趙方舒，張愛均，劉苗苗，田景振，侯林，3#（.山東中醫(yī)藥大學藥學院，濟南50355；.山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，濟南 5009；3.山東中醫(yī)藥大學青島中醫(yī)藥科學院，山東青島 66）

全世界每年有29萬～65萬人死于流感，而甲型H1N1流感病毒一直是全世界季節(jié)性流感的主要病原體[1]。流感造成的死亡通常是由繼發(fā)性細菌性肺炎引起的，與流感相關(guān)的重癥病例和死亡病例超過95%伴有細菌感染[2]。肺炎鏈球菌是繼發(fā)性細菌感染中最常見的細菌之一[3]。盡管有抗生素和流感疫苗的使用，病毒合并細菌感染導致的死亡仍是一個嚴重的問題。

金貝口服液由黃芪、黨參、北沙參、丹參、當歸、川芎、金銀花、連翹、黃芩、川貝母、清半夏、甘草共12味中藥材組成，具有益氣養(yǎng)陰、祛痰化瘀的功效，主要用于特發(fā)性肺纖維化屬氣陰兩虛兼痰瘀交阻證的治療。方中黃芪、黃芩以及丹參均有一定的抗H1N1病毒活性[4-6]；且黃芪的乙醇提取物對變形桿菌、傷寒沙門氏菌等多種常見細菌均有一定的抑制作用[6]；丹參的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌等9種常見細菌均有明顯抑制作用[6]。然而，目前對金貝口服液抗菌、抗病毒作用的研究較少。鑒于此，本研究擬建立體內(nèi)H1N1病毒感染小鼠模型和繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染小鼠模型，探究金貝口服液對H1N1病毒感染和繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染的治療作用，以期為其臨床抗病毒應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有LC480型實時熒光定量PCR儀[羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司]、Spectra Max M5型酶標儀（美國Molecular Devices公司）、Sorvall ST 8R型高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）、MJ-250-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）、CKX-31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 主要藥品與試劑

金貝口服液（批號2101001，規(guī)格10 mL/支）購自山東宏濟堂制藥集團股份有限公司；磷酸奧司他韋膠囊（批號02220001031，規(guī)格以奧司他韋計為75 mg/粒）購自宜昌東陽光長江藥業(yè)股份有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（批號W0202）購自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Green One-Step實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試劑盒（批號D7268M）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號分別為9680025291221、9680010021121、9680026141221）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；小鼠干擾素 β（interferon-β，IFN-β）、IL-17、IL-23 ELISA試劑盒（批號均為06/2022）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級BALB/c雌性小鼠，6周齡，體質(zhì)量為14～18 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2021-0006。所有小鼠隨機分籠飼養(yǎng)（每籠8只），飼養(yǎng)期間自由攝食、飲水，保持12 h晝夜節(jié)律，飼養(yǎng)環(huán)境通風良好，溫度適宜（20～25℃）。本研究實驗方案合理，符合動物實驗的“3R”原則。

1.4 病毒毒株和細菌株

甲型流感病毒A/PR/8/34株（H1N1）由山東省醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所提供。肺炎鏈球菌Streptococcus pneumoniae購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，編號為BNCC338425。

