尹晨亮，張庶民 綜述，徐穎華，倪現樸 審校

1.沈陽藥科大學生命科學與生物制藥學院，遼寧 沈陽 110000；2.北京成大天和生物科技有限公司，北京 102600；3.中國食品藥品檢定研究院衛(wèi)生部生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室，北京 102629

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，CT）是一種革蘭陰性、專性細胞內寄生的原核細胞型微生物，是引起性傳播感染（sexually transmitted infection，STI）的重要病原體，可引發(fā)眼部、生殖道等多個系統(tǒng)疾病。2019 年，我國103 個性病監(jiān)測點統(tǒng)計結果表明，每10萬人中，有5.532 萬人感染CT［1］。截至2016 年，WHO 統(tǒng)計全球CT 感染者約1.272 億人［2］，嚴重影響人類生活健康。根據CT 表面外膜蛋白不同，分為19 種血清型，其中A ～C 血清型引起沙眼；D ～K 血清型主要引起泌尿生殖系統(tǒng)感染，包括男性的非淋菌性尿道炎和附睪炎及女性嚴重的并發(fā)癥（如不孕不育、異位妊娠和慢性盆腔疼痛）；L1 ～L3 血清型引起直腸感染［3］。CT 與人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染和傳播率的顯著增加有關［4］。一項來自印度的研究表明，在不孕癥患者中，大部分感染E 型CT，其次是變異體D 和F 型［5］。

目前，對抗CT 感染的主要方法是采用抗生素及對癥治療，但隨著抗生素耐藥菌株的出現，以及抗生素治療可能會降低機體對CT 免疫反應的持久性和產生抗體的能力，導致再感染率上升［6］，因此，安全、有效的CT 疫苗可能成為預防和控制CT 感染最有效、最經濟的方法，實現對易感人群的長期保護，減少傳播并抑制繼發(fā)性感染。前期，由于CT 自身的免疫逃避機制及獨特的雙相發(fā)育周期使CT 疫苗的研發(fā)受到限制［7］。近年，隨著生物技術的發(fā)展及對CT 免疫保護機制研究的深入，重組CT 疫苗取得了較大進展，重組CT 疫苗CTH522 已獲批進入Ⅰ期臨床試驗，結果表明具有良好的安全耐受性和免疫原性。本文就CT 誘導的細胞和體液免疫反應、相關重組疫苗臨床前和臨床試驗研究進展及面臨的挑戰(zhàn)作一綜述，以期為我國CT 疫苗的開發(fā)提供參考。

1 CT 特異性免疫反應

1.1細胞免疫 抗原呈遞細胞（antigen presenting cells，APC），如巨噬細胞（macrophages）和樹突狀細胞（dendritic cells，DC）等，在機體抗CT 感染免疫中發(fā)揮重要作用［8］。TLR2、STING 和NLR 等活性分子在DC 內攝取CT 時被激活，并產生促炎細胞因子，如IL-1α、IL-6、IL-12、TNF-α、CCR7 和CXCL10，促使DC 抗原呈遞，抗原被攝取后DC 可通過優(yōu)先產生IL-12，誘導未成熟的CD4+T 淋巴細胞活化和分化為主要的Th1 亞群，刺激機體免疫保護機制，形成針對CT 感染的主要保護［9］。

CD4+和CD8+T 細胞在CT 感染期間聚集至感染部位，表達上調，該結論已在小鼠和非人類靈長類動物模型中證實，激活CD4+和CD8+T 細胞免疫反應是抵抗CT 感染反應所必需的［10］。INFγ 也是對抗CT感染的最關鍵細胞因子之一，能夠激活許多與清除細胞內細菌相關的重要效應途徑，如IFNγ 激活吲哚-2，3-雙加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO），下調細胞的色氨酸水平，抑制CT 的生長；IFNγ 還可誘導一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）上調，生成NO［11］。NO 是一種抗菌因子，可破壞CT 的DNA，具有細胞毒性［12］。另外，IFNγ 抑制轉鐵蛋白受體分子在宿主細胞表面的表達，導致宿主細胞內鐵濃度的下降，影響CT 的生長。

