卜登攀 姚瑞芬,2 詹騰飛

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193；2.北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，北京 102206)

蛋白質(zhì)及氨基酸是奶牛營養(yǎng)的重要組成部分，是機體合成乳蛋白的主要來源[1]。研究表明，飼糧中添加過瘤胃氨基酸(rumen protected amino acid，RPAA)是滿足奶牛氨基酸需要、提高經(jīng)濟效益的有效方法[2]。精準掌握飼糧及RPAA中氨基酸的生物利用率是奶牛高效生產(chǎn)的關(guān)鍵，但RPAA產(chǎn)品保護方法多樣，如鈣鹽、脂質(zhì)包被和類似物等，不同的包被工藝影響氨基酸的生物利用率[3]。因此，準確評價RPAA生物利用率至關(guān)重要，本文重點對RPAA現(xiàn)有生物利用率的評價方法進行闡述。

1 RPAA及其應用的必要性

奶牛對蛋白質(zhì)營養(yǎng)的需要本質(zhì)上是對氨基酸的需求，氨基酸是奶牛合成乳蛋白的前體物質(zhì)，主要來源于飼糧中蛋白質(zhì)和非蛋白氮等[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)提高飼糧蛋白質(zhì)水平或補充必需氨基酸能顯著提高奶牛產(chǎn)奶量，且乳成分產(chǎn)量有不同程度提升[4-6]。為追求更高的產(chǎn)奶量，生產(chǎn)中往往飼喂過量的蛋白質(zhì)，但由此會因能氮不平衡影響到瘤胃微生物利用氮素的效率，從而導致奶牛氮素轉(zhuǎn)化率低[7-8]，而氨基酸平衡低蛋白質(zhì)飼糧是提高氮利用效率的策略之一[9]。氨基酸不平衡是限制奶牛發(fā)揮最大生產(chǎn)性能的重要因素。飼糧中瘤胃可降解蛋白和非蛋白氮被瘤胃微生物利用合成菌體蛋白，其氨基酸組成較為平衡，但研究顯示補充尿素等非蛋白氮超過一定限度時，瘤胃氨態(tài)氮濃度過高會影響瘤胃穩(wěn)態(tài)，導致奶牛生產(chǎn)性能下降[10-11]。而直接飼喂高劑量游離氨基酸也可滿足奶牛需求，但奶?？赡艹霈F(xiàn)一定程度的毒性反應[12]。綜上可知，需要額外補充受保護的氨基酸以滿足奶牛營養(yǎng)需要以及平衡飼糧氨基酸組成[13]。

RPAA是氨基酸通過某種技術(shù)進行保護，降低其在瘤胃內(nèi)的降解，使更多氨基酸能到達小腸后才釋放并被機體消化吸收。研究顯示，在奶牛產(chǎn)前和產(chǎn)后飼糧中補充過瘤胃蛋氨酸(rumen protected methionine,RP-Met)和過瘤胃賴氨酸(rumen protected lysine,RP-Lys)能有效改善奶牛產(chǎn)奶量和氮利用效率，提高犢牛的生長性能和免疫力[14-15]。因此，RPAA可作為調(diào)控、優(yōu)化動物蛋白質(zhì)營養(yǎng)和氨基酸平衡的有效措施。

2 RPAA生物利用率的評價方法

精準掌握RPAA中氨基酸生物利用率是其發(fā)揮最大效益的前提。目前，評估RPAA生物利用率的方法主要分為體外法、半體內(nèi)法和體內(nèi)法，其中體內(nèi)法主要包括產(chǎn)奶量劑量效應法、乳蛋白劑量效應法、牛奶硒元素稀釋法、曲線下面積法、血漿游離氨基酸劑量效應法和穩(wěn)定同位素法等。

2.1 體外法

體外法是基于實驗室條件，體外模擬瘤胃、皺胃和小腸環(huán)境對RPAA生物利用率進行評價。在Mbanzamihigo等[16]方法的基礎(chǔ)上，Gargallo等[17]改進體外流程，形成體外試驗的三步法。該方法中將待測RPAA稱重后放入尼龍袋(5 cm×10 cm、孔徑50 μm，樣品5 g)，流程如圖1所示，各相孵育后取部分尼龍袋的殘留物進行氨基酸分析，計算氨基酸的瘤胃保護率和腸道釋放率，確定RPAA的保護效果。