2 方法

2.1 金貝口服液抗小鼠甲型H1N1流感病毒作用研究

2.1.1 分組、造模、給藥及取樣 按隨機數(shù)字表法將48只小鼠隨機分為6組，每組8只，分別為空白組、模型組、磷酸奧司他韋膠囊組（陽性對照組，25.6 mg/kg，為臨床等效劑量）和金貝口服液高、中、低劑量組（劑量分別為15.6、7.8、3.9 mL/kg，分別為成人劑量的2、1、0.5倍等效劑量）。小鼠適應性飼養(yǎng)5 d后，空白組小鼠滴鼻20 μL生理鹽水，其余各組小鼠經(jīng)乙醚麻醉后滴鼻20 μL含0.8個半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）的H1N1病毒液[7]。滴鼻后2 h，以小鼠灌胃容積0.1 mL/10 g為標準，空白組和模型組小鼠均灌胃蒸餾水，其余組小鼠均灌胃相應藥液，每日1次，連續(xù)灌胃6 d。每天監(jiān)測小鼠體質(zhì)量并計算體質(zhì)量變化率[體質(zhì)量變化率（%）＝每日體質(zhì)量/初始體質(zhì)量×100%]。末次灌胃24 h后，將小鼠摘眼球取血，而后處死，取其肺組織。全血在4°C下放置過夜后，以9 000 r/min離心20 min，取上清，置于-80℃冰箱保存，備用。稱定小鼠肺組織質(zhì)量并計算肺指數(shù)[肺指數(shù)（%）＝肺組織質(zhì)量/體質(zhì)量×100%]，然后將一部分肺組織用4%多聚甲醛固定，另一部分肺組織于-80℃冰箱中保存，備用。以上實驗均在BSL-2實驗室中進行。

2.1.2 小鼠肺病毒載量測定 采用qRT-PCR法測定。取“2.1.1”項下-80℃保存的小鼠肺組織置于組織研磨機中制備組織勻漿，以1 000 r/min離心3 min，取上清，按病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒方法提取肺組織中總RNA。采用SYBR Green One-Step qRT-PCR試劑盒對H1N1病毒NP基因mRNA的相對表達量進行檢測。qRT-PCR程序設定如下：50℃反轉(zhuǎn)錄20 min；95℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸20 s，總共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析NP基因mRNA的相對表達量，以NP基因mRNA的相對表達量來反映病毒載量。引物由北京擎科生物科技有限公司設計并合成，引物序列及擴增產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物序列及擴增產(chǎn)物大小

2.1.3 小鼠肺組織病理學觀察 取“2.1.1”項下經(jīng)4%多聚甲醛固定后的肺組織，常規(guī)制備石蠟切片（厚度5 μm），行HE染色，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

2.1.4 小鼠血清中炎癥細胞因子檢測 取“2.1.1”項下血清，采用ELISA法測定各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，具體操作按對應試劑盒說明書方法進行。

事實上，在侵害集體組織成員權(quán)益糾紛、土地承包經(jīng)營權(quán)糾紛等民事案件中，基層法院通常都會從案件當事人數(shù)量、潛在案件的規(guī)模等角度考量涉訴信訪的風險。對于可能有較大涉訴信訪風險的案件，法院往往采取不立案且不出具相應法律文書的方式將糾紛排除在法院系統(tǒng)之外。盡管當事人可能就應當立案而不立案的情形進行信訪，但是往往因其缺乏已經(jīng)向法院申請立案的證據(jù)而難以進入信訪程序。

2.2 金貝口服液對繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染小鼠死亡的保護作用研究

將48只小鼠按隨機數(shù)字表法分為6組，每組8只，分別為空白組、細菌單感染組、病毒單感染組、病毒-細菌共感染組、磷酸奧司他韋膠囊組（陽性對照組，25.6 mg/kg，為成人臨床等效劑量）和金貝口服液組（15.6 mL/kg）。將小鼠適應性飼養(yǎng)5 d后，除空白組和細菌單感染組小鼠滴鼻20 μL生理鹽水外，其余各組小鼠均滴鼻含0.5個LD50的H1N1病毒液20 μL[8]。造模2 h后，以小鼠灌胃容積0.1 mL/10 g為標準，空白組、細菌單感染組、病毒單感染組、病毒-細菌共感染組小鼠均灌胃蒸餾水，給藥組小鼠灌胃對應藥液，每日1次，連續(xù)灌胃6 d。第6天灌胃2 h后，空白組和病毒單感染組小鼠滴鼻50 μL無菌蒸餾水，其余各組小鼠均滴鼻含1×109個菌落形成單位（colony forming unit，CFU）的肺炎鏈球菌液50 μL[2，9]。每日繼續(xù)按上述方法灌胃并監(jiān)測小鼠體質(zhì)量，直至病毒滴鼻后的第14天。

