陳聰，莊素琪，江濤，沈志濱，陳艷芬，司徒瑩，楊超燕，唐春萍，4#（.廣東藥科大學中藥學院，廣州 50006；2.廣東藥科大學實驗動物中心，廣州 50006；3.廣州市新藥篩選模型系統(tǒng)建設與應用重點實驗室，廣州 50006；4.廣東省局部精確給藥系統(tǒng)工程中心，廣州 50006）

皮膚和軟組織感染（skin and soft tissue infection，SSTI）為外科常見的感染性疾病，金黃色葡萄球菌是其最主要的致病菌[1-2]?？股氐某霈F(xiàn)使SSTI得到了有效控制，但隨著抗生素的廣泛應用，具有多重耐藥性特征的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）在全球廣泛流行[3-4]。目前臨床上用于治療SSTI的局部外用抗生素主要有紅霉素、夫西地酸、莫匹羅星等[2]，而MRSA對紅霉素具有高度耐藥性，耐藥率高達85%[5]，MRSA和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus aureus，MSSA）對夫西地酸、莫匹羅星的敏感性在全球部分地區(qū)也呈現(xiàn)明顯的下降趨勢[6-7]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)許多天然產(chǎn)物具有較好的抗菌效果[8-9]，因此從天然產(chǎn)物中尋找新的治療SSTI的藥物具有重要意義。

香鱗毛蕨Dryopteris fragrans（L.）Schott為鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物，民間常用香鱗毛蕨的水提液涂搽患處來治療牛皮癬、皮疹、皮炎、痤瘡等[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，香鱗毛蕨中含量最高的間苯三酚類單體化合物黃綿馬酸BB（其化學結(jié)構(gòu)式見圖1）對皮膚癬菌（如紅色毛癬菌）[11]、SSTI致病菌（如金黃色葡萄球菌）[12-13]均具有較好的體外抗菌活性?；诖?，本研究采用平板法、棋盤稀釋法以及小鼠皮膚膿腫模型進一步綜合評價黃綿馬酸BB對金黃色葡萄球菌（MRSA和MSSA）的體內(nèi)外抗菌作用及機制，以期為該化合物的開發(fā)及利用提供參考。

圖1 黃綿馬酸BB的化學結(jié)構(gòu)式

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有BKQ-Z301型高壓滅菌鍋（廣州浩翰儀器有限公司），E-1010型電熱恒溫恒濕培養(yǎng)箱（德國Memmert公司），SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），Infinite 200 PRO型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司），E-1010型離子濺射儀、S-3400N型掃描電鏡（日本Hitachi公司）。

1.2 主要藥品與試劑

黃綿馬酸BB由廣東藥科大學中藥學院中藥化學教研室提供，批號為GC-CZ-1809010，純度大于98%；莫匹羅星對照品（批號N0825A，純度大于99%）、莫匹羅星軟膏（批號18010176）均購自中美天津史克制藥有限公司；紅霉素對照品（批號M0726A，純度大于99%）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；夫西地酸對照品（批號Z19J6Q1，純度大于99%）購自上海源葉生物科技有限公司；頭孢西丁鈉對照品（批號YQ200524，純度大于99%）購自深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司；CAMHB肉湯培養(yǎng)基（批號3302092）、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號1067752）均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌ATCC29213（質(zhì)控菌株）購自廣東省微生物菌種保藏中心。10株MRSA（編號MRSA11～MRSA20）和 13株 MSSA（編號 MSSA23～MSSA28、MSSA32～MSSA38）均由廣東萊恩醫(yī)藥研究院有限公司惠贈。

1.4 動物

本研究所用動物為SPF級KM小鼠，雌性，體質(zhì)量18～22 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2018-0002。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF標準，溫度為20～25℃，相對濕度為40%～70%。本動物實驗經(jīng)廣東藥科大學實驗動物倫理委員會審查并批準執(zhí)行（批準號為gdpulac2019215）。

2 方法

2.1 黃綿馬酸BB對受試菌株的體外抗菌作用考察

2.1.1 菌液的制備 受試菌株在CAMHB肉湯培養(yǎng)基中復蘇18～24 h，再接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于35℃恒溫培養(yǎng)18～24 h至對數(shù)生長期，然后用0.9%無菌生理鹽水快速吹打菌落，收集菌液，用麥氏比濁管法調(diào)整菌液濃度至1.0×108CFU/mL，備用。

