張嚴(yán)勻，李 易，王 賀，張 曼，張苗苗

在正畸牙齒移動過程中，壓力側(cè)的牙周膜受壓變窄，牙周膜血管破裂，出現(xiàn)血循環(huán)障礙，牙周組織中的細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞死亡，出現(xiàn)典型的局部細(xì)胞壞死區(qū)，也稱為玻璃樣變區(qū)，這些壞死的細(xì)胞引發(fā)急性炎癥反應(yīng)，募集炎癥細(xì)胞和破骨前體細(xì)胞到炎癥區(qū)域，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，導(dǎo)致骨吸收[1-2]。本課題組前期實驗研究已發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡是壓力側(cè)細(xì)胞死亡的方式之一[3]，抑制壞死性凋亡可下調(diào)壓力側(cè)炎性分子的水平[4]，影響破骨細(xì)胞的形成、分化，減緩正畸牙移動的速度[5]。壞死性凋亡是主要由受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)、受體相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3，RIP3)及混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)誘導(dǎo)的一類不依賴于caspase的細(xì)胞死亡方式，在引發(fā)細(xì)胞死亡的同時可誘導(dǎo)周圍組織的免疫反應(yīng)和廣泛的炎癥反應(yīng)[6-7]，其中RIP3和MLKL是核心調(diào)節(jié)因子，被認(rèn)為是檢測壞死凋亡發(fā)生的生物標(biāo)志物[8-9]，MLKL作為最終的執(zhí)行蛋白，可在RIP3催化下發(fā)生磷酸化，繼而發(fā)生寡聚化，引起質(zhì)膜通透性的改變，細(xì)胞內(nèi)Ca2+、Na+濃度增加，K+濃度減小,質(zhì)膜完整性喪失，驅(qū)動壞死性凋亡[10]。

正畸力轉(zhuǎn)化成化學(xué)信號受多種信號通路的影響，其中離子通道是牙周組織細(xì)胞信號傳導(dǎo)的重要途徑之一[11]。Piezo1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種機(jī)械敏感性離子通道，該通道可以響應(yīng)不同形式的機(jī)械力刺激，如拉伸力、剪切應(yīng)力、膜張力等，對 K+、Ca2+、Mg2+和Na+均可滲透，其中更偏向于Ca2+，在牙周組織及細(xì)胞中有豐富的表達(dá)，可有效地將物理力轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的電化學(xué)反應(yīng)[12-14]。它可以被特異性的機(jī)械敏感性離子通道抑制劑蜘蛛毒素多肽(grammostola spatulata mechanotoxin 4，GsMTx4)所阻滯，靜態(tài)壓應(yīng)力可以激活人牙周膜干細(xì)胞膜上的Piezo1蛋白，經(jīng)靜態(tài)壓應(yīng)力預(yù)處理的牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cells, PDLCs)與小鼠單核細(xì)胞系RAW264.7共培養(yǎng)中，Piezo1抑制劑抑制破骨細(xì)胞的形成[15]。已有研究證明Piezo1可被機(jī)械應(yīng)力激活，增進(jìn)Ca2+的內(nèi)流，干擾細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，驅(qū)動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激系統(tǒng)，導(dǎo)致隨后的細(xì)胞凋亡[16]。然而，在施加正畸力后Piezo1是否會影響到壓力側(cè)牙周組織發(fā)生的壞死性凋亡，尚未見報道。本實驗建立大鼠牙齒移動的正畸模型，通過局部注射GsMTx4阻斷壓力側(cè)牙周組織 Pizeo1通道，檢測RIP3、MLKL表達(dá)量的變化，探討Piezo1是否影響壓力側(cè)牙周組織壞死性凋亡，為臨床正畸治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與構(gòu)建大鼠牙移動模型

選用75只6～8周齡的雄性SD大鼠(遼寧長生生物實驗室)，體重180～200 g，隨機(jī)將其分為空白對照組(A組)，加力組(B組)，加力+抑制劑組(C組)，每組各25只。術(shù)前禁食12 h，選取左側(cè)上頜牙弓為實驗側(cè)，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠(0.1 mL/100 g)后，在上頜的左側(cè)第一磨牙與中切牙間用結(jié)扎絲固定一段鎳鈦拉簧，將加力值設(shè)為50 g。大鼠牙移動模型構(gòu)建完成后，對C組大鼠左上第一磨牙的近中牙周組織處每隔1 d注射一次GsMTx4藥液，劑量為50 μL，濃度為48 μmol/L[17](圖1)。本研究獲得哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 組織準(zhǔn)備

分別于加力后 1、3、5、7、14 d采用心臟灌注的方法處死大鼠，取大鼠的左上頜磨牙及周圍組織塊，于多聚甲醛中固定48 h，EDTA脫鈣42 d后，進(jìn)行脫水、包埋，沿著大鼠牙體長軸的矢狀方向進(jìn)行厚度為5 um的連續(xù)切片。恒溫65 ℃烤片2 h后，進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.3 牙齒移動距離測量

