洪挺，周志強，肖小武，陳丹丹，楊毅生#（.江西省藥品檢驗檢測研究院/國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室/江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，南昌 33009；.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330004）

桔貝合劑處方來源于重慶市中醫(yī)研究所（原重慶市第一中醫(yī)院），原名為桔貝糖漿，后改為合劑。該方由桔梗、浙貝母、苦杏仁、麥冬、黃芩、枇杷葉、甘草等7味藥組成，方中桔梗、浙貝母共為君藥，苦杏仁、黃芩共為臣藥，甘草調(diào)和藥性為佐藥，麥冬、枇杷葉共為使藥，諸藥合而為方，共奏潤肺止咳之功效，常用于治療肺熱咳嗽、痰稠色黃、咳痰不爽等癥。

桔貝合劑現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二冊（WS3-B-0369-90），但該標(biāo)準(zhǔn)只收載了性狀和檢查項[1]，無法有效控制該制劑質(zhì)量。已發(fā)表的關(guān)于桔貝合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究較少，僅有浙貝母和枇杷葉的薄層色譜（TLC）鑒別、貝母素甲與貝母素乙的含量測定，以及甘草苷等5種成分的含量測定[2-5]，且所得浙貝母與枇杷葉的TLC斑點均較弱，提取方式及展開劑均需優(yōu)化?；诖?，本研究采用化學(xué)鑒別法鑒別苦杏仁水，采用TLC法對方中桔梗、浙貝母、黃芩、枇杷葉、甘草進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定方中苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、甘草酸銨的含量[6-8]，旨在更客觀、全面地反映桔貝合劑的內(nèi)在質(zhì)量，為其臨床用藥的安全性和有效性提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有1260 InfinityⅡ型HPLC儀（美國Agilent公司）、BSA124S-CW型電子天平（德國Sartorius公司）、TE212-L型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、Milli-Q Direct 16型超純水儀（美國Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

15批桔貝合劑分別購自A公司（批號190203、190207、190208、190209、190301，規(guī)格 10 mL）、B 公司（ 批 號 23190071、23190251、23190441、23210231、23210241，規(guī)格 10 mL）、C 公司（批號 18090051、19040013、19040024、19090030、20010001，規(guī) 格 100 mL）。桔梗對照藥材（批號121028-201612）、浙貝母對照藥材（批號120972-200404）、黃芩對照藥材（批號120955-201810）、枇杷葉對照藥材（批號121261-201804）、甘草對照藥材（批號121303-201704）、苦杏仁苷對照品（批號110820-201607，純度90.7%）、黃芩苷對照品（批號110715-201821，純度95.3%）、漢黃芩苷對照品（批號112002-201702，純度98.8%）、甘草酸銨對照品（批號110731-201619，純度93.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院。桔梗、浙貝母、苦杏仁、麥冬、黃芩、枇杷葉、甘草藥材均為市售品，均經(jīng)江西省藥品檢驗檢測研究院楊毅生主任中藥師鑒定為真品。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦杏仁水的化學(xué)反應(yīng)

取3批桔貝合劑（批號分別為190301、23210241、19090030）各10 mL，分別置于試管中，再在試管中懸掛一條三硝基苯酚試紙（使用前用10%碳酸鈉溶液濕潤），密塞，置80℃熱水浴10 min。再取缺苦杏仁水的其他藥材，按桔貝合劑的處方工藝制成陰性樣品，再按上述方法操作。結(jié)果顯示，3批樣品中的三硝基苯酚試紙均呈現(xiàn)磚紅色，陰性樣品中的試紙未變色，詳見圖1。

圖1 苦杏仁水的化學(xué)反應(yīng)結(jié)果

2.2 TLC鑒別

2.2.1 桔梗的TLC鑒別 取桔貝合劑10 mL，用水飽和的正丁醇溶液振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，置水浴上蒸干，殘渣加甲醇l mL使溶解，作為供試品溶液。取桔梗對照藥材0.5 g，置錐形瓶中，加甲醇10 mL，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為對照藥材溶液。取缺桔梗的其他藥材按桔貝合劑處方工藝制備陰性樣品，再按本項下供試品溶液制備方法制成桔梗陰性對照溶液。參照2020年版《中國藥典》（四部）通則0502“薄層色譜法”[9]試驗，吸取上述3種溶液2～5 μL，分別點于同一自制硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（16∶8∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾，詳見圖2。