2.1.2 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定 采用CLSI M07-A9方案中微量稀釋法進行測定。將受試菌菌液濃度調(diào)整至1.0×106CFU/mL，取100 μL接種于96孔板中，再加入100 μL各藥物的倍比稀釋溶液（黃綿馬酸BB、莫匹羅星、紅霉素、夫西地酸的終質(zhì)量濃度范圍分別為2.5～1 280.0、0.062 5～5 120、0.125～5 120、0.012 5～5 120 μg/mL），于35 ℃培養(yǎng)18～24 h，肉眼觀察孔內(nèi)受試菌的生長情況，若孔內(nèi)無細菌生長，則該孔對應的濃度即為藥物的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。從未見細菌生長的孔中取20 μL液體涂于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于35℃培養(yǎng)18～24 h，肉眼觀察培養(yǎng)基上受試菌的生長情況，若培養(yǎng)基上無細菌生長，則該孔對應的濃度即為藥物的最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。每次實驗均使用金黃色葡萄球菌ATCC29213作為質(zhì)控菌株，頭孢西丁作為質(zhì)控藥物，若測得頭孢西丁的MIC范圍為1～4 μg/mL，則該方法可靠。以上操作重復3次，測定結(jié)果用幾何均值表示。

2.1.3 時間-殺菌曲線的繪制 選擇對黃綿馬酸BB敏感且穩(wěn)定性好的MRSA11和MSSA23作為受試菌，并將受試菌菌液濃度調(diào)整至1.0×106CFU/mL，然后設置黃綿馬酸BB中、高濃度組（濃度分別為MIC、2MIC），同時設置對照組和莫匹羅星中、高濃度組（濃度分別為MIC、2MIC）。在試管中加入各組藥液1.0 mL后再加入等量菌液（對照組僅含菌液不含藥液），于35℃振蕩培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)0、1、2、4、6、8、12、16、20、24、36 h時取樣，采用平板法計算活菌數(shù)并繪制時間-殺菌曲線。殺菌作用的判定標準：細菌存活數(shù)從初始接種數(shù)量下降≥3 lg CFU/mL時，則認為殺菌率達99.9%，藥物在該濃度下對受試菌有殺菌作用[14]。

2.1.4 黃綿馬酸BB與莫匹羅星的聯(lián)合抑菌實驗 根據(jù)“2.1.2”項下的測定結(jié)果，選擇抑菌效果較好的黃綿馬酸BB和莫匹羅星進行聯(lián)合抑菌實驗，采用棋盤微量稀釋法[15]進行檢測。根據(jù)藥物單用時對受試菌的MIC值，將黃綿馬酸BB（A藥）和莫匹羅星（B藥）的最大給藥濃度設定為2MIC，分別在96孔板的橫向和縱向進行一系列二倍稀釋，然后各孔加入等量菌液（菌液濃度為1.0×106CFU/mL），于35 ℃培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)“2.1.2”項下方法測定各藥物聯(lián)合后的MIC。以上操作重復3次。以聯(lián)合抑菌指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）作為聯(lián)合抑菌結(jié)果的判斷依據(jù)：FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FICI≤1為相加作用，1＜FICI≤2為無關(guān)作用，F(xiàn)ICI＞2為拮抗作用[16]。FICI的計算方式如下：FICI＝FICA藥+FICB藥，F(xiàn)ICA藥＝MICA藥聯(lián)合/MICA藥單用，F(xiàn)ICB藥＝MICB藥聯(lián)合/MICB藥單用。

2.2 黃綿馬酸BB乳膏對皮膚膿腫模型小鼠的改善作用考察

2.2.1 黃綿馬酸BB乳膏的制備 參考文獻[17]方法制備黃綿馬酸BB乳膏：稱取凡士林6 g、液體石蠟8 g、十八醇5 g、單硬脂酸甘油酯7 g、脂肪醇聚氧乙烯醚4 g、月桂氮酮1 g、對羥基苯甲酸甲酯0.3 g、對羥基苯甲酸丙酯0.2 g、2，6-二叔丁基對甲酚0.5 g，加熱至80 ℃溶解，攪勻；降溫至65℃時，加入黃綿馬酸BB粉末0.5 g攪拌溶解，作為油相，備用。另外稱取甘油12 g、乙二胺四乙酸二鈉0.02 g，加適量純化水（乳膏總量為100 g），加熱至65℃溶解，作為水相，備用。將油相緩緩倒入水相中，邊加邊攪拌至室溫，即得0.5%黃綿馬酸BB乳膏。同法制備1%、2%黃綿馬酸BB乳膏及不含藥物的基質(zhì)，于4℃保存，備用。

2.2.2 造模、分組及給藥 分別建立以MRSA11或MSSA23感染的小鼠皮膚膿腫模型：將小鼠背部脫毛、消毒后，取60只皮下注射MRSA11（菌液濃度為1.0×109CFU/mL），另外60只皮下注射MSSA23（菌液濃度為5.0×108CFU/mL），注射體積均為0.1 mL。造模次日，觀察小鼠背部皮膚，若出現(xiàn)膿包、紅腫，則表明造模成功。將造模成功的兩種感染小鼠均隨機分為基質(zhì)組、莫匹羅星軟膏組和0.5%、1%、2%黃綿馬酸BB乳膏組，每組12只。每天早晚各涂藥1次，每次涂藥量為0.1 g/只，連續(xù)給藥10 d。

2.2.3 小鼠皮膚膿腫體積的測定 各組小鼠給藥后，每隔1天測量1次皮膚膿腫的長徑（L）與寬徑（W），并計算膿腫體積（V），具體公式為V＝（π/6）·L·W2。

2.2.4 小鼠皮膚膿腫部位細菌含量的檢測 實驗第11天脫臼處死小鼠，取膿腫部位皮膚0.1 g（剩余部分用于病理切片的制備），加入9倍量無菌生理鹽水后，用組織搗碎機研磨制成皮膚勻漿液。將皮膚勻漿液稀釋100倍，取20 μL均勻涂于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于35℃培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察培養(yǎng)基上的菌落數(shù)。

2.2.5 小鼠皮膚膿腫部位的病理形態(tài)學觀察 取各組小鼠膿腫部位皮膚，按常規(guī)方法制備病理切片，以蘇木精伊紅染色，采用光學顯微鏡觀察小鼠的皮膚病理形態(tài)學變化。

2.3 黃綿馬酸BB對MRSA及MSSA的作用機制考察

2.3.1 黃綿馬酸BB對兩種細菌形態(tài)的影響考察 參考文獻[18]方法，將MRSA11、MSSA23菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，調(diào)整菌液濃度為1.0×106CFU/mL，再分別接種于不同的6孔板上（每孔1 mL），然后分為對照組和黃綿馬酸BB低、中、高濃度組（濃度分別為1/2MIC、MIC和2MIC）。除對照組不加藥物外，其余各組均加入1 mL相應藥液，于35℃培養(yǎng)4 h后，以5 000 r/min離心10 min；收集菌體，加入2.5%戊二醛溶液1 mL，置于4℃固定4 h，然后采用掃描電鏡觀察MRSA11和MSSA23的形態(tài)。

2.3.2 黃綿馬酸BB對兩種細菌核酸外滲含量的影響考察 參考文獻[19]方法，將MRSA11、MSSA23菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，調(diào)整菌液濃度為1.0×106CFU/mL，再按“2.3.1”項下方法分組、加藥、培養(yǎng)、離心后，取上清液，采用酶標儀于260 nm處測定吸光度值，吸光度值越大，表明細菌核酸外滲含量越高。

2.3.3 黃綿馬酸BB對兩種細菌胞外蛋白含量的影響考察 參考文獻[20]方法，取0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL的牛血清蛋白標準溶液各200 μL，加入5 mL考馬斯亮藍溶液，室溫放置5 min；采用酶標儀于595 nm波長處測定吸光度值，以牛血清蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。將MRSA11、MSSA23菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，調(diào)整菌液濃度為1.0×106CFU/mL，再按“2.3.1”項下方法分組、加藥、培養(yǎng)、離心后，取上清液200 μL，加入5 mL考馬斯亮藍溶液，室溫放置5 min；采用酶標儀于595 nm波長處測定吸光度值，然后將吸光度值代入標準曲線計算，即得蛋白含量。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 黃綿馬酸BB對受試菌株的體外抗菌作用

3.1.1 受試菌的MIC和MBC 如表1所示，黃綿馬酸BB對10株MRSA的MIC為6.30～80.00 μg/mL，MBC為 40.00～640.00 μg/mL；對 13株 MSSA 的 MIC 為40.00～80.00 μg/mL，MBC為63.50～126.99 μg/mL。莫匹羅星對 10株 MRSA的MIC為0.16～80.00 μg/mL，MBC為0.20～1 280.00 μg/mL，而該藥對葡萄球菌屬的耐 藥 標 準 為 MIC≥8.00 μg/mL[6]，這 表 明 MRSA12、MRSA13、MRSA16對莫匹羅星耐藥。紅霉素對10株MRSA的MIC≥2 560.00 μg/mL，而該藥對葡萄球菌屬的耐藥標準為MIC≥8.00 μg/mL[21]，這表明10株MRSA對紅霉素均高度耐藥。夫西地酸對10株MRSA的MIC均為2 560.00 μg/mL，而該藥對葡萄球菌屬的耐藥標準為MIC≥2.00 μg/mL[7]，這表明10株MRSA對夫西地酸均有耐藥性。另外，MSSA25、MSSA32、MSSA34對紅霉素耐藥，MSSA37對夫西地酸耐藥。頭孢西丁對金黃色葡萄球菌ATCC29213（質(zhì)控菌株）的MIC為1.0 μg/mL，表明本檢測結(jié)果可信。