取大鼠的上頜兩側(cè)磨牙及周圍組織塊,由同一人員使用數(shù)字游卡尺分別測量左側(cè)和右側(cè)的第一磨牙近中齦牙連接處與中切牙遠(yuǎn)中齦牙連接處之間的距離,右側(cè)磨牙切牙間所測得距離與左側(cè)磨牙切牙間所測得距離之差即為左側(cè)上頜第一磨牙移動的距離,每個組織進(jìn)行反復(fù)測量3次,最后取平均值。

1.4 HE染色

用蘇木精染液對組織切片進(jìn)行染色，時間約為5 min，鹽酸酒精對組織切片進(jìn)行分化，時間約為10 s后，置于溫水中直至藍(lán)色出現(xiàn)，伊紅液中復(fù)染約3 min，應(yīng)用中性樹膠對其進(jìn)行封固處理。

1.5 免疫組化檢測壓力側(cè)RIP3、MLKL的表達(dá)

先將組織切片進(jìn)行脫蠟至水、修復(fù)、封閉，然后分別滴加RIP3、MLKL一抗(1∶100稀釋)，貼膜，放置于濕盒內(nèi)，冰箱4 ℃條件下孵育過夜之后滴加二抗(1∶200稀釋)，貼膜孵育后，進(jìn)行顯色、復(fù)染、脫水、二甲苯透明化處理，應(yīng)用中性樹膠對其進(jìn)行封固處理，通過Image pro plus 6.0軟件對染色后陽性表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行平均光密度測定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 24.0通過ANOVA檢驗對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠正畸牙移動距離的比較

A組的正畸牙齒在各個時間點均無移動，B組和C組的移動距離均隨時間而增加。其中B組牙齒移動距離在3 d內(nèi)明顯增加，隨后增加相對減慢，7～14 d趨于穩(wěn)定，而C組牙齒移動距離在3 d內(nèi)同樣明顯增加，隨后趨于穩(wěn)定，5～7 d移動距離增加相對減緩，7～14 d再次趨于穩(wěn)定。與B組相比較，C組的牙齒移動距離在各時間點均明顯減小(P<0.05)，如圖2所示。

2.2 正畸加力后壓力側(cè)牙周組織變化

HE染色顯示：A組牙周膜形態(tài)較好，其纖維排列較為規(guī)律、整齊，牙槽骨的表面平整，未發(fā)現(xiàn)骨吸收陷窩；B組，3 d時受壓側(cè)牙周膜的寬度開始變得窄縮，其纖維排列變得紊亂，7 d時受壓側(cè)牙槽骨邊緣部位出現(xiàn)骨吸收陷窩，14 d時，牙周膜的寬度恢復(fù)接近于A組，未見明顯的骨吸收陷窩，牙周組織形態(tài)恢復(fù)正常(圖3)。

2.3 壓力側(cè)RIP3免疫組化染色結(jié)果

A組RIP3的表達(dá)量在各時間點均無明顯差異(P>0.05)。施加正畸力后，B組RIP3的表達(dá)量增加至5 d時達(dá)到高峰，隨后開始進(jìn)行下降，在3、5 d時表達(dá)量顯著高于A組(P<0.05)。當(dāng)使用GsMTx4抑制Piezo1時，C組RIP3的表達(dá)量在3、5 d時顯著低于B組，其中在5 d時C組RIP3的表達(dá)量仍高于A組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4～5)。

2.4 壓力側(cè)MLKL免疫組化染色結(jié)果

A組MLKL的表達(dá)量在各時間點均無明顯差異(P>0.05)。施加正畸力后，B組MLKL表達(dá)量增加至3 d時達(dá)到高峰，隨后開始下降，在3～7 d時表達(dá)量顯著高于A組(P<0.05)。當(dāng)使用GsMTx4抑制Piezo1時，C組MLKL的表達(dá)量在3～7 d時均顯著低于B組，但仍均高于A組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖6～7)。

3 討 論

Piezo1是一種可以對戳刺、拉伸、剪切力等各類形式的機(jī)械刺激做出反應(yīng),并具有高度機(jī)械敏感性的離子通道，該通道呈一種類似于三聚體螺旋槳狀的結(jié)構(gòu)，利用杠桿原理將不同形式機(jī)械刺激傳遞到中心離子通道孔區(qū)域，使得離子通道開放，引起Na+、Ca2 +、Mg2 +等多種離子內(nèi)流，誘導(dǎo)膜電位去極化，從而有效完成機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程，為機(jī)體參與功能調(diào)節(jié)等多種生理過程所必需的[13,18]。Piezo1通道可被GsMTx4特異性阻斷，GsMTx4是一種從蜘蛛毒液中分離出來的富含半胱氨酸的多肽，其抑制作用類似于一種門控修改器，阻滯Piezo1的活動是通過插入通道和細(xì)胞膜脂質(zhì)臨界面，并對通道施加壓縮應(yīng)力使其變?yōu)殛P(guān)閉結(jié)構(gòu)從而選擇性地阻斷該陽離子通道[17,19]。在牙齒移動期間，牙周膜細(xì)胞可以感知機(jī)械應(yīng)力，在維持牙周穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)牙周組織重塑方面起著至關(guān)重要的作用[20]。在本實驗發(fā)現(xiàn)中，與單純加力組大鼠牙齒移動距離相比，加力+抑制劑組正畸牙向近中移動的距離明顯縮短，說明注射GsMTx4后可使大鼠牙齒移動速度減慢，提示Piezo1通道可能在正畸牙齒移動過程中起著機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，并在維持正畸牙齒速度中起著重要的調(diào)節(jié)作用。值得注意的是阻斷Piezo1通道后，牙齒移動速度變緩慢但并沒有完全停止，說明在正畸牙齒移動中，還存在其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道與Piezo1協(xié)同完成其機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程。

在正畸力的作用下，牙周膜細(xì)胞通過多種生物力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，可將外界力學(xué)信號轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)變化引起牙周組織代謝的改變及牙槽骨的改建，實現(xiàn)正畸牙齒的定向移動[21]。本課題組前期實驗已發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡作為壓力側(cè)細(xì)胞壞死機(jī)制之一[3]，可下調(diào)壓力側(cè)白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-17(interleukin-17，IL-17)炎性因子的分泌水平[4]，影響破骨細(xì)胞的分化成熟，阻礙大鼠正畸牙的移動[5]。RIP3與MLKL是導(dǎo)致壞死性凋亡發(fā)生的兩個關(guān)鍵信號因子，RIP3與RIP1結(jié)合并相互作用，通過磷酸化的方式激活，進(jìn)而招募下游分子MLKL并催化其發(fā)生磷酸化，從而觸發(fā)壞死性凋亡的生物開關(guān)，致使質(zhì)膜發(fā)生破裂，其內(nèi)容物大量釋放，進(jìn)而誘發(fā)局部的炎癥損傷[22-23]。此外，已有研究證明RIP3促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)可以不依賴于壞死性凋亡通路，其在缺乏壞死性凋亡效應(yīng)物MLKL的情況下，可促進(jìn)Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3)炎癥小體的激活及IL-1β炎性因子的成熟和分泌[24]。

本實驗結(jié)果顯示，加力組壓力側(cè)RIP3與MLKL的表達(dá)量均呈先增高后下降的趨勢，不相同的地方是RIP3的表達(dá)量在3～5 d時顯著增高，而MLKL的表達(dá)量在3～7 d時顯著增高，這均與牙齒移動速度的趨勢基本相一致，提示壞死性凋亡可能參與正畸力作用之下的鼠牙壓力側(cè)牙周組織的重建，影響牙齒移動的速度。本實驗中大鼠牙齒在正畸力的作用下均在3 d內(nèi)移動速度最快，其中單純加力組RIP3的表達(dá)量在3 d時顯著高于對照組，提示壞死性凋亡可能發(fā)生于正畸加力初期，并有加速壓力側(cè)牙周組織改建的作用，而使用抑制劑后，在3 d時RIP3的表達(dá)量顯著低于單純加力組并與對照組相比較無顯著差異，且正畸牙齒移動距離明顯縮短，說明GsMTx4在3 d時的抑制作用較為明顯，GsMTx4可通過抑制Piezo1通道減少RIP3的表達(dá)量并下調(diào)牙齒移動距離。此時，抑制劑組RIP3的表達(dá)量雖與對照組無顯著差異，但大鼠牙齒仍在3 d內(nèi)移動最快，這些結(jié)果表明正畸牙齒的移動是一個復(fù)雜的過程，受多種因素的影響，壞死性凋亡只是影響牙齒移動的其中一個因素。加力時使用GsMTx4后，RIP3與MLKL的表達(dá)量與單純加力組在不同時間點相比較有所下降，說明抑制Piezo1通道，可下調(diào)壓力側(cè)牙周組織壞死性凋亡的發(fā)生，從而抑制破骨細(xì)胞的生成和分化，阻礙牙齒移動。然而在壞死性凋亡發(fā)生的過程中，MLKL作為RIP3的下游分子，卻與RIP3表達(dá)量變化并不完全一致，這說明RIP3可能還通過別的途徑參與和壞死性凋亡無關(guān)的其他信號通路來影響牙周組織的改建，推測RIP3在獨立于其激酶功能和底物MLKL情況下，可能通過促進(jìn)caspase-8的活性來激活與NLRP3相關(guān)的caspase-1，進(jìn)而調(diào)控炎性細(xì)胞因子的釋放，介導(dǎo)壓力側(cè)牙周組織的炎癥反應(yīng)，同時也提示Piezo1抑制劑GsMTx4在不同時間點對RIP3參與的不依賴于MLKL的其他炎癥通路可能同樣起著很大程度的抑制作用，但具體途徑與機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實驗通過建立大鼠牙齒移動的正畸模型，發(fā)現(xiàn)Piezo1通道在大鼠正畸牙齒移動過程中可能起著機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，阻斷Piezo1通道可減少正畸牙壓力側(cè)牙周組織壞死性凋亡的發(fā)生，影響牙周組織改建，阻礙正畸牙齒的移動，然而Piezo1影響壞死性凋亡的具體分子機(jī)制尚不清楚，仍需要結(jié)合更多的實驗進(jìn)一步闡明。