李慧峰，孔祥鵬，孟霜，李慧，裴妙榮#（.山西中醫(yī)藥大學中藥與食品工程學院，山西晉中03069；.山西省中西醫(yī)結合醫(yī)院中心實驗室，太原 03003）

復方茴芹顆粒是根據山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院王世民國醫(yī)大師臨床經驗方研制而成的中藥新制劑，由羊紅膻、葛根、山楂、枸杞子、西洋參5味中藥組成，具有補腎氣、化血瘀的功效，可用于治療良性前列腺增生[1]。復方茴芹顆粒處方成分復雜，且尚缺乏質量控制研究。中藥指紋圖譜能較全面地反映中藥內在化學成分的種類與數量，評價和控制中藥材及復方的質量[2-3]；其結合化學模式識別技術能夠對高效液相色譜（HPLC）數據進行綜合處理和分析，科學、全面地反映中藥及中藥復方的質量[4]。此外，多成分含量測定可以更全面地反映制劑的質量[5]。因此，本研究在完成復方茴芹顆粒（原名“羊紅膻癃閉平顆粒”）制備工藝及中試生產的基礎上[6]，建立復方茴芹顆粒的HPLC指紋圖譜，并結合化學模式識別技術對該顆粒質量進行評價，同時測定該顆粒中綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷及異綠原酸C 8種有效成分的含量，旨在為全面有效地控制該顆粒制劑質量以及新藥開發(fā)提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

2695型HPLC儀及配套的2998 PAD檢測器、Empower2色譜工作站均購自美國Waters公司；AB135-S型十萬分之一分析天平購自瑞士Mettler Toledo公司；FA2104型萬分之一分析天平購自上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠；SB-800 DTD型超聲波萃取儀購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

葛根素、木犀草素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷、綠原酸、大豆苷、大豆苷元、沒食子酸的對照品均購自中國食品藥品檢定研究院（批號分別為110752-201816、111968-201602、110753-201413、111738-201904、111502-202003、110831-201906，純度均大于99%）；3′-甲氧基葛根素、新綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C的對照品均購自成都普菲德生物技術有限公司（批號分別為17111305、19081403、19120606、18070401，純度均大于99%）；芹菜素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷對照品（批號20120601，純度大于99%）購自上海詩丹德標準技術服務有限公司。復方茴芹顆粒樣品共10批（編號S1～S10），均由山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院提供，批號分別為20190506、20190724、20190725、20190726、20191103、20191104、20191105、20201114、20201116、20201118，規(guī)格為10 g/袋。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取復方茴芹顆粒約1 g，研細，精密稱定，精密加入75%甲醇25 mL，稱質量；超聲萃?。üβ?50 W，頻率40 kHz，下同）30 min，放冷，再次稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取沒食子酸、新綠原酸、綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異綠原酸C及大豆苷元對照品適量，精密稱定，置于同一25 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲使其完全溶解，放冷后用甲醇定容，搖勻，濾過，即得上述成分質量濃度分別為 0.024、0.037、0.073、0.317、0.116、0.102、0.047、0.063、0.035、0.054、0.047 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為SunFireTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫為30℃；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，5%A→10%A；25～35 min，10%A→15%A；35～46 min，15%A→17%A；46～60 min，17%A→22%A；60～80 min，22%A→42%A）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為278 nm；進樣量為10 μL。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一復方茴芹顆粒供試品溶液（樣品S1），按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以10號峰（葛根素的色譜峰，該峰出峰時間居中、峰形好，下同）為參照峰，測得26個共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD分別為0.07%～0.30%、0.57%～1.72%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取同一復方茴芹顆粒供試品溶液（樣品S1），于室溫放置0、3、6、9、12、15 h時，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以10號峰為參照峰，測得26個共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD分別為0.06%～0.48%、0.72%～1.83%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置15 h內穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批復方茴芹顆粒（樣品S1）6份，分別按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以10號峰為參照峰，測得26個共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD分別0.46%～1.78%、0.93%～2.31%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度分析