表1 受試菌株MIC和MBC的測定結(jié)果（n=3，μg/mL）

3.1.2 MRSA11和MSSA23的時間-殺菌曲線 如圖2所示，對照組菌落數(shù)持續(xù)緩慢增長；黃綿馬酸BB中濃度組2種菌的菌落數(shù)均略有波動，整體隨著培養(yǎng)時間的延長呈逐漸下降趨勢，6 h后菌落數(shù)少于莫匹羅星各濃度組，但36 h時仍有細菌生長；黃綿馬酸BB高濃度組MRSA11（培養(yǎng)2 h后）、MSSA23（培養(yǎng)8 h后）的菌落數(shù)一直低于其他各組，36 h時減少的菌落數(shù)＞3 lg CFU/mL，表明其殺菌率達99.9%。莫匹羅星各濃度組2種菌的菌落數(shù)隨時間延長有下降趨勢，但在實驗時間內(nèi)均未達99.9%的殺菌率。

圖2 MRSA11、MSSA23菌株的時間-殺菌曲線

3.1.3 黃綿馬酸BB與莫匹羅星的聯(lián)合抑菌作用 如表2所示，黃綿馬酸BB和莫匹羅星聯(lián)用時，對10株MRSA菌株的作用為相加，對MSSA34和MSSA38菌株的作用為協(xié)同，對其余MSSA菌株的作用為相加。

表2 黃綿馬酸BB與莫匹羅星的聯(lián)合抑菌結(jié)果

3.2 黃綿馬酸BB乳膏對皮膚膿腫模型小鼠的改善作用

3.2.1 小鼠皮膚膿腫體積 如圖3所示，造模1 d后，小鼠背部形成的膿腫體積達到峰值，并隨時間的延長逐漸減小。經(jīng)MRSA11感染后，與基質(zhì)組相比，莫匹羅星軟膏組和1%、2%黃綿馬酸BB乳膏組小鼠在給藥第7、9、11天時的皮膚膿腫體積顯著減?。≒＜0.05），0.5%黃綿馬酸BB乳膏組小鼠在給藥第7、9天時的皮膚膿腫體積顯著減?。≒＜0.05）。經(jīng)MSSA23感染后，與基質(zhì)組比較，各給藥組小鼠在給藥第5、7天時的皮膚膿腫體積顯著減小（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠皮膚膿腫體積的測定結(jié)果（±s，n=12）

3.2.2 小鼠皮膚膿腫部位的細菌含量 如圖4所示，與基質(zhì)組比較，各給藥組小鼠皮膚膿腫部位培養(yǎng)出的菌落數(shù)均顯著減少（P＜0.05）。

圖4 各組小鼠皮膚膿腫部位細菌含量的檢測結(jié)果（±s，n=12）

3.2.3 小鼠皮膚膿腫部位的病理形態(tài)學 基質(zhì)組小鼠表皮層、真皮層以及皮下組織的層次較為模糊，毛囊及皮脂腺周圍炎癥細胞浸潤明顯。莫匹羅星軟膏組小鼠皮膚組織層次模糊，真皮層內(nèi)有少量炎癥細胞浸潤。0.5%黃綿馬酸BB乳膏組小鼠真皮層組織間隙炎癥細胞浸潤明顯；1%、2%黃綿馬酸BB乳膏組小鼠表皮層、真皮層以及皮下組織結(jié)構(gòu)基本完整，層次較清晰，真皮層內(nèi)炎癥細胞浸潤程度較基質(zhì)組明顯減輕。結(jié)果見圖5。