1.2體液免疫 CT 感染能誘導機體產生抗體，包括IgG、IgE 和SIgA 等，且能提供一定的保護作用。但研究發(fā)現，這些抗體單獨并不能阻止CT 感染及其病情的惡化，可能與再次感染B 細胞介導的免疫反應與初次感染的CD4+T 細胞變化有關［13］。另外，MORRISON 等［14］研究發(fā)現，在動物模型體內CD4+T細胞消耗完后，缺乏B 細胞的小鼠也并不能清除繼發(fā)感染；同樣在缺乏B 細胞條件下，機體刺激CD4+T 細胞的能力減弱。因此，在抗CT 感染免疫反應中，B細胞對啟動T 細胞免疫反應是必需的，其中抗體可阻斷CT 對黏膜上皮細胞的黏附，阻斷CT 的進一步感染；抗體介導的調理作用增強巨噬細胞殺傷CT 的活性［15］。

2 重組疫苗候選抗原臨床前研究

隨著多種組學技術的應用，發(fā)現了一些對CT 感染潛在免疫保護的候選抗原，如多態(tài)性膜蛋白（polymorphic membrane proteins，Pmps）、蛋白酶樣活性因子（chlamydial protease-like activity factor，CPAF）和主要外膜蛋白（major outer membrane protein，MOMP）等，其中基于MOMP 為主要抗原組分的候選疫苗CTH522 已進入Ⅰ期臨床試驗，而其他候選抗原蛋白還主要集中在臨床前研究。

2.1Pmps Pmps 是一組暴露于CT 表面的膜蛋白，通過黏附，在CT 感染的初始階段發(fā)揮重要作用。共發(fā)現CT 有9 種Pmps 亞型（A ~ I）［16］，其中PmpG 亞型能夠結合其他的抗原蛋白，輔以有效的佐劑可誘導強有力的免疫反應［17］。PmpD 亞型作為一種泛中和抗原，能與不同CT 血清型產生交叉保護［18］。另外，研究證實，Pmps 能通過激活轉錄因子NF-κB，誘導受感染細胞免疫功能反應，產生IL-8、IL-6 等活性分子［16］。

ROSHAN 等［19］用rVCG-PmpD ／ PorB 重組候選疫苗免疫小鼠，可誘導強烈細胞和體液免疫反應，誘導產生高水平的CT 特異性CD4+T 細胞，分泌IFNγ、TNF-α、IL-2、IL-10、IL-17 及抗PmpD 特異性IgG2c 和IgA 抗體，并保護免疫動物抵抗CT 感染攻擊；同時也證實，免疫接種rVCG-PmpD ／ PorB 可誘導保護性免疫記憶反應，即在再次CT 感染攻擊后更快地清除病原體感染。另外，研究還發(fā)現，小鼠肌內和鼻內免疫rVCG-PmpD ／ PorB 后，兩種免疫途徑均可誘導CD4+T 細胞分泌相對較高水平的Th1 相關IFNγ 和較低水平的Th2 相關IL-4 細胞因子，誘導刺激CD4+T 細胞增殖［20］。rVCG-PmpD ／ PorB 在體內與Fms 樣酪氨酸激酶受體Flt3 ／ Flk2 結合，刺激各種免疫細胞的增殖和分化，產生高滴度抗體。上述研究表明，PmpD 可被抗原呈遞細胞識別、降解、加工并呈遞給CD4+T 細胞，建議可作為CT 疫苗的候選抗原蛋白。

2.2CPAF CPAF 是CT 分泌的一種絲氨酸蛋白酶［21］，一旦進入宿主細胞胞質，可作為毒力因子，通過降解宿主抗微生物相關多肽物質，助力CT 侵襲感染宿主。另外，研究還發(fā)現，CPAF 能夠降解宿主轉錄因子，如USF-1 和RFX-5，同時，促凋亡蛋白BH3也被CPAF 降解，阻斷了CT 凋亡［22］。

通過CT 感染患者陽性血清譜分析發(fā)現，CPAF具有潛在免疫原性，同時，在動物模型中也證實，CPAF誘導的免疫反應為依賴IFNγ 的細胞免疫，而非產生抗體的體液免疫［23］。MURTHY 等［24］用重組CPAF（rCPAF）經小鼠鼻黏膜接種，可在體內引起強烈的Th1 細胞免疫反應，產生INFγ；當輔以IL-12 作為佐劑時，可顯著提高CPAF 誘導免疫應答，并產生黏膜IgA 應答；隨后該研究還構建了一種新的CPAF 融合蛋白（rCPAFep），即由5 個CPAF 的T 細胞反應性表位多肽（Cep1-5）融合表達而成，發(fā)現具有與全長的CPAF 相同的免疫原性和保護效果，表明這5 個多肽是CPAF 主要的抗原性保護表位，可作為潛在疫苗抗原成分，同時又可避免CPAF 中其他多肽可能引起不良反應的風險。

