李崇斌 尹航 方鵬 朱曉黎 劉建震 范正超

1 河北省胸科醫(yī)院泌尿外科, 石家莊 050041；2 河北省胸科醫(yī)院分子生物實(shí)驗(yàn)室, 石家莊 050041

近年來(lái)， 雖然全球結(jié)核病的發(fā)病率已趨于穩(wěn)定，但不典型腎結(jié)核發(fā)病增多，且易誤診或漏診，一些患者甚至出現(xiàn)由于長(zhǎng)期誤診、誤治導(dǎo)致腎功能衰竭等嚴(yán)重后果。 提高不典型腎結(jié)核的早期診斷水平，有助于避免或減少手術(shù)，改善預(yù)后。 本研究回顧性分析了在河北省胸科醫(yī)院就診的不典型腎結(jié)核患者與非結(jié)核腎病患者的病歷資料，探討結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)(T-SPOT.TB)檢測(cè)與利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)(GeneXpert MTB/RIF)檢測(cè)在不典型腎結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值， 旨在為不典型腎結(jié)核的早期診斷提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

納入 2015 年 10 月至 2020 年 12 月在河北省胸科醫(yī)院泌尿外科住院診治的46 例不典型腎結(jié)核患者 (結(jié)核組)、53 例未感染結(jié)核的腎病患者 (對(duì)照組)。 所有患者入院后常規(guī)進(jìn)行結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD試驗(yàn))、靜脈血 T-SPOT.TB 檢測(cè)、HIV 抗體檢測(cè)，尿沉渣抗酸桿 菌 染 色 鏡檢 （AFB 鏡 檢法）、BACTEC MGIT960 液體培養(yǎng) （液體培養(yǎng)法）、 結(jié)核分枝桿菌DNA 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR (TB-DNA FQ-PCR)、GeneXpert MTB/RIF 檢測(cè)。 本課題研究已通過河北省胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)審批 (審批號(hào)：2021007)，所有患者均知情同意。

二、納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

不典型腎結(jié)核的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn): 沒有典型的嚴(yán)重尿頻、尿急癥狀，僅以輕微的尿頻或以血尿、腰痛為主要表現(xiàn)，甚至無(wú)任何臨床癥狀，只有影像學(xué)的一些改變，以尿結(jié)核菌培養(yǎng)有結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)或結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)陽(yáng)性或經(jīng)腎組織病理檢查為確診腎結(jié)核的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

排除標(biāo)準(zhǔn)：患有惡性腫瘤、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良、接受甾體類激素或免疫抑制劑治療、放射治療及艾滋病等全身免疫缺陷等疾病。

三、主要試劑及儀器

結(jié)核菌素純蛋白衍生物購(gòu)于北京祥瑞生物制品有限公司。 結(jié)核分枝桿菌特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法)購(gòu)于廣東希格生物科技有限公司?？顾崛旧噭?%的石炭酸復(fù)紅液，5%的鹽酸乙醇液，稀釋美蘭購(gòu)于珠海貝索生物技術(shù)有限公司。7600 型實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)于達(dá)安基因有限公司，分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(PCR 熒光探針法，國(guó)械注準(zhǔn)20173401341)購(gòu)于成都博奧晶芯生物科技有限公司。 BACTEC MGIT960 分枝桿菌培養(yǎng)基(國(guó)械注進(jìn)20142405711)購(gòu)于碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司。 全封閉耐藥檢測(cè)系統(tǒng)(GeneX-pