鄭向偉 郭俊浩

（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，山東濟寧 272500）

0.引言

通常情況下在進行抗生素生產(chǎn)時采用了微生物的純種培養(yǎng)方式，在培養(yǎng)期間只允許特定的微生物進行生長和發(fā)育。如果發(fā)酵期間除抗生素以外產(chǎn)生了其他的菌種或出現(xiàn)了其他的微生物，就會發(fā)生染菌反應，會對抗生素的生長質量和整體的產(chǎn)量產(chǎn)生不良影響。在進行抗生素發(fā)酵生產(chǎn)時，因為操作環(huán)節(jié)比較復雜，及其容易出現(xiàn)染菌的情況[1]。要想對生產(chǎn)環(huán)節(jié)進行有效的控制就要對導致染菌問題發(fā)生的原因進行全面的查找，并且制訂針對性的防控措施，才能進一步提高生產(chǎn)的水平。

1.抗生素發(fā)酵工藝的控制技術

1.1 做好日常的檢查

（1）平板劃線及顯微鏡檢查。目前在對相關問題進行檢查時存在多種技術方法，只有及時發(fā)現(xiàn)污染源才能避免因為這項事故的不斷蔓延，導致?lián)p失問題變得更加嚴重。因此在對污染問題進行判斷和檢查的過程中，需要選擇合適的技術和方法才能縮短這項工作的開展時間。比較常用的方法主要存在平板劃線培養(yǎng)以及顯微鏡檢查技術、肉湯培養(yǎng)檢查技術。其中的平板劃線培養(yǎng)技術在應用時是將已經(jīng)經(jīng)過滅菌處理的固體培養(yǎng)基，導入到滅菌的平板中，再放置培養(yǎng)箱中，保持37℃的試驗溫度。在對其保溫24h之后，如果檢查不存在細菌等問題，就可以正常使用。在對樣品進行檢查期間，首先要在無菌的平板上進行劃線操作，并且將其分別設置在27℃和37℃的環(huán)境中進行培養(yǎng)，確保樣品能夠適用低溫菌和嗜中菌的生長環(huán)境。一般需要對樣品進行8h的觀察，但這種檢測方式的準確度比較低。生產(chǎn)人員要保證培養(yǎng)基的pH數(shù)值在7.0左右，還需要在其中設置1.0%的牛肉膏和0.5%的葡萄糖以及1.0%的瓊脂、0.5%的氯化鈉、1.0%的蛋白胨。如果采用顯微鏡的檢查方法進行相關的操作，通常要對其進行革蘭氏的染色，染色之后需要在高倍的顯微鏡下進行有效的觀察，并且根據(jù)生產(chǎn)菌和雜菌的主要特征，對其進行有效的分別，并且判斷是否出現(xiàn)污染的現(xiàn)象[2]。

（2）肉湯培養(yǎng)檢查。在進行肉湯培養(yǎng)檢查技術應用時，要將需要檢查的樣品倒入培養(yǎng)基中，并且對其進行檢查，要保證肉湯培養(yǎng)基中不存在菌體，還要控制到27℃和37℃的溫度下，分別進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24h之后對其進行有效的觀察，并且開展取樣操作。這種方法經(jīng)常作用于培養(yǎng)基和無菌空氣是否存在菌體反應的檢查過程中，并且將生產(chǎn)菌作為主要的指示菌進行相關的操作。在進行操作的過程中，主要存在葡萄糖酚紅肉湯培養(yǎng)基，要將pH值控制在7.2左右，還要設置0.5%的葡萄糖和0.3%的牛肉膏以及0.8%的蛋白棟、0.4%的酚紅溶液、0.5%的葡萄糖。在進行實際檢測時，如果采用以上方法都未發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中存在污染源，也不能判定未被污染。除上述技術方法之外，還可以從發(fā)酵期間是否存在異?，F(xiàn)象，對污染問題的發(fā)生進行準確的判斷，例如溶解氧出現(xiàn)了劇烈的變化，pH數(shù)值的波動速度比較快，排氣中的二氧化碳含量比較高或者菌體酶的活力比較旺盛。大多數(shù)情況下在發(fā)酵培養(yǎng)基因中使用玉米漿或者酵母粉進行相關的配置，這些物料中的菌體含量比較大，在顯微鏡設備下難以進行有效的觀察和判斷。在具體實施時要遵循相應的原則，如果培養(yǎng)基出現(xiàn)了污染現(xiàn)象，則菌體會呈現(xiàn)上升的趨勢，但如果菌體的數(shù)量增加數(shù)量比較少，與培養(yǎng)基中所含菌的形態(tài)保持一致，則可以判斷未存在污染的事件[3]。

1.2 準確判斷導致這項問題發(fā)生的原因

在對污染時間和程度進行判定時，必須保證判斷結果的精確性。無論是接種之前還是接種之后出現(xiàn)了污染，無論是補料之前還是補料之后出現(xiàn)的污染都要對污染源的品種和具體的發(fā)生時間進行準確的判斷，還要查找是哪批料出現(xiàn)了問題，要明確具體的菌型，才能對其進行有效的防控。一般情況下在進行取樣操作時，要在實驗的環(huán)境下進行處理，避免出現(xiàn)誤差的問題。生產(chǎn)人員可以適當?shù)卦黾尤拥臄?shù)量和頻率，特別是在進行批量判斷時，如果內(nèi)部的情況比較復雜，要增加取樣的頻率，為判斷工作的開展提供有效的依據(jù)。要想明確這項問題的具體發(fā)生原因，生產(chǎn)人員還要對污染問題的發(fā)生原因進行全面的總結，要從根源上對這項問題進行扼殺。這項問題的發(fā)生，會受到多種因素的影響，但主要的原因是因為操作設備出現(xiàn)了泄漏或者在進行滅菌操作時存在失誤以及現(xiàn)有的技術更新速度比較慢、無菌空氣環(huán)境中存在有效的菌種[4]。一般情況下在發(fā)生污染問題之后需要利用顯微鏡設備，對培養(yǎng)基無菌斜面和肉湯進行全面的觀察，并且對導致相關問題發(fā)生的原因進行有效的判斷，并根據(jù)原因制定相應的解決措施，杜絕污染問題的發(fā)生。

也可以根據(jù)污染的時間對問題進行有效的判斷，早期可能是因為種子存在細菌，在對設備和培養(yǎng)基進行滅菌操作時，沒有對其進行徹底的處理或者接種出現(xiàn)了失誤，無菌空氣中出現(xiàn)了菌體，導致發(fā)酵后期出現(xiàn)了污染問題。中間補料存在污染和設備的泄漏以及生產(chǎn)人員的操作失誤也會引發(fā)相應的問題。種子帶菌是因為在進行了種子制作時，無菌樣品和使用之后的剩余樣品存在菌體。在對樣品進行監(jiān)測時，沒有對所有的樣品進行有效的處理，一些帶菌體的種子帶入操作環(huán)節(jié)會產(chǎn)生球菌，球菌會因為搖瓶培養(yǎng)基未進行滅菌處理而出現(xiàn)污染問題。下在對原料進行更換時，一次只夠換一種類型的原料，其中就會引發(fā)大規(guī)模的污染現(xiàn)象。如果一直沿用傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝，無法對其全面的消除，使用搖瓶比較大的樣品進行有效的處理，在未完全驗證的情況下，需要引進更加先進的工藝進行滅菌處理。但如果搖瓶裝量比較大，升溫速度慢，就會導致培養(yǎng)基內(nèi)部出現(xiàn)污染問題。在對種子的無菌樣品進行監(jiān)測時，如果發(fā)現(xiàn)樣品都處于正常的狀態(tài)，需要對其他生產(chǎn)環(huán)節(jié)進行監(jiān)測。一級種子罐中的污染問題，是因為未對其進行完全的檢驗就帶入到發(fā)酵罐中，一般15h的時間內(nèi)發(fā)酵罐就會出現(xiàn)污染問題。種子罐的無菌斜面可以通過鏡檢，對是否存在污染問題進行分析和判斷。在對培養(yǎng)基和設備進行

滅菌操作時，如果未嚴格按照生產(chǎn)工藝的要求，對其進行有效的處理，就可能引發(fā)芽孢等現(xiàn)象[5]。因為無菌樣品在使用的過程中極易出現(xiàn)污染問題，在進行設備應用時，冷卻設備出現(xiàn)了泄漏的問題，蛇形管和連消的裝置、噴淋冷卻器存在穿孔現(xiàn)象或者夾層存在老化或者故障問題，也會引發(fā)污染現(xiàn)象，而污染現(xiàn)象的發(fā)生程度，與泄露的情況存在一定的聯(lián)系。

2.染菌問題的發(fā)生原因

2.1 一級種子管接種存在缺陷

在進行火焰接種時，會導致一級種子罐內(nèi)部出現(xiàn)污染問題。在進行接種處理時，生產(chǎn)人員沒有嚴格按照相應的要求進行環(huán)境的消毒，生產(chǎn)人員和消毒人員也沒有進行密切的配合，保證各項操作的迅速完成，就會出現(xiàn)接種失敗的問題[6]。