圖2 桔梗的TLC鑒別圖

2.2.2 浙貝母的TLC鑒別 取桔貝合劑20 mL，加濃氨試液5 mL，搖勻，用三氯甲烷振搖提取3次，每次25 mL，合并三氯甲烷層，蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。取浙貝母對照藥材1 g，加濃氨試液5 mL和三氯甲烷25 mL，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。取缺浙貝母的其他藥材按桔貝合劑處方工藝制備陰性樣品，再按本項下供試品溶液制備方法制成浙貝母陰性對照溶液。參照2020年版《中國藥典》（四部）通則0502“薄層色譜法”[9]試驗，吸取上述3種溶液10～20 μL，分別點于同一自制硅膠G薄層板上，用乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（17∶2∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，在日光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾，詳見圖3。

圖3 浙貝母的TLC鑒別圖

2.2.3 黃芩的TLC鑒別 取“2.2.1”項下的供試品溶液，作為黃芩TLC鑒別的供試品溶液。取黃芩對照藥材0.5 g，加水50 mL，煎煮1.5 h，離心，取上清液濃縮至10 mL，即得對照藥材溶液。取缺黃芩的其他藥材按桔貝合劑處方工藝制備陰性樣品，再按本項下供試品溶液制備方法制成黃芩陰性對照溶液。參照2020年版《中國藥典》（四部）通則0502“薄層色譜法”[9]試驗，吸取上述3種溶液2～5 μL，分別點于同一聚酰胺薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶7∶3∶2，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鐵試液，在日光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾，詳見圖4。

圖4 黃芩的TLC鑒別圖

2.2.4 枇杷葉的TLC鑒別 取桔貝合劑20 mL，用乙醚振搖提取2次，每次20 mL，棄去乙醚液，水層用水飽和的正丁醇溶液振搖萃取2次，每次20 mL，合并正丁醇層，再用正丁醇飽和的氨試液洗滌2次，每次20 mL，再將正丁醇層蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取枇杷葉對照藥材1 g，加水50 mL，煎煮1 h，濾過，濾液濃縮至20 mL，同法制成對照藥材溶液。取缺枇杷葉的其他藥材按桔貝合劑處方工藝制備陰性樣品，再按本項下供試品溶液制備方法制成枇杷葉陰性對照溶液。參照2020年版《中國藥典》（四部）通則0502“薄層色譜法”[9]試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一自制硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）在10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃下加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾，詳見圖5。

圖5 枇杷葉的TLC鑒別圖

2.2.5 甘草的TLC鑒別 取桔貝合劑10 mL，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，乙酸乙酯層蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取甘草對照藥材1 g，加水50 mL，煎煮1 h，濾過，濾液濃縮至約10 mL，同法制成對照藥材溶液。取缺甘草的其他藥材按桔貝合劑處方工藝制備陰性樣品，再按本項下供試品溶液制成甘草陰性對照溶液。參照2020年版《中國藥典》（四部）通則0502“薄層色譜法”[9]試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一自制硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15∶1∶1∶1.5，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾，詳見圖6A。再置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾，詳見圖6B。

圖6 甘草的TLC鑒別圖

2.3 苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨的含量測定

2.3.1 色譜條件色譜柱為Agient 5TC-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；以甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～90 min，25%A→77%A；90～95 min，77%A）；檢測波長按時間切換（0～20 min，210 nm；20～95 min，252 nm）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.3.2 溶液的制備 （1）混合對照品溶液：分別精密稱取苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨對照品適量，加甲醇制成每1 mL含上述成分分別為60、200、60、40 μg的混合對照品溶液。（2）供試品溶液：精密量取桔貝合劑2 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。（3）陰性對照溶液：分別取缺苦杏仁、黃芩、甘草的其他藥材，按桔貝合劑處方工藝分別制備缺苦杏仁、黃芩、甘草的陰性樣品，再按本項下供試品溶液的制備方法制成缺苦杏仁、黃芩、甘草的陰性對照溶液。

2.3.3 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取“2.3.2”項下的3種溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，色譜峰基線平穩(wěn)，苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨色譜峰與其余成分峰相互無干擾，相鄰色譜峰之間的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按黃芩苷峰計算不低于4 000。結(jié)果見圖7。

圖7 桔貝合劑含量測定的HPLC圖

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密稱取苦杏仁苷、漢黃芩苷、甘草酸銨對照品12.27、10.64、11.23 mg，分別置于50 mL量瓶中；精密稱取黃芩苷對照品9.95 mg，置10 mL量瓶中；分別用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得4種對照品母液。分別精密量取上述苦杏仁苷、漢黃芩苷對照品母液各3 mL，黃芩苷、甘草酸銨對照品母液各2 mL，置同一100、50、25、10、5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得不同濃度的系列混合對照品溶液。精密吸取上述系列混合對照品溶液各10 μL注入HPLC儀，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以對照品進樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進行線性關(guān)系考察，結(jié)果見表1。

表1 苦杏仁苷等4種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果（n=5）

2.3.5 精密度試驗 精密吸取“2.3.2（1）”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為0.4%、1.2%、0.9%、1.5%（n＝6），表明儀器精密度較好。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取桔貝合劑（批號19090030）6份，分別按“2.3.2（2）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，以外標(biāo)法計算樣品含量。結(jié)果顯示，樣品中苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨的平均含量分別為2.86、5.42、0.99、0.38 mg/mL，RSD分別為1.1%、0.3%、0.4%、0.4%（n＝6），表明方法重復(fù)性較好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批桔貝合劑（批號19090030）制成的供試品溶液，分別在制備后1、3、5、7、10、17、24 h按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.4%、0.8%、0.7%、0.9%（n＝7），表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.3.8 準(zhǔn)確度試驗 精密量取桔貝合劑（批號19090030，苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨的含量分別為2.86、5.42、0.99、0.38 mg/mL）1 mL，共6份，分別置50 mL量瓶中，精密加入混合對照品溶液（苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨質(zhì)量濃度分別為0.25、0.55、0.10、0.04 mg/mL）10 mL，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取10μL，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨的平均加樣回收率分別為98.2%、99.5%、98.3%、99.6%，RSD分別為0.7%、1.6%、1.5%、1.1%（n＝6），表明方法準(zhǔn)確度較好。

2.3.9 耐用性試驗 取桔貝合劑（批號19090030）適量，按“2.3.2（2）”項下方法制備供試品溶液，分別使用Phenomenex C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent 5TCC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Supfex JX-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，3種色譜柱條件下所得苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨峰面積的RSD均不大于1.0%，表明方法耐用性較好。

2.3.10 樣品含量測定 精密量取15批桔貝合劑各2 mL，置50 mL量瓶中，按“2.3.2（2）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，按外標(biāo)法計算樣品中苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨的含量，平行測定2次，結(jié)果見表2。

表2 桔貝合劑中苦杏仁苷等4種待測成分的含量測定結(jié)果（n=2，mg/mL）

3 討論

3.1 苦杏仁水的化學(xué)反應(yīng)

苦杏仁作為方中臣藥，具有降氣、止咳、平喘的作用。桔貝合劑的部頒標(biāo)準(zhǔn)【制法】項下要求“苦杏仁壓去脂肪油后，加水蒸餾制取苦杏仁水”。經(jīng)查閱文獻，苦杏仁經(jīng)水蒸餾后主要提取出來的成分是杏仁腈，而杏仁腈為苦杏仁苷酶解掉2分子糖后的產(chǎn)物，因其不穩(wěn)定，會水解生成苯甲醛與氫氰酸，故最終苦杏仁水的蒸餾產(chǎn)物只有苯甲醛與氫氰酸[10]。本課題組在前期試驗中也驗證了該結(jié)論。已知氫氰酸在碳酸鈉作用下與三硝基苯酚反應(yīng)會生成磚紅色的異氰紫酸鈉[11]，故通過該化學(xué)反應(yīng)可以證明樣品中含有苦杏仁水。若有企業(yè)未按照部頒標(biāo)準(zhǔn)的【制法】要求，將苦杏仁不提取杏仁水而直接與其他藥材進行煎煮，這樣所得的樣品則不含氫氰酸，使三硝基苯酚試紙不顯色。同樣，因氫氰酸具有揮發(fā)性，桔貝合劑的儲存應(yīng)注意包材的密封性，否則很容易造成三硝基苯酚試紙不顯色。本研究通過對3家生產(chǎn)企業(yè)15批樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)A公司近生產(chǎn)日期樣品顯色明顯，但1年后該樣品即不能顯色，而B、C公司不同批號的樣品均能顯色，提示藥企應(yīng)重視樣品包材的密封性。

