>0.05)。

表2 ISO-S對母豬繁殖性能的影響Table 2 Effects of ISO-S on reproductive performance of sows

2.2 ISO-S對妊娠期、泌乳期母豬及哺乳仔豬抗氧化能力的影響

由表3可見，與對照組相比，母豬妊娠第110天，飼糧中添加ISO-S對妊娠母豬血清中CAT、GSH-Px、SOD活性，MDA含量及T-AOC未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)；哺乳第14天，飼糧中添加ISO-S對妊娠母豬血清中CAT、GSH-Px、SOD活性，MDA含量、T-AOC均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

表3 ISO-S對母豬血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of ISO-S on serum antioxidant indexes of sows

由表4可見，與對照組相比，飼糧中添加ISO-S顯著提高了哺乳仔豬血清CAT活性(P<0.05)；飼糧中添加ISO-S對哺乳仔豬血清中GSH-Px、SOD活性，MDA含量，T-AOC均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

由表5可見，與對照組相比，飼糧中添加ISO-S極顯著提升了母豬初乳CAT和SOD的活性(P<0.01)，顯著提升了母豬初乳GSH-Px活性和T-AOC(P<0.05)。

2.3 ISO-S對母豬初乳免疫指標(biāo)的影響

由表6可見，與對照組相比，飼糧中添加ISO-S顯著提升了母豬初乳IgA、SIgA的含量(P<0.05)，對母豬初乳IgM、IgG含量未見顯著影響(P>0.05)。

表4 ISO-S對哺乳仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of ISO-S on serum antioxidant indexes of suckling piglets

表5 ISO-S對母豬初乳抗氧化指標(biāo)的影響Table 5 Effects of ISO-S on colostrum antioxidant indexes of sows

表6 ISO-S對母豬初乳免疫指標(biāo)的影響Table 6 Effects of ISO-S on colostrum immune indexes of sows

2.4 ISO-S對母豬乳成分的影響

由圖1、圖2可見，與對照組相比，飼糧中添加ISO-S顯著提高了母豬初乳中乳脂肪的含量(P<0.05)，對乳蛋白、總?cè)楣腆w、非脂乳固體、乳糖含量均無顯著影響(P>0.05)；對母豬常乳中乳脂肪、乳蛋白、總?cè)楣腆w、非脂乳固體、乳糖含量均未見顯著影響(P>0.05)。

2.5 ISO-S對哺乳仔豬腸道形態(tài)的影響

由表7可見，與對照組相比，飼糧中添加ISO-S對回腸及空腸杯狀細(xì)胞數(shù)、空腸絨毛高度/隱窩深度、回腸絨毛高度/隱窩深度均未見顯著影響(P>0.05)。

3 討 論

3.1 ISO-S對母豬繁殖性能的影響

ISO可與下丘腦及垂體中的雌二醇受體緊密結(jié)合，直接對神經(jīng)內(nèi)分泌體系產(chǎn)生影響，促使生長激素(GH)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的分泌，從而促進(jìn)豬的生長發(fā)育，提高生長性能。有研究表明，飼糧中添加ISO顯著提高了斷奶仔豬的末重和42～72日齡仔豬的ADFI和ADG[14]。Greiner等[15]研究也證實(shí)了飼糧中添加ISO可使仔豬的ADG和ADFI提高。Farmer等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加ISO能提高生長育肥豬的屠宰性能。本試驗(yàn)在飼糧中添加40 mg/kg ISO-S后顯著提高了妊娠母豬的ADFI，提示添加ISO-S可提高豬的生長性能，這與前人研究結(jié)果一致；本試驗(yàn)添加ISO-S對母豬各項(xiàng)繁殖性能指標(biāo)未見顯著影響。有研究表明，飼糧中添加ISO可提高初生仔豬個(gè)體重和窩重，并呈現(xiàn)線性關(guān)系，20、28日齡仔豬個(gè)體重和窩重顯著高于對照組[17]。Rehfeldt等[18]的試驗(yàn)表明，在妊娠后期母豬飼糧中添加ISO對窩產(chǎn)仔數(shù)、窩重和仔豬出生體重未見顯著影響，但改善了仔豬肉品質(zhì)并增加了骨骼肌細(xì)胞的數(shù)量。有試驗(yàn)在母豬妊娠后期飼糧中添加0.01% ISO后，仔豬斷奶窩均重和日增重均高于對照組[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，母豬妊娠后期飼糧中添加40 mg/kg ISO-S使仔豬ADG有增加趨勢，提示添加ISO-S可增強(qiáng)仔豬的生長性能；對窩總仔數(shù)、窩活仔數(shù)及仔豬初生個(gè)體重、仔豬平均日增窩重均無顯著影響。

CON：對照組；ISO-S：ISO-S組。數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注*表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)注**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。CON：control group；ISO-S：ISO-S group. Values columns with * mean significant difference (P<0.05)， with ** mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.圖1 ISO-S對母豬初乳成分的影響Fig.1 Effects of ISO-S on colostrum ingredients of sows