3 進入臨床的重組候選疫苗

MOMP 是一種相對分值質量約40 000 的跨膜蛋白，約占CT 外膜的60%。作為一種優(yōu)勢膜蛋白抗原，MOMP 表面有眾多的B 和T 細胞表位，可刺激產生抗體和引發(fā)細胞免疫。GUIFENG 等［25］對天然MOMP（nMOMP）和重組MOMP（rMOMP）輔以佐劑CpG-1826 免疫小鼠后，結果發(fā)現，rMOMP 在動物模型中僅誘導產生部分免疫保護，而nMOMP 的免疫保護效力更強，表明MOMP 免疫保護性可能高度依賴重組蛋白構象結構。另外，OLSEN 等［26］基于MOMP上可變域VD4 多聚體研發(fā)了一種新rMOMP 候選疫苗，VD4 含有B 細胞表位，該候選疫苗能產生中和D、E、F 和G 型CT 的高滴度的抗體，并能誘導較強的T 細胞反應，保護小鼠模型中由CT 感染引起的生殖道病變。

ABRAHAM 等［27］將rMOMP 中所有Cys 殘基用Ser 取代，并融合至4 個血清型D ～G 的可變域上，以此MOMP 為基礎的CTH522 疫苗進入Ⅰ期臨床試驗，該疫苗以CAF01 脂質體或氫氧化鋁作為佐劑，受試者（19 ～45 歲的健康女性）分別于4 個月內接種3 次結合佐劑的85 μg CTH522 疫苗，隨后1 個月內分別接受2 次30 μg 未結合佐劑的疫苗，結果表明，受試者未發(fā)現嚴重不良反應，88% ～93%受試者發(fā)生局部不良反應（包括注射部位疼痛、壓痛和運動障礙）和全身不良反應（包括頭痛、疲勞、不適和肌痛），與目前已批準上市許可的其他重組亞單位疫苗（如乙肝疫苗）的安全性相當［28］。免疫原性分析結果顯示，兩種結合不同佐劑疫苗在第1 次接種后均產生了免疫反應，第3 次免疫后，CTH522 ∶CAF01 誘導的IgG 滴度比CTH522 ∶Al（OH）3顯著提高了5 ～6 倍（P= 0.009 1），且在整個研究周期中其誘導中和抗體和黏膜IgA 水平及介導細胞免疫反應要優(yōu)于CTH522 ∶Al（OH）3組［27］。表明候選疫苗具有良好的安全耐受性和免疫原性，具有較廣闊應用前景。

4 重組CT 疫苗面臨的挑戰(zhàn)

4.1覆蓋CT 血清型廣的候選重組抗原選擇 重組蛋白疫苗的首要問題是選擇廣泛覆蓋、高度保守、具備強免疫原性的靶抗原成分。盡管目前已發(fā)現了許多對不同血清型CT 感染具有一定保護性作用的毒力蛋白，但尚未發(fā)現一種具有激發(fā)機體針對所有血清型CT 定殖、黏附和侵襲全過程免疫保護效能的蛋白。因此，將不同優(yōu)勢抗原組合，盡量覆蓋所有CT 致病性血清型，通過協(xié)同激發(fā)機體保護性免疫或許是重組CT 疫苗抗原組分最佳選擇。近年得到突破性進展、獲批上市重組疫苗包括B 群流腦疫苗、幽門螺旋桿菌疫苗等，均包含了多種重組抗原組分。

4.2適宜免疫佐劑的使用 單獨的重組疫苗抗原組分通常免疫原性較低，需輔以佐劑增強免疫原性。如乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV），在相應疫苗配方中加入多種佐劑能夠誘導產生較強的免疫反應［29］。HONG 等［30］組合3 種不同佐劑（CpG-ODN1826、AbISco-100 或CAF01）配制了重組PmpG-1、PmpE／F-2和MOMP 疫苗，小鼠動物實驗證實，CAF01 作為佐劑可最有效保護BALB ／ c 小鼠免受CT 感染。CAF01是一種陽離子佐劑，由二甲基雙十八烷基胺（Dimethyldioctadecylammonium，DDA）和海藻糖二霉菌酸酯的合成類似物（trehaloseD-(+)-trehalose 6，6'-dibehenate，TDB）組成，DDA 具有增強抗原遞呈和攝取的能力，確?？乖某掷m(xù)釋放；TDB 作為一種免疫增強劑，保護Th1 和Th17 免疫。DDA 與TDB 的結合能刺激CD4+T 細胞共表達IFNγ 和TNF-α，引起較強的免疫反應［31］。