2.3 金貝口服液抗繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染作用研究

2.3.1 分組、造模、給藥與取樣 將48只小鼠按隨機數(shù)字表法分為6組，每組8只，分組、造模、灌胃方式等均同“2.2”項下。肺炎鏈球菌感染24 h后，將小鼠摘眼球取血（按“2.1.1”項下方法制備血清）并處死，然后于超凈工作臺中暴露其頸部氣道，利用18G靜脈留置針進行鼻腔灌洗，每次注入0.2 mL無菌水，收集灌洗液至1.5 mL EP管中[2]。同時，于無菌環(huán)境下取小鼠肺組織，稱質(zhì)量后計算小鼠肺指數(shù)（計算公式同“2.1.1”項下）。將肺組織置于組織研磨機中制備勻漿，以1 000 r/min離心3 min后取上清。以上實驗均在BSL-2實驗室中進行。

2.3.2 小鼠鼻腔和肺部細菌載量測定 取哥倫比亞血平板若干，每個平板等分成3個區(qū)，取“2.3.1”項下鼻腔灌洗液和肺組織勻漿上清液各10 μL，分別接種于血平板上，每個樣本做3個重復位點。接種完畢后，先將血平板正置于細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5 h，再倒置培養(yǎng)16 h，然后進行菌落計數(shù)[2]。

2.3.3 小鼠血清中IFN-β、IL-17、IL-23水平測定 取“2.3.1”項下血清，采用ELISA法檢測小鼠血清中IFN-β、IL-17、IL-23水平，具體操作按相應試劑盒說明書進行。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，方差不齊時組間兩兩比較采用Dunnett’s T3檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 金貝口服液抗小鼠甲型H1N1流感病毒作用

3.1.1 小鼠體質(zhì)量及肺指數(shù)測定結(jié)果 由小鼠體質(zhì)量變化率可知：自造模第4天起，除空白組外，其余各組小鼠的體質(zhì)量均有明顯的下降趨勢。造模第6天時，與空白組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），肺指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠的體質(zhì)量均顯著升高（P＜0.05），肺指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

圖1 金貝口服液對病毒感染小鼠體質(zhì)量變化率和肺指數(shù)的影響（±s，n=8）

3.1.2 小鼠肺病毒載量測定結(jié)果 與空白組（NP基因mRNA的相對表達量為0.09±0.02）比較，模型組小鼠的肺病毒載量（NP基因mRNA的相對表達量為1.08±0.46）顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，磷酸奧司他韋膠囊組和金貝口服液高、中劑量組的肺病毒載量（NP基因mRNA的相對表達量分別為0.59±0.27、0.70±0.35、0.71±0.13）均顯著降低（P＜0.05），金貝口服液低劑量組小鼠的肺病毒載量（NP基因mRNA的相對表達量為0.99±0.13）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 金貝口服液對病毒感染小鼠肺組織病理形態(tài)的影響（HE染色，×200）

3.1.4 小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平測定結(jié)果 與空白組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，磷酸奧司他韋膠囊組小鼠血清中IL-6、IL-1β水平和金貝口服液高、中劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 金貝口服液對病毒感染小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響（±s，n=8，pg/mL）

表2 金貝口服液對病毒感染小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響（±s，n=8，pg/mL）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

分組空白組模型組磷酸奧司他韋膠囊組金貝口服液高劑量組金貝口服液中劑量組金貝口服液低劑量組IL-1β 90.60±1.79 101.67±14.07a 90.52±6.81b 93.50±12.65b 93.46±4.61b 106.64±11.20 TNF-α 477.27±51.43 530.15±14.35a 501.76±8.45 490.92±30.41b 494.56±16.82b 497.90±16.27 IL-6 96.28±5.01 106.28±8.10a 97.30±5.28b 94.89±14.75b 96.94±5.39b 106.27±6.60

3.2 金貝口服液對繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染小鼠死亡的保護作用考察結(jié)果

