劉培君 康秀峰雷曉亭洪志斌（天水市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科，天水 741000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由多種原因引起的心肌損傷，導致患者充盈功能低下，發(fā)病早期癥狀不明顯，臨床多表現(xiàn)為乏力、呼吸困難及體液潴留等。近年來，CHF的發(fā)生率呈上升趨勢，且五年存活率與惡性腫瘤相近，影響患者健康生活［1-2］。既往研究表明，CHF的發(fā)生、發(fā)展常伴有心肌細胞凋亡，呋塞米屬于臨床常用藥物，雖然能延緩病情發(fā)展，但遠期預后較差，不良反應發(fā)生率較高，導致臨床使用受限［3］。重組人腦利鈉肽屬于人體分泌的一種內(nèi)源性多肽，重組DNA技術(shù)利用大腸桿菌凍干制劑能與心室肌產(chǎn)生的內(nèi)源性腦利鈉肽具有相同的氨基酸序列［4-5］。同時，藥物能拮抗心肌細胞、心纖維原細胞、血管平滑肌細胞內(nèi)皮素，有助于提高腎小球濾過率，促進鈉的排泄［6］。因此，本研究以SD大鼠為研究對象，探討重組人腦利鈉肽在慢性心衰大鼠中的作用機制及對黏著斑激酶（FAK）、Bcl-2相關(guān)C蛋白（Bax）、心肌組織凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）及抑癌基因p53（p53）的影響報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物健康清潔級SD大鼠40只，雌雄隨機，體質(zhì)量220～280 g，平均（250.00±20.00）g，隨機取10只設(shè)為空白對照組；剩余30只復制大鼠CHF動物模型，建模成功后隨機分為模型對照組、呋塞米組和重組人腦利鈉肽組，10只/組。動物合格證號：SCXX-2005-0001，所選動物均購于實驗動物房，完成大鼠的常規(guī)喂養(yǎng)、光照。

1.1.2 主要試劑與儀器注射用苯巴比妥鈉（上海新亞藥業(yè)有限公司）；鹽酸多柔比星，規(guī)格：10 mg/支（山西普德藥業(yè)股份有限公司）；ELISA試劑盒（美國R&D Systems公司）；BCA蛋白定量試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；凍干重組人腦利鈉肽，規(guī)格：0.5 mg×1瓶/盒（成都諾迪康生物制藥有限公司）；內(nèi)參抗體β-actin（美國Sigma公司）；大鼠飼養(yǎng)籠（西安交通大學動物實驗中心）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；小動物超聲儀，型號Vevo770型（Visuslsonics公司）；臺式高速低溫離心機（德國Herolab公司）。

1.2 方法

1.2.1 建模與分組

1.2.1.1 建模剩余30只大鼠采用鹽酸多柔比星隔日腹腔注射法復制大鼠CHF動物模型，具體方法如下：給藥劑量依次為第1、3天劑量為1 mg/kg、第5、7天劑量為2 mg/kg、第9、11天劑量為3 mg/kg、第13、15天劑量為4 mg/kg，連續(xù)完成8次給藥，累計劑量為20 mg/kg。上述操作完畢后對大鼠連續(xù)完成3周喂養(yǎng)，并完成其生命體征監(jiān)測。左心室質(zhì)量/體質(zhì)量為左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI），右心室質(zhì)量/體質(zhì)量為右心室質(zhì)量指數(shù)（RVMI），左心室肌HE染色，并配合大鼠的行為、體征判斷造模標準［7-8］。

1.2.1.2 分組建模成功后隨機分為模型對照組、呋塞米組和重組人腦利鈉肽組，10只/組。處理方法：空白對照組與模型對照組給予等劑量生理鹽水；呋塞米組采用呋塞米溶液［10 mg/（kg·d）］灌胃干預，重組人腦利鈉肽組采用重組人腦利鈉肽溶液［15μg/（kg·d）］皮下注射4周。

1.2.2 觀察指標

1.2.2.1 心功能水平采用超聲心動圖檢測大鼠心功能水平，包括左室舒張期內(nèi)徑（LVIDd）、左室收縮期內(nèi)徑（LVIDs）、射血分數(shù)（EF）及短軸縮短分數(shù)（FS）水平的測定［9］。

1.2.2.2 免疫水平4組大鼠干預后4周以斷頸方式處死，取頸動脈血3 ml，流式細胞儀完成CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的水平測定［10-11］。

1.2.2.3 FAK、Bax、Bcl-2及p53水平4組大鼠處理4周后以斷頸方式處死，取心肌組織100 mg，向組織中加入1 ml裂解液完成組織裂解，12 000 r/min離心15 min。取上清，根據(jù)BCA法完成相關(guān)蛋白濃度測定；沸水浴變性，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂牛奶封閉，分別加入FAK、Bax、Bcl-2及p53蛋白一抗，孵育過夜后加入二抗，并以化學發(fā)光法顯色，膠片曝光后顯影［12-13］。

1.3 統(tǒng)計學分析采用SPSS18.0軟件處理，計量資料行t檢驗，采用±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心功能比較重組人腦利鈉肽組和呋塞米組心功能LVIDd、LVIDs水平低于模型對照組（P＜0.05）；EF及FS水平高于模型對照組（P＜0.05）；重組人腦利鈉肽組干預4周后LVIDd、LVIDs水平低于呋塞米組（P＜0.05）；EF及FS水平高于呋塞米組（P＜0.05），見表1。

表1 4組心功能比較（±s）Tab.1 Comparison of cardiac function among four groups（±s）

表1 4組心功能比較（±s）Tab.1 Comparison of cardiac function among four groups（±s）

Note：Compared with blank control group，1）P＜0.05；compared with model control group，2）P＜0.05；compared with furosemide group，3）P＜0.05.

Groups Recombinant human brain natriuretic peptide Furosemide Model control Blank control n 10 10 10 10 LVIDd/mm 9.59±1.781）2）3）10.73±2.111）2）11.21±2.151）8.48±0.62 LVIDs/mm 6.84±1.591）2）3）8.43±2.061）2）10.26±2.611）5.31±0.84 EF（%）54.39±4.741）2）3）43.34±3.791）2）22.49±2.131）64.59±5.62 FS（%）30.32±3.891）2）3）21.59±3.381）2）10.49±2.421）35.63±4.30

2.2 各組免疫水平比較重組人腦利鈉肽組和呋塞米組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平高于模型對照組（P＜0.05）；CD8+水平低于模型對照組（P＜0.05）；重組人腦利鈉肽組干預4周后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平高于呋塞米組（P＜0.05）；CD8+水平低于呋塞米組（P＜0.05），見表2。

表2 4組免疫水平比較（±s，%）Tab.2 Comparison of immune levels among four groups（±s，%）

表2 4組免疫水平比較（±s，%）Tab.2 Comparison of immune levels among four groups（±s，%）

Note：Compared with blank control group，1）P＜0.05；compared with model control group，2）P＜0.05；compared with furosemide group，3）P＜0.05.

Groups Recombinant human brain natriuretic peptide Furosemide Model control Blank control n 10 10 10 10 CD3+58.43±4.311）2）3）49.68±3.691）2）45.71±2.491）63.29±4.59 CD4+42.14±3.111）2）3）37.39±3.171）2）34.21±2.491）46.49±3.23 CD8+29.53±4.521）2）3）32.23±4.391）2）35.45±5.791）27.29±3.23 CD4+/CD8+1.43±0.231）2）3）1.16±0.161）2）0.97±0.111）1.70±0.27

圖2 各組FAK、Bax、Bcl-2及p53蛋白表達量Fig.2 Expressions of FAK，Bax，Bcl-2 and p53 protein in each groups

2.3 各組FAK、Bax、Bcl-2及p53水平比較BCA法測定結(jié)果表明，重組人腦利鈉肽組和呋塞米組FAK、Bax、p53水平低于模型組（P＜0.05）；Bcl-2水平高于模型組（P＜0.05）；重組人腦利鈉肽組FAK、Bax、p53水平低于呋塞米組（P＜0.05）；Bcl-2水平高于呋塞米組（P＜0.05），見圖1、2。

圖1 4組FAK、Bax、Bcl-2及p53相對表達量比較Fig.1 Comparison of relative expressions of FAK，Bax，Bcl-2 and p53 in four groups

3 討論

目前，臨床上對于CHF的發(fā)病機制尚未闡明，而心肌細胞凋亡在疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［14］。既往研究表明，心肌細胞凋亡是引起心功能不全的重要原因，在整個疾病中發(fā)揮重要作用，且心力衰竭越嚴重，心肌細胞凋亡數(shù)越多［15］。利鈉肽屬于心力衰竭患者體內(nèi)最為重要的神經(jīng)內(nèi)分泌激素之一，而重組人腦利鈉肽的使用可作為人體應激大量產(chǎn)生的補充代償機制［16］。本研究中，重組人腦利鈉肽組干預后4周LVIDd、LVIDs水平低于呋塞米組；EF及FS水平高于呋塞米組，提示重組人腦利鈉肽的干預可改善大鼠心功能水平，利于大鼠恢復。重組人腦利鈉肽可通過降低動脈與靜脈壓力，增加心輸出量，抑制神經(jīng)激素激活水平，從而影響機體血流動力學。由于重組人腦利鈉肽對于機體的作用決定了其激動劑在臨床上的應用及發(fā)作，其廣泛應用于心力衰竭的治療［13］?，F(xiàn)代藥理結(jié)果表明，重組人腦利鈉肽是利用DNA技術(shù)合成的生物制劑，并以大腸桿菌為生成菌種，具有較高的純度，且與內(nèi)源性BNP具有相同的生物活性［17］。同時，重組人腦利鈉肽亦可發(fā)揮中度利尿作用，能增加腎小球系膜細胞含量，擴張腎臟入球的小動脈，有助于提高腎臟腎小球濾過率，改善機體免疫水平。本研究中，重組人腦利鈉肽組干預4周后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平高于呋塞米組；CD8+水平低于呋塞米組，提示重組人腦利鈉肽可改善CHF大鼠免疫水平，提高機體的抗病能力，減輕腎臟組織損傷，利于大鼠恢復。

現(xiàn)代藥理結(jié)果表明，F(xiàn)AK是胞內(nèi)外信號出入的中樞，可介導多條信號通路，整合源于整合素、生長因子及機械刺激的信號，參與細胞的生長、調(diào)節(jié)，在CHF的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用；Bcl-2是癌基因的一種，具有抑制細胞凋亡作用，能抑制由多種細胞毒因素引起的細胞凋亡。既往研究表明，Bcl-2能增強細胞對多數(shù)DNA損傷因子發(fā)揮良好的抵抗性，但難以促進DNA修復［18］。而p53蛋白屬于DNA損傷的分子傳感器，Bcl-2能抑制p53介導的凋亡，參與CHF的發(fā)生。Bax屬于兔抗人單克隆抗體，過度表達的Bax會對Bcl-2產(chǎn)生影響，加速細胞凋亡［19］。本研究中，重組人腦利鈉肽組FAK、Bax、p53水平低于呋塞米組；Bcl-2水平高于呋塞米組，提示重組人腦利鈉肽可改善FAK、Bax、p53、Bcl-2水平，為CHF的治療提供新的思路和方法。既往研究表明，CHF的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素過程，常伴有免疫水平異常，能引起T淋巴細胞水平異常。通過比較CHF與非CHF患者FAK、Bax、p53、Bcl-2水平發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞與FAK、Bax、p53、Bcl-2表達水平存在緊密聯(lián)系，加強FAK、Bax、p53、Bcl-2水平測定可反映、評估機體免疫狀態(tài)，指導臨床治療。

綜上所述，重組人腦利鈉肽用于CHF大鼠中有助于提高其心功能水平，改善機體免疫水平，降低FAK、Bax、p53水平，提高Bcl-2水平，可為慢性心衰治療提供參考依據(jù)。