另外，黏膜免疫能夠有效控制CT 的侵入，黏膜佐劑是在感染部位增強免疫的理想選擇。目前，最常用的實驗黏膜佐劑有基于毒素的佐劑，如LT 等。LT 是強效但有毒的黏膜佐劑，使用定點突變的新一代LT佐劑可減輕毒性。LTK63 是一種突變體，在無酶活性和毒性的情況下保持佐劑活性。ORETTA 等［32］使用LTK63 ／ CpG 佐劑與新發(fā)現的T 和B 細胞聯(lián)合給藥，以評估針對CT 疫苗效力，結果表明，LTK ／ CpG 疫苗佐劑產生較強的Th1 免疫反應，其特征是誘導由TNF-α 或IL-2 共同表達的抗原特異性IFNγ。

4.3有效疫苗評價的動物模型 適宜的動物模型對CT 感染的研究及候選疫苗的開發(fā)和評估是必不可少的，目前常用的動物模型包括小鼠、豚鼠、非人靈長類動物等［33］。小鼠是研究生殖器CT 感染和評估候選疫苗最廣泛使用的動物，具有體積小、易于處理、豐富的免疫抗原等優(yōu)勢，目前已報道的有C.trachomatis和C.muridarum兩種小鼠模型。豚鼠模型在CT 感染后的病理、生殖激素對感染的影響及感染的性傳播途徑更接近于人類感染CT 病理變化。豚鼠對再感染的免疫力持續(xù)時間較短，與人類相似，適用于評估潛在的候選疫苗［34］。

由于人類和非人靈長類動物之間具有密切的進化關系，基因相似度高，因此，使用靈長類動物研究由CT 引起的生殖道疾病最具有可比性。其中研究最多的是獼猴，豬尾獼猴的雌性生殖道的解剖結構和生理特性與人類相似，在自然界也易受人類CT變種的生殖道感染，不需進行預處理［35-36］。另外，VANROMPAY 等［37］將豬作為研究CT 生殖道感染的大型動物模型進行評估，發(fā)現雌性豬生殖組織中表達的大多數基因均在人類生殖器組織中普遍表達，且豬自然易感CT。豬動物模型也用于CT DNA 疫苗的評價研究，結果表明，接種該DNA 疫苗可誘導產生對CT 攻擊的免疫保護［37］。但豬模型不適合需要大量動物的基礎研究，是否能作為有效動物模型還有待進一步研究。

5 小結與展望

CT 感染是全球公共衛(wèi)生問題之一，其獨特又復雜的雙相發(fā)育機制，使其在感染初始階段可通過黏膜中和抗體進行有效控制［38-39］，包括IgA 和IgG 抗體均可在初始階段阻斷CT 的細胞附著；CT 被內化后，分泌Th1 的干擾素IFNγ 細胞在機體抗感染免疫反應發(fā)揮重要作用［40］。因此候選疫苗需要能同時激發(fā)Th1 和Th2 免疫反應，可能產生更好的保護效果?；诋斍暗难芯砍晒?，單個CT 抗原蛋白的免疫作用偏弱，且CT 有多種血清型分類，需要多種保護性蛋白組分的共同作用，通過協(xié)同激發(fā)機體保護性免疫或許是重組CT 疫苗抗原組分的最佳選擇。

新型強有力的佐劑和遞送系統(tǒng)在重組疫苗研發(fā)中也是非常重要的，能夠克服重組蛋白質折疊的問題［41］。雖然黏膜佐劑是CT 疫苗開發(fā)的一個新突破，但其制備復雜，其向人類生殖器黏膜的遞送存在問題，需要進一步的改進和完善。另外，應需要選擇除小鼠以外的動物模型進行候選疫苗評價研究，如獼猴和豚鼠等動物模型評估有效的疫苗配方。通過在合適的動物模型中優(yōu)化疫苗配方、佐劑和遞送系統(tǒng)，并產生合適的候選CT 疫苗，用于后續(xù)臨床試驗。隨著疫苗研制技術的不斷進步，對感染宿主細胞機制的了解及候選抗原的篩選，有望研制出高效的重組CT 疫苗。