由小鼠存活曲線可知，小鼠感染H1N1病毒后可正常存活至感染后第14天。本研究中，在第6天接種相同劑量肺炎鏈球菌后，細菌單感染組小鼠可正常存活，病毒-細菌共感染組小鼠從感染H1N1病毒第7天起開始死亡，最終死亡率達87.5%，明顯高于細菌單感染組（0）和病毒單感染組（12.5%）。與病毒-細菌共感染組小鼠比較，磷酸奧司他韋膠囊組和金貝口服液組小鼠的存活時間顯著延長，死亡率（均為37.5%）顯著降低。結(jié)果見圖3。

圖3 金貝口服液對繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染小鼠14 d存活情況的影響

3.3 金貝口服液體內(nèi)抗繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染考察結(jié)果

3.3.1 小鼠肺指數(shù)測定結(jié)果 與空白組比較，病毒單感染組、病毒-細菌共感染組小鼠的肺指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；細菌單感染組小鼠肺指數(shù)也有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與細菌單感染組及病毒單感染組比較，病毒-細菌共感染組小鼠的肺指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）。與病毒-細菌共感染組比較，磷酸奧司他韋膠囊組和金貝口服液組小鼠的肺指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖4 金貝口服液對繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染小鼠肺指數(shù)的影響（±s，n=8）

3.3.2 小鼠鼻腔和肺部細菌載量測定結(jié)果 空白組和病毒單感染組小鼠未感染細菌。與空白組比較，除病毒單感染組外的其余各組小鼠鼻腔與肺部的細菌載量均顯著升高（P＜0.05）。與細菌單感染組比較，病毒-細菌共感染組小鼠鼻腔與肺部的細菌載量均顯著升高（P＜0.05）。與病毒-細菌共感染組比較，磷酸奧司他韋膠囊組和金貝口服液組小鼠鼻腔與肺部的細菌載量均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 金貝口服液對繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染小鼠鼻腔和肺部細菌載量的影響（±s，n=8）

表3 金貝口服液對繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染小鼠鼻腔和肺部細菌載量的影響（±s，n=8）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與細菌單感染組比較，P＜0.05；c：與病毒單感染組比較，P＜0.05；d：與病毒-細菌共感染組比較，P＜0.05

肺部細菌載量（×108）/CFU 0 35.88±9.84a 0 107.90±15.12abc 57.22±13.77acd 62.24±16.19acd分組空白組細菌單感染組病毒單感染組病毒-細菌共感染組磷酸奧司他韋膠囊組金貝口服液組鼻腔細菌載量（×108）/CFU 0 4.11±1.94a 0 7.68±1.70abc 5.67±1.33acd 5.89±0.88acd

3.3.3 小鼠血清中IFN-β、IL-17、IL-23水平測定結(jié)果 與空白組比較，細菌單感染組、病毒單感染組、病毒-細菌共感染組小鼠血清中IFN-β水平均顯著升高（P＜0.05），細菌單感染組小鼠血清中IL-17、IL-23水平均顯著升高（P＜0.05）。病毒-細菌共感染組小鼠血清中IFN-β水平顯著高于細菌單感染組和病毒單感染組（P＜0.05），IL-17、IL-23水平均顯著低于細菌單感染組（P＜0.05）。與病毒-細菌共感染組比較，磷酸奧司他韋膠囊組和金貝口服液組小鼠血清中IFN-β水平均顯著降低（P＜0.05），IL-17、IL-23水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表4。

表4 金貝口服液對繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染小鼠血清中IFN-β、IL-17、IL-23水平的影響（±s，n=8，pg/mL）

表4 金貝口服液對繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染小鼠血清中IFN-β、IL-17、IL-23水平的影響（±s，n=8，pg/mL）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與細菌單感染組比較，P＜0.05；c：與病毒單感染組比較，P＜0.05；d：與病毒-細菌共感染組比較，P＜0.05

分組空白組細菌單感染組病毒單感染組病毒-細菌共感染組磷酸奧司他韋膠囊組金貝口服液組IFN-β 333.13±11.81 348.70±6.96ac 377.15±16.20ab 407.97±17.40abc 348.12±16.04cd 360.30±17.64cd IL-17 33.53±0.59 38.16±3.25a 36.42±1.01 34.78±0.73b 37.49±1.91d 37.25±1.75d IL-23 61.28±3.50 67.57±8.70a 59.47±2.44b 57.27±2.78b 63.51±2.80d 64.05±3.77d