3.2 ISO-S對妊娠期、泌乳期母豬及哺乳仔豬抗氧化能力的影響

動(dòng)物進(jìn)行正常生命活動(dòng)會(huì)消耗大量的能量與氧氣，并伴隨著大量自由基的產(chǎn)生，加之集約化養(yǎng)殖以及高密度飼養(yǎng)、哺乳動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)熱增加，引發(fā)熱應(yīng)激[20]。母豬在熱應(yīng)激條件下，體內(nèi)各類自由基增多，超過機(jī)體自由基清除系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力，形成氧化應(yīng)激，削弱了機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能[2]，導(dǎo)致產(chǎn)生某些代謝性疾病及乳腺疾病[21-22]。過量的自由基會(huì)使膜脂過氧化，破壞生物膜正常生理功能。SOD、CAT和GSH-Px是細(xì)胞中主要的抗氧化酶，在清除自由基和降低氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。MDA含量可評(píng)估細(xì)胞氧化損傷的程度。因此，抗氧化酶活性和MDA含量是機(jī)體抗氧化能力的關(guān)鍵指標(biāo)。ISO可消除活性氧(ROS)以減少M(fèi)DA的形成，有效提高機(jī)體的抗氧化能力[23]。研究發(fā)現(xiàn)，飼糧補(bǔ)充ISO能改善仔豬腸道形態(tài)，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能和免疫能力，從而減輕氧化應(yīng)激[24]。本課題組另一試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在肉雞飼糧中添加ISO可減緩脂質(zhì)過氧化，提高抗氧化能力[25]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，用10～40 μmol/L ISO處理仔豬腸上皮細(xì)胞，能減輕氧化應(yīng)激對其的損傷作用，增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞抗氧化能力并顯著減少細(xì)胞凋亡[26]。在飼糧中添加10～40 mg/kg ISO能緩解斷奶仔豬十二指腸絨毛損傷，并降低空腸組織中MDA含量，提高SOD、GSH-Px活性[27]。有研究表明，在飼糧中添加640 mg/kg高濃度ISO可提高肥育豬背最長肌SOD活性和T-AOC，同時(shí)增加脂肪、肝臟和血漿中MDA含量[28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加40 mg/kg ISO-S顯著提高了14日齡仔豬血清CAT活性，表明ISO-S可增強(qiáng)仔豬的抗氧化能力，在一定程度上降低了MDA含量并提高了SOD活性，但未達(dá)到顯著水平；飼糧中添加40 mg/kg ISO-S對妊娠第110天和哺乳第14天母豬血清CAT、GSH-Px、SOD活性，MDA含量，T-AOC均未見顯著影響；在飼糧中添加40 mg/kg ISO-S顯著增加了母豬初乳中CAT、SOD、GSH-Px活性及T-AOC，表明ISO-S能增強(qiáng)母豬初乳抗氧化能力；在飼糧中添加ISO-S對初乳MDA含量未見顯著影響。

圖2 ISO-S對母豬常乳成分的影響Fig.2 Effects of ISO-S on ordinary milk ingredients of sows

表7 ISO-S對哺乳仔豬腸道形態(tài)的影響Table 7 Effects of ISO-S on intestinal morphology of suckling piglets

3.3 ISO-S對母豬乳成分及初乳免疫指標(biāo)的影響

初生仔豬的增重主要是從母乳中獲取營養(yǎng)物質(zhì)和能量，母豬泌乳量及乳蛋白、乳脂肪、乳糖等營養(yǎng)物質(zhì)含量在很大程度上影響仔豬的健康及生長發(fā)育。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加40 mg/kg ISO-S，顯著提高了母豬初乳中乳脂肪的含量，而乳蛋白質(zhì)、總?cè)楣腆w、非脂乳固體、乳糖含量沒有顯著變化，常乳成分含量無顯著變化。ISO具有抗炎特性[29]，對病原體有直接抑制作用[30]，IgA、IgG、IgM是機(jī)體內(nèi)重要的免疫球蛋白，添加ISO可使機(jī)體免疫抗體分泌升高。有研究發(fā)現(xiàn)，在妊娠母豬飼糧中添加ISO顯著增加了母仔豬血漿中IgM的含量并提高了母豬初乳中的IgA和IgG含量[31]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼糧中添加40 mg/kg ISO-S顯著提升了母豬初乳中IgA、SIgA的含量，表明ISO-S能增強(qiáng)母豬初乳免疫能力；在飼糧中添加ISO-S對初乳IgM、IgG含量均未見顯著影響。有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加ISO可通過抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的p38和Toll樣受體4(TLR4)依賴通路的激活，在一定程度上減輕LPS對斷奶仔豬腸道屏障的破壞作用，改善仔豬腸道屏障功能[32]。Jenkins等[33]研究表明，添加73 mg/d ISO對血清中白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量有顯著提升作用。ISO還可增加妊娠后期母豬血液和初乳中豬瘟抗體的濃度，并顯著提高初生仔豬血清中母源抗體的含量[34]。有研究發(fā)現(xiàn)，添加ISO的染病豬產(chǎn)生抗體更快，并且死亡率顯著降低[35]。綜上所述，飼糧添加ISO-S可增強(qiáng)豬的免疫功能。

3.4 ISO-S對仔豬腸道形態(tài)的影響

在腸道中，微生物和飼糧的刺激會(huì)使腸道自由基增多，造成腸細(xì)胞膜的破壞，導(dǎo)致腸絨毛損傷，增加隱窩深度，增加分泌細(xì)胞，減少吸收細(xì)胞，降低營養(yǎng)吸收能力[36-37]。本課題組試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加10～40 mg/kg ISO可以使十二指腸絨毛損傷得到緩解[27]。有研究表明，ISO作為植物雌激素可通過提高腸道益生菌的數(shù)量來抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)[38]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在飼糧中添加40 mg/kg ISO-S對空腸絨毛高度/隱窩深度、回腸絨毛高度/隱窩深度無顯著影響。

4 結(jié) 論

綜上所述，在飼糧中添加ISO-S可提高泌乳期母豬ADFI，仔豬ADG也有提高趨勢；可提高母豬初乳中乳脂肪的含量；對泌乳期母豬初乳免疫指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)、仔豬血清抗氧化指標(biāo)均有顯著改善作用。