圖1 體外三步法流程Fig.1 A 3-step in vitro procedure

在上述基礎(chǔ)上，Ross等[18]對孵育時間以及使用的酶進行了優(yōu)化。樣品在體外分別孵育4、8、12、16、24和30 h，然后加胃蛋白酶孵育1 h，隨后加入氫氧化鈉(NaOH)中和pH，添加胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、膽汁鹽和磷酸鉀緩沖液混合，孵育16 h模擬腸道消化；孵育結(jié)束后，取內(nèi)容物過濾進行氨基酸分析。Miyazawa等[19]用含脂肪酶的改良McDougal緩沖液代替瘤胃液，胃蛋白酶的鹽酸緩沖液模擬皺胃，添加胰蛋白酶和膽汁粉的磷酸鹽緩沖液模擬十二指腸，孵育時間與Gargallo等[17]相同，完全用緩沖溶液代替奶牛消化環(huán)境，方便實驗室操作。Larson等[20]使用培養(yǎng)基瓶代替溶解瓶，使該方法更加經(jīng)濟。

在該方法中，瘤胃保護率與腸道釋放率由模擬瘤胃孵育和腸道消化結(jié)束后殘留的氨基酸量決定，RPAA的生物利用率以模擬條件下得到的瘤胃保護率乘以腸道釋放率獲取[21]。體外方法成本低、檢測速度快，可獲得RPAA生物利用率的初步信息。但體外模擬缺乏動物采食及反芻等過程的影響，與其真實利用率間存在一定的差異。除此之外，緩沖液pH、孵育時間、所用酶和濃度等各實驗室存在差異也會影響準確性，如果做到標準化，體外法在RPAA的初步評價中可能會更有用[22]。

2.2 半體內(nèi)法

半體內(nèi)法或稱為尼龍袋法是以動物為基礎(chǔ)使用尼龍袋進行瘤胃孵育，構(gòu)建指數(shù)模型估算氨基酸的瘤胃消失率[23]，以及使用尼龍袋隨腸道消化移動獲得腸道消失的估計值[24]，確定RPAA生物利用率。該方法先將RPAA放入尼龍袋[12～15 mg/cm2、孔徑(50±15) μm]在瘤胃中培養(yǎng)16 h后測定殘留物氨基酸含量，然后模擬皺胃環(huán)境，將尼龍袋轉(zhuǎn)移到胃蛋白酶-鹽酸溶液，39 ℃孵育1.0～2.5 h后通過十二指腸瘺管投入十二指腸，24 h內(nèi)從回腸或糞便中回收移動尼龍袋，測定殘留物中氨基酸含量；RPAA的生物利用率以離開瘤胃的氨基酸百分比乘以其在腸道中消失的氨基酸百分比獲得[24-28]。半體內(nèi)法的流程如圖2所示。

半體內(nèi)法以動物體內(nèi)消化環(huán)境為主，但該方法假設氨基酸從尼龍袋中消失代表其在瘤胃降解或被小腸吸收，沒有考慮到氨基酸被后腸道利用情況[22]，也沒有考慮奶牛采食和反芻的影響，結(jié)果可能高估或低估氨基酸的生物利用率。另外，所選擇的瘤胃滯留時間、尼龍袋和樣品的大小、孔徑等都會影響生物利用率值[29-30]。因此，該方法不適宜用于評價粒徑較小或可溶性RPAA[31]，當過多逃離尼龍袋的樣品被計算到離開瘤胃的氨基酸百分比中時，會導致評價不準確。

圖2 半體內(nèi)法流程Fig.2 Schematic of the in situ

2.3 體內(nèi)法

體內(nèi)法直接將RPAA用于奶牛，包括劑量效應法(產(chǎn)奶量、乳蛋白)、牛奶硒元素稀釋法、曲線下面積法、血漿游離氨基酸劑量效應法和穩(wěn)定同位素法等。這些方法相較于體外法和半體內(nèi)法能更好地反映奶牛利用RPAA的真實情況，具有較高的準確性和精確性。

2.3.1 劑量效應法

產(chǎn)奶量劑量效應法和乳蛋白劑量效應法的原理是產(chǎn)奶量、乳蛋白濃度及產(chǎn)量隨氨基酸攝入量的增加呈線性增加，達到充足水平后趨于穩(wěn)定[32]。賴氨酸(Lys)和蛋氨酸(Met)是奶牛主要的限制性氨基酸，能影響產(chǎn)奶量和乳蛋白的合成[33-34]；當代謝蛋白質(zhì)滿足需求時，代謝Lys和Met占代謝蛋白質(zhì)的7.2%和2.4%能夠達到最佳產(chǎn)奶性能[35]。因此，在缺乏Lys或Met的飼糧中添加RP-Lys或RP-Met，能夠通過產(chǎn)奶性能的改變來評估氨基酸的生物利用率。

Schwab等[36]和Ordway等[37]使用乳蛋白劑量效應評價了Met類似物的生物利用率，采用重復的5×5拉丁方設計，基礎(chǔ)飼糧配制為缺乏Met，以Smartamine M作為陽性對照，分別飼喂5個水平的Smartamine M和Met類似物，使用線性部分的劑量反應關(guān)系計算生物利用率為Met類似物與Smartamine M的乳蛋白濃度變化響應斜率的比值。Fleming等[33]使用已知生物利用率的AjiProL-Gen 2為陽性對照，飼喂4個水平待測RP-Lys，減少了試驗重復數(shù)，根據(jù)上述公式得出待測RP-Lys的生物利用率接近于AjiProL-Gen 2的2倍。