圖5 小鼠皮膚膿腫部位的病理形態(tài)學觀察結(jié)果（×100）

3.3 黃綿馬酸BB對MRSA和MSSA的作用機制

3.3.1 MRSA11和MSSA23的形態(tài) 如圖6所示，未經(jīng)處理的MRSA11和MSSA23菌體完整，細胞表面光滑且形態(tài)飽滿，無破裂。黃綿馬酸BB低濃度組兩種細菌均出現(xiàn)皺縮變形；黃綿馬酸BB中濃度組兩種細菌均嚴重變形，部分菌體破裂，細胞碎片及溶出物增多；黃綿馬酸BB高濃度組兩種細菌的大部分細胞均破裂，碎片呈不規(guī)則片狀或團狀。

圖6 MRSA11和MSSA23菌株的形態(tài)觀察結(jié)果

3.3.2 兩種細菌核酸外滲含量 如圖7所示，與對照組相比，黃綿馬酸BB各濃度組MRSA11、MSSA23菌株核酸外滲含量均顯著升高（P＜0.01）。

圖7 兩種細菌核酸外滲含量的檢測結(jié)果（±s，n=6）

3.3.3 兩種細菌胞外蛋白含量 如圖8所示，與對照組相比，黃綿馬酸BB各濃度組MRSA11、MSSA23菌株胞外蛋白含量均顯著升高（P＜0.01）。

圖8 兩種細菌胞外蛋白含量的測定結(jié)果（±s，n=6）

4 討論

金黃色葡萄球菌引起的皮膚感染持續(xù)時間長，易反復感染，難以痊愈，且隨著大量抗菌藥物的廣泛應用，其耐藥菌株不斷產(chǎn)生，加大了治療難度[22-23]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，香鱗毛蕨的間苯三酚類化合物具有較好的抗菌活性[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃綿馬酸BB對多株MRSA和MSSA均具有良好的體外抑菌和殺菌作用。黃綿馬酸BB對MRSA的MIC范圍較廣，這可能與不同菌株對藥物的敏感性存在差異有關(guān)。時間-殺菌曲線結(jié)果顯示，MIC的黃綿馬酸BB可明顯抑制MRSA11和MSSA23的生長，2MIC的黃綿馬酸BB作用于MRSA11和MSSA23 36 h后可達到99.9%的殺菌率，這提示黃綿馬酸BB的殺菌作用具有濃度依賴性。莫匹羅星是目前臨床上治療SSTI最常用的局部外用抗菌藥物[2]，與黃綿馬酸BB聯(lián)用后，可對部分MSSA菌株產(chǎn)生協(xié)同作用。

目前，中藥抗菌作用的研究主要是進行體外抗菌活性評價，對體內(nèi)的研究較少，而藥物應用于體內(nèi)時會發(fā)生一系列復雜的生理變化，僅憑單純的體外實驗不能夠全面評價藥物的療效[8-9]。因此，本研究以皮下注射金黃色葡萄球菌的方法復制小鼠皮膚膿腫模型，來評價黃綿馬酸BB的體內(nèi)抗菌活性。結(jié)果顯示，0.5%、1%、2%黃綿馬酸BB乳膏均能減小經(jīng)MRSA、MSSA感染后小鼠的皮膚膿腫體積；對小鼠給藥11 d后的皮膚膿腫部位進行細菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，兩種細菌的菌落數(shù)相比于對照組均顯著減少。病理學觀察結(jié)果顯示，1%、2%黃綿馬酸BB乳膏組小鼠皮膚表皮層、真皮層以及皮下組織結(jié)構(gòu)基本完整，層次清晰，真皮層內(nèi)炎癥細胞浸潤程度明顯減輕。以上結(jié)果提示，黃綿馬酸BB可在一定條件下加快皮膚膿腫的恢復進程，抑制膿腫組織內(nèi)細菌的生長。

掃描電鏡的結(jié)果顯示，黃綿馬酸BB可引起MRSA11和MSSA23細胞皺縮、破裂。當細菌細胞膜通透性改變時，細胞內(nèi)DNA、RNA等大分子物質(zhì)會泄漏到胞外，這些成分可于260 nm波長處檢測到吸光度值，是細胞膜損傷的標志[25]。蛋白質(zhì)分子比核酸大，如果蛋白質(zhì)能泄露到細胞外，就能更好地反映細胞膜受損的程度[20]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)黃綿馬酸BB處理后，MRSA11、MSSA23菌株的核酸外滲含量和胞外蛋白含量均顯著升高，且具有濃度依賴性，這表明黃綿馬酸BB可通過破壞MRSA、MSSA菌株細胞膜的通透性，使細菌無法維持正常生命活動從而達到抑菌效果。

綜上所述，黃綿馬酸BB對SSTI的主要致病菌MRSA和MSSA均具有良好的體內(nèi)外抗菌作用，其作用機制可能與改變細胞膜通透性有關(guān)。