4 討論

磷酸奧司他韋膠囊可以在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為對神經(jīng)氨酸酶有抑制作用的活性代謝物，從而抑制甲型H1N1流感病毒的復制，常用于預防和治療甲型和乙型流感[10]，因此本研究以其為抗病毒研究的陽性對照藥物。在單純抗甲型H1N1流感病毒感染實驗中，金貝口服液可以明顯抑制由H1N1病毒感染引起的小鼠體質(zhì)量下降，降低由于H1N1病毒感染引起的小鼠肺指數(shù)升高，減輕H1N1病毒感染小鼠的肺組織病變程度，減少H1N1病毒感染后機體TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌，表現(xiàn)出較好的抗炎作用，并且其還可顯著抑制H1N1病毒在肺中的復制（通過NP基因mRNA相對表達量來反映）。以上結(jié)果表明，金貝口服液有一定的體內(nèi)抗甲型H1N1流感病毒感染作用。

在H1N1-肺炎鏈球菌共感染實驗中，為模擬通常人類流感為輕癥的情況，小鼠滴鼻病毒量僅含0.5個LD50[8]。14 d生存曲線結(jié)果表明，病毒-細菌共感染組小鼠的死亡率明顯高于細菌單感染組和病毒單感染組，可知重疊感染嚴重威脅到小鼠生存；與病毒-細菌共感染組小鼠相比，金貝口服液組小鼠的存活時間延長、死亡率降低，提示金貝口服液對H1N1-肺炎鏈球菌共感染小鼠的生存具有一定的保護作用。小鼠肺指數(shù)測定結(jié)果表明，與細菌單感染組小鼠和病毒單感染組小鼠相比，病毒-細菌共感染組小鼠的肺指數(shù)顯著升高，可知病毒-細菌共感染加重了小鼠肺部炎癥程度；而金貝口服液給藥后可使病毒-細菌共感染小鼠的肺指數(shù)顯著降低，提示該藥發(fā)揮了一定的抗肺部炎癥作用。鼻腔與肺部細菌載量實驗結(jié)果表明，與細菌單感染組小鼠相比，病毒-細菌共感染組小鼠體內(nèi)細菌載量顯著升高，說明H1N1病毒在一定程度上增加了機體對肺炎鏈球菌的易感性；而金貝口服液給藥后可降低病毒-細菌共感染小鼠體內(nèi)的細菌載量，提示該藥可在一定程度上抵御肺炎鏈球菌的重疊感染。

流感病毒感染后引起的17型免疫抑制是其改變機體細菌防御功能的機制之一[11]，而Ⅰ型干擾素的過量分泌可以抑制機體17型免疫，從而增加機體對繼發(fā)性細菌感染的易感性[12]。與空白組相比，細菌單感染組小鼠血清中IL-17、IL-23的水平均顯著升高，提示機體啟動了17型免疫功能。與細菌單感染組和病毒單感染組相比，病毒-細菌共感染組小鼠血清中IFN-β水平顯著升高，可知共感染引起了IFN-β的過量表達；與細菌單感染組相比，病毒-細菌共感染組小鼠IL-17、IL-23的水平均顯著下降，說明機體的17型免疫功能被IFN-β抑制。金貝口服液給藥后可明顯降低病毒-細菌共感染組小鼠血清中的IFN-β水平，升高其血清中IL-17、IL-23水平，提示該藥可使小鼠的17型免疫功能在一定程度上恢復。以上結(jié)果表明，金貝口服液具有一定的抵抗繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染的作用。

綜上所述，金貝口服液具有一定的抗小鼠甲型H1N1流感病毒感染作用，且能通過恢復17型免疫功能幫助機體抵抗繼發(fā)性肺炎鏈球菌感染，但其具體作用機制仍需進一步研究。