與體外和半體內(nèi)法相比，該方法不需要瘺管奶牛，RPAA物理性質(zhì)沒有限制，且受到反芻等體內(nèi)影響。高產(chǎn)奶牛對氨基酸缺乏和RPAA增加更敏感，產(chǎn)奶量越高可能越適合這種方法[22]。但該方法也存在局限，試驗奶牛需要保持氨基酸缺乏的狀態(tài)，且超過需求量后提供的氨基酸不會引起響應，這會使置信區(qū)間可能較大，導致生物利用率估計值的準確性降低[33]。

2.3.2 牛奶硒元素稀釋法

牛奶硒元素稀釋法假設各組硒代蛋氨酸的吸收速率相同，即硒水平一致。Met濃度增加會引起硒與Met比值降低，兩者比值的變化代表可代謝Met的變化，進而根據(jù)兩者比值對Met的生物利用率進行評價[38]，但該方法僅適用于Met的評價(圖3)。

Se：硒 selenium；Met：蛋氨酸 methionine。圖3 Met代謝的簡化動力學模型及硒/Met變化Fig.3 Simplified kinetic model of metabolism of Met and change of Se/Met[38]

Weiss等[38]驗證了牛奶硒元素稀釋法能夠量化可代謝Met供給的改變，在該研究中，所有奶牛均采食相同飼糧(CPM估測代謝Met水平為49 g/d)，經(jīng)皺胃分別灌注9 g/d Met溶液或水，檢測牛奶樣品中的氮、硒和Met含量；2組牛奶的硒與Met比值變化反映奶牛代謝Met水平的變化，故試驗組代謝Met水平為對照組代謝Met水平乘以2組硒與Met的比值，即57.33×(49×1.17) g/d，推算出灌注Met所提供的可代謝Met為8.33 g/d；用硒與氮的比值計算得試驗組的代謝Met水平為58.31×(49×1.19) g/d，較對照組多9.31 g/d，與灌注量接近。由此可見，牛奶中硒與Met或氮的比值都能對Met的生物利用率進行評價。

2.3.3 曲線下面積法

曲線下面積法原理是短時間內(nèi)提供給動物一定量RPAA，連續(xù)檢測血液中氨基酸濃度并繪制曲線，計算曲線下面積，與皺胃灌注氨基酸純品所得曲線下面積進行比較，得到RPAA生物利用率[39-40]。

Graulet等[39]將RP-Met經(jīng)瘺管投入瘤胃，使用開始灌注前24、12、6、0 h血漿氨基酸濃度來確定基線值，繪制補充RP-Met后的檢測值減去基線值的曲線，生物利用率計算為根據(jù)曲線估計的可代謝Met與補充劑量水平的比率。Estes等[40]和Fleming等[33]將PRAA在瘤胃孵育8 h，殘留物再灌注到奶牛皺胃，對照組則灌注等量未保護氨基酸純品，在灌注前4、2、0 h以及灌注后0.33、0.67、1、2、4、6、8、10、12和16 h采血，檢測血漿氨基酸濃度，根據(jù)過瘤胃保護和未保護氨基酸曲線下面積比值估算RPAA生物利用率。

曲線下面積法是對氨基酸的直接測量，反應更加快速，使得置信區(qū)間小，評價生物利用率精度較高。但該方法沒有考慮動物采食和反芻的影響，并且試驗提供給奶牛的RPAA劑量超過正常劑量，易誘導氨基酸分解代謝[33]；且采血次數(shù)較多且持續(xù)時間較長，由此產(chǎn)生的應激是否會對評價生物利用率造成影響尚不可知。

2.3.4 血漿游離氨基酸劑量效應法

血漿游離氨基酸劑量效應法的原理是血液中氨基酸占總氨基酸的比例分別與氨基酸的飼喂量和輸注氨基酸純品的量呈線性關(guān)系，兩者斜率比值代表RPAA生物利用率[41]。Rulquin等[42]、Hanigan等[43]證明了飼糧氨基酸缺乏或滿足需要量時Lys和Met都存在這一線性關(guān)系。Rulquin等[42]使用該方法評估了RP-Met和RP-Lys的生物利用率，該試驗中飼喂不同水平的待測產(chǎn)品，15 min后將剩余飼料經(jīng)瘤胃瘺管進入瘤胃，對照組氨基酸純品通過十二指腸瘺管連續(xù)輸注到十二指腸；在試驗第4天，每小時通過頸靜脈采血，持續(xù)12 h，進行氨基酸分析。Whitehouse等[41]研究指出，奶牛連續(xù)攝入氨基酸超過4 d，血漿氨基酸濃度達到穩(wěn)態(tài)，并提出采用重復的拉丁方設計，每期試驗設置7 d，在第5～7天采集血液樣品；該研究還發(fā)現(xiàn)，采集2～8 h與2～24 h血液樣品得到的生物利用率較接近，建議采集飼喂后2、4、6和8 h的血樣用于生物利用率評價。