2.2 蒸汽質量比較差

這項操作在實施的過程中會受到各種因素的影響，因為蒸汽質量的波動幅度比較大，內(nèi)部可能會存在冷凝水問題，且總蒸汽壓力比較低。一旦壓力出現(xiàn)了驟然上升或者下降的問題都會對環(huán)境溫度產(chǎn)生一定的影響，引發(fā)濕飽和蒸汽。在這種情況下無法對其進行有效的處理，會引發(fā)比較嚴重的污染問題[7]。

2.3 空氣系統(tǒng)存在缺陷

過濾器設備在應用的過程中出現(xiàn)性能降低等問題，是因為污染問題的發(fā)生導致空氣系統(tǒng)中存在有效的菌體。在進行空氣過濾器設備安裝時，選用的設備質量比較低或者高效濾芯的安裝質量比較差，無菌環(huán)境中存在水分都會引發(fā)比較嚴重的污染問題。無菌環(huán)境中的油分大多是出自復式空氣壓縮機設備。在對污染問題進行排查時要對無油潤滑空壓機設備進行有效的檢查[8]。

3.染菌問題的防控措施

3.1 一級種子管接種缺陷防控措施

在進行接種處理時，可以采用零磅接種或者壓差接種等技術，利用零磅接種技術進行相關操作時，罐壓的瞬時速度為零時，外界的空氣可能會從接種處進入到內(nèi)部引發(fā)污染問題，因此要提高接種區(qū)域的潔凈度，可以將接種區(qū)域與其他區(qū)域進行有效的隔離。生產(chǎn)人員要保證罐內(nèi)的衛(wèi)生，還要保證實驗內(nèi)部始終處于密封的狀態(tài)，每次進行接種處理之前要先開展消毒操作[9]。

3.2 蒸汽質量差防控措施

在生產(chǎn)時間允許的情況下，可以通過空消技術的應用對蒸汽中的冷凝水進行有效的排除。如果蒸汽環(huán)境處于干燥的狀態(tài)，可以進行滅菌處理。在進行滅菌操作時，要開啟所有的的冷凝水閥門設備，排除內(nèi)部的冷凝水之后，要保證蒸汽中的含水量不斷減少，再進罐處理。但這種技術屬于應急方案，要想從根本上對問題進行消除，還需要對蒸汽鍋爐設備的性能進行改良，要對容量和管路進行合理的設計和安裝，還要做好管道的保溫處理。在對管路進行安裝時不能直接連接非消毒的設施，例如采暖設備等，避免管道之間的相互傳播。

3.3 空氣系統(tǒng)缺陷防控措施

在對這項問題進行預防時，首先要添加除油或者除水設備，要選擇性能更加優(yōu)越的設備類型，還要做好定期的排水處理，尤其是周邊濕度比較大時，要提升排水的速率。可以選擇無油潤滑的空壓機設備，從根源上對這項問題進行有效的防控。如果無法對設備性能進行有效的改造，可以在空氣過濾器設備上增加玻璃棉或者活性炭，減少油霧的阻力。在對過濾器熱備的濾芯進行選擇時，要盡可能選擇比較可靠的生產(chǎn)商進行產(chǎn)品的購買，還要選擇更加先進的檢測儀器和技術方法，對濾芯是否存在失效的問題進行準確的判斷。在對高效過濾器設備進行安裝時，要對滅菌管路進行減壓或者粗略的處理，還要在進出口管路上進行監(jiān)測設備的安裝。要對各項構件的尺寸是否合適進行全面的檢查，還要對發(fā)酵環(huán)節(jié)的生產(chǎn)程序進行優(yōu)化處理。

4.結語

我國當前在進行抗生素發(fā)酵技術研發(fā)和試驗的過程中，已經(jīng)根據(jù)染菌問題的發(fā)生制定了針對性的防控技術，生產(chǎn)人員也對這項工作進行了高度的重視。但實際上在對發(fā)酵生產(chǎn)進行防控時，要從每一個環(huán)節(jié)開始進行預防。生產(chǎn)人員不僅要做好常規(guī)的檢查工作，還需要在原有工藝技術的基礎上對其進行持續(xù)的優(yōu)化和完善，要提高綜合的生產(chǎn)水平才能對生產(chǎn)期間存在的各項缺陷問題進行有效的控制。在我國發(fā)酵工藝不斷發(fā)展的現(xiàn)階段，一些新型的技術已經(jīng)應用到發(fā)酵生產(chǎn)中，為整個行業(yè)的健康發(fā)展奠定了良好的基礎。