2.4.1 指紋圖譜的建立 按“2.1.1”項下供試品溶液的制備方法及“2.2”項下色譜條件建立10批復方茴芹顆粒的指紋圖譜。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012版）》對10批復方茴芹顆粒的HPLC圖進行分析處理，采用中位數法生成對照指紋圖譜。結果顯示，10批復方茴芹顆粒樣品共有26個共有峰。10批復方茴芹顆粒樣品的HPLC指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）見圖1。

圖1 10批復方茴芹顆粒樣品的HPLC指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）

2.4.2 共有峰的標定與指認 取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，即得混合對照品溶液的色譜圖（圖2）。根據10批復方茴芹顆粒HPLC指紋圖譜中各色譜峰的相對保留時間，并結合圖2，指認出11個共有峰，分別為沒食子酸、新綠原酸、綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、木犀草素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異綠原酸C、大豆苷元。

圖2 混合對照品溶液的色譜圖

2.4.3 相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件（2012版）》對10批復方茴芹顆粒進行相似度評價，結果顯示，10批復方茴芹顆粒的相似度均大于0.900，表明這10批樣品之間的化學成分基本一致，制劑工藝相對穩(wěn)定，與對照指紋圖譜相似度較高。

2.5 化學模式識別分析

2.5.1 聚類分析 利用SPSS 22.0軟件，將10批復方茴芹顆粒指紋圖譜中26個共有峰的峰面積作為參量，運用Ward法、平方歐氏距離法進行系統(tǒng)聚類分析[7]，并繪制樹狀圖（圖3）。結果顯示，當平方歐氏距離為5時，10批復方茴芹顆粒可聚為4類，第1類為S2、S3、S6，第2類為S4、S8、S10，第3類為S7，第4類為S1、S5、S9。該聚類分析結果提示，雖然10批復方茴芹顆粒的指紋圖譜相似度較好，但化學成分含量可能存在一定差異。

圖3 10批復方茴芹顆粒樣品的聚類分析樹狀圖

2.5.2 主成分分析 利用SPSS 22.0、SIMCA 14.0軟件，首先將10批復方茴芹顆粒樣品的26個共有峰進行ZScore標準化處理，然后導入軟件進行主成分分析[8-10]。結果顯示，復方茴芹顆粒中共有4個主成分的特征值大于1，方差貢獻率分別為47.144%、18.665%、16.737%、8.781%，累計方差貢獻率可達91.327%，這表明通過因子分析降維處理后所提取的4個主成分可代表復方茴芹顆粒指紋圖譜中26個共有峰的主要信息，且主成分1的特征值最大，所涵蓋信息最多。進一步采用SIMCA 14.0軟件分析發(fā)現，10批復方茴芹顆?？删蹫?類，第1類為S2、S3、S6，第2類為S4、S8、S10，第3類為S7，第4類為S1、S5、S9（圖4），由此可知，該主成分分析結果與聚類分析結果一致。

圖4 10批復方茴芹顆粒的主成分分析圖

2.6 8種有效成分的含量測定

2.6.1 供試品溶液的制備 制備方法同“2.1.1”項。

2.6.2 混合對照品溶液的制備 取綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異綠原酸C的對照品各適量，精密稱定，置于同一25 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲使其完全溶解，放冷后用甲醇定容，搖勻，濾過，即得上述成分質量濃度分別為0.145、0.630、0.320、0.348、0.094、0.126、0.047、0.108 mg/mL的混合對照品溶液。

2.6.3 色譜條件 色譜條件同“2.2”項。

2.6.4 專屬性考察 取“2.6.1”“2.6.2”項下供試品溶液和混合對照品溶液，按“2.6.3”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果顯示，各成分色譜峰與其相鄰色譜峰的分離度良好，說明該方法專屬性良好。結果見圖5。

圖5 專屬性考察結果

2.6.5 線性關系考察 分別精密吸取“2.6.2”項下混合對照品溶液 0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.60、2.00 mL，置于不同的2 mL容量瓶中，以甲醇定容，搖勻，按“2.6.3”項下色譜條件進樣分析。以對照品質量濃度為橫坐標（X）、峰面積積分值為縱坐標（Y）進行線性回歸，結果見表1。