3.2 TLC鑒別

桔貝合劑處方藥味較多，化學(xué)成分豐富，若只用單個對照品作為對照，則無法顯示處方中所有藥材的整體信息，故本研究選擇各對照藥材對處方中桔梗、浙貝母、黃芩、枇杷葉、甘草進行質(zhì)量控制，結(jié)果顯示供試品與對照藥材具有相同的色譜行為，陰性對照均無干擾。本課題組對處方中的麥冬、苦杏仁也進行了TLC鑒別研究，但陰性對照一直有干擾，其鑒別方法尚需進一步摸索。

3.3 含量測定

桔貝合劑的君藥桔梗與浙貝母所含主要成分分別為桔梗皂苷與貝母素類生物堿，因其無紫外吸收，須使用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD），本課題組也建立了其含量測定方法，但因該方法已有文獻報道[4，12]，故本文不再贅述。苦杏仁苷為臣藥苦杏仁的主要功效成分[13]，黃芩苷與漢黃芩苷均為臣藥黃芩的主要功效成分[14]；甘草的主要功效成分為甘草酸銨與甘草苷[15]，但研究發(fā)現(xiàn)桔貝合劑中甘草酸銨含量較高、甘草苷含量較低，故本研究建立了同時測定桔貝合劑中苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨含量的HPLC法。另外，本課題組也設(shè)計了采用ELSD同時測定桔梗皂苷D、貝母素甲、貝母素乙、苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、甘草酸銨的方法，但因樣品中黃芩苷含量較其他成分高出太多，致使ELSD色譜圖中黃芩苷色譜峰過大，其余色譜峰過小，故不適合同時測定這7種成分。因此，本課題組采用二極管陣列檢測器（DAD），并在不同時間點切換檢測波長，以避開黃芩苷類成分在272 nm波長處的最大吸收，而采用其波谷252 nm作為檢測波長；通過DAD掃描確定苦杏仁苷的最大吸收波長為210 nm、甘草酸銨的最大吸收波長為252 nm，最終確定本研究的檢測條件為：0～20 min時，檢測波長為210 nm；20～95 min時，檢測波長為252 nm。本研究還對柱溫（25、30、40℃）進行了考察，發(fā)現(xiàn)在固定色譜柱、pH及流動相等其他條件不變的情況下，30℃的柱溫可使色譜峰的分離度更好、保留時間更為合適，且能改善拖尾現(xiàn)象。

在供試品溶液的制備中，本課題組分別考察了不同提取方法（稀釋振搖與超聲處理）、不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇、70%甲醇）的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲醇作為溶劑，采用稀釋振搖的方法，樣品提取較為完全，且該方法更簡單。針對流動相，本課題組分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液梯度洗脫的效果，發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨通過甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脫后的峰形最佳、分離度最好。本含量測定結(jié)果顯示，A公司所生產(chǎn)樣品中的苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷、甘草酸銨含量普遍較B、C公司樣品低很多，特別是苦杏仁苷未檢出，可見各公司因生產(chǎn)工藝參數(shù)控制差異較大或使用藥材質(zhì)量差異較大，導(dǎo)致現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)可控性差。

4 結(jié)語

本研究所建立的苦杏仁水化學(xué)反應(yīng)方法準(zhǔn)確可靠，可證明企業(yè)是否按部頒標(biāo)準(zhǔn)工藝提取苦杏仁水；建立的桔梗、浙貝母、黃芩、枇杷葉、甘草的TLC鑒別法專屬性強，對處方君臣佐使藥味均進行了定性控制；建立的同時測定苦杏仁苷、黃芩苷、漢黃芩苷和甘草酸銨含量的HPLC法操作簡便、耐用性好，對苦杏仁、黃芩、甘草3味藥材進行了定量控制。本研究方法對桔貝合劑基本實現(xiàn)了全方控制，所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可以較好地反映該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，可為其臨床用藥的安全性和有效性提供保障。