與曲線下面積法相比，血漿游離氨基酸劑量效應法采血操作的次數(shù)減少，持續(xù)時間縮短，在進行相對利用率的比較時通過氨基酸的飼喂量可在無瘺管奶牛的情況下開展評價[41]。由此可見，該方法適用于單一RPAA生物利用率測定，但難以測定飼料原料中的所有氨基酸。

2.3.5 穩(wěn)定同位素法

穩(wěn)定同位素法假設飼糧天然同位素標記和非同位素的氨基酸進入血液時處于穩(wěn)態(tài)，兩者比值基本穩(wěn)定，當以恒定速率向動物靜脈血管中灌注同位素標記的氨基酸，原有穩(wěn)態(tài)被打破，但經(jīng)過一段時間灌注后能達到新的穩(wěn)態(tài)[40](圖4)。然后，通過觀測到每種氨基酸同位素與非同位素比值推導出RPAA或飼料原料中氨基酸的血漿進入率，結(jié)合線性回歸可以對氨基酸的生物利用率進行評估[31]。

圖4 穩(wěn)定同位素法原理Fig.4 Principle of stable isotope-based approach

Borucki等[44]和Maxin等[45]使用一種基于同位素稀釋結(jié)合氨基酸2池模型(血漿池A和胞內(nèi)池或蛋白池B)的方法，評估皺胃灌注Lys和Met的回收率時，回收率達95%和96%，單獨灌注Lys時回收率達100%，表明該方法能夠有效評估氨基酸的生物利用率。Estes等[40]和Huang等[31]的試驗中以飼喂無保護的氨基酸和酪蛋白作為對照，飼喂以不同原料配制成的蛋白質(zhì)水平相近的飼糧，通過頸靜脈插管以恒定速率灌注13C標記氨基酸混合物2 h，從開始灌注前至灌注結(jié)束后連續(xù)采集血液樣品，觀測同位素富集的動態(tài)變化。Estes等[40]將2池模型發(fā)展為4池模型(圖5)，快速周轉(zhuǎn)池代表游離氨基酸和少部分半衰期短(<30 min)的蛋白質(zhì)，慢速周轉(zhuǎn)池代表與蛋白質(zhì)結(jié)合的氨基酸，根據(jù)氨基酸同位素與非同位素的比值推導每種氨基酸的血漿進入率，進而通過模型評估的每種原料氨基酸生物利用率，研究顯示其誤差小于10%。Estes等[40]和Huang等[31]建議灌注時間可延長至4～6 h，應該能更好地了解體內(nèi)蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)以及估計慢速周轉(zhuǎn)池以降低總進入率偏差。Huang等[46]引入另一種同位素(15N)來標記菌體蛋白，利用穩(wěn)定同位素法分別推導瘤胃不可降解蛋白和菌體蛋白的必需氨基酸吸收量，可應用于了解不同蛋白質(zhì)類別的氨基酸有效性。

圖5 氨基酸4池動態(tài)模型Fig.5 The 4-pool dynamic model of amino acid[40]

穩(wěn)定同位素法考慮了氨基酸在動物體內(nèi)的代謝過程，適用于RPAA和飼料原料單個氨基酸的生物利用率評價，靈敏度較高，但長時間恒定速率灌注的操作較為復雜，需要準確記錄每次采血時間，所用標記氨基酸和檢測成本較高[40]。

3 小 結(jié)

綜上所述，RPAA對奶牛精準飼喂和提質(zhì)增效具有重要意義?，F(xiàn)有評價方法中，體外法和半體內(nèi)法能快速獲得RPAA生物利用率的初步信息，適用于大批量樣品檢測和對RPAA產(chǎn)品的氨基酸生物利用率進行排序；獲得絕對生物利用率值建議選擇牛奶硒元素稀釋法(Met)或穩(wěn)定同位素法，只需相對生物利用率值可選用曲線下面積法或血漿游離氨基酸劑量效應；牧場評估可能更適合劑量效應法。不過，上述評價方法都具有一定局限，RPAA生物利用率的準確評估仍是反芻動物營養(yǎng)具有挑戰(zhàn)性的工作之一。未來，迫切需要建立更便捷、準確、適用性更廣泛的評價方法，以獲得RPAA生物利用率，達到進一步優(yōu)化奶牛飼糧、促進奶牛高效生產(chǎn)的目的。