表1 各成分線性關系考察結果

2.6.6 精密度試驗 取同一份供試品溶液（樣品S1），按“2.6.3”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，測得綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及異綠原酸C峰面積的RSD分別為0.86%、1.27%、2.09%、1.23%、2.17%、1.64%、2.15%、2.27%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.6.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（樣品S1），于室溫放置0、3、6、9、12、15 h后，按“2.6.3”項下色譜條件進樣測定，測得綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及異綠原酸C峰面積的RSD分別為1.02%、1.18%、1.96%、1.07%、2.09%、2.04%、2.28%、2.36%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置15 h內穩(wěn)定性良好。

2.6.8 重復性試驗 取同一批復方茴芹顆粒（樣品S1）6份，研細，分別按“2.6.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.3”項下色譜條件進樣測定，采用外標法測得綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及異綠原酸C的平均含量分別為1.35、16.97、4.36、3.24、0.84、0.42、0.34、0.32 mg/g，RSD 分 別 為2.15%、1.67%、1.75%、1.63%、2.16%、2.12%、2.28%，2.19%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.6.9 加樣回收率試驗 稱取已知各成分含量的復方茴芹顆粒（樣品S1）9份，每份0.5 g，精密稱定；按照1∶0.5、1∶1、1∶1.5質量比加入各成分對照品，每個比例3份，分別按“2.6.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.3”項下色譜條件進樣測定，計算得綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷以及異綠原酸C的平均加樣回收率分別為98.73%、101.27%，100.21%、102.51%、93.33%、94.75%、95.32%、98.99%，RSD分別為2.31%、1.39%、1.29%、2.06%、2.58%、2.39%、2.17%、2.36%（n＝3），表明該方法準確度良好。

2.6.10 樣品含量測定 取10批復方茴芹顆粒，研細，按“2.6.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.3”項下色譜條件進樣測定，采用外標法計算各成分的含量，平行測定3份，取平均值。結果見表2。

表2 10批復方茴芹顆粒中8種成分的含量測定結果（n=3，mg/g）

3 討論

本研究首先對乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液等流動相進行了考察。結果發(fā)現，當使用乙腈-水、甲醇-水或乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相時，色譜峰分離效果較差；當使用乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動相時，出峰數較多，色譜峰分離度較好且基線平滑，故選擇乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動相。隨后筆者在200～400 nm下進行全波長掃描，結果顯示，在278 nm波長下色譜信息全面，色譜峰出峰較多且特征性強，故選擇278 nm為檢測波長。

本研究建立了復方茴芹顆粒的指紋圖譜，共確定了26個共有峰，并指認出11個共有峰，分別為沒食子酸、新綠原酸、綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷、木犀草素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、異綠原酸C及大豆苷元。經相似度評價發(fā)現，10批復方茴芹顆粒樣品的整體差異較小。進一步經聚類分析和主成分分析發(fā)現，10批復方茴芹顆?？删蹫?類，其中S2、S3、S6為一類，S4、S8、S10為一類，S7為一類，S1、S5、S9為一類，這提示復方茴芹顆粒不同批次間的化學成分含量可能存在一定差異。結合文獻資料發(fā)現，該方君藥羊紅膻中含有綠原酸、木犀草素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷、異綠原酸A、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷及異綠原酸C等成分[11]；臣藥葛根中含有綠原酸、葛根素、3′-甲氧基葛根素、大豆苷等成分[12]，這8種成分均具有抗前列腺增生、抗炎、抗氧化、降血壓、保護心臟、抗動脈粥樣硬化等作用[13-15]，與本制劑的藥效作用相符?；诖?，本研究也對這些成分建立了含量測定方法。

綜上所述，本研究成功建立了復方茴芹顆粒的指紋圖譜及多成分含量測定方法，可為該顆粒劑的質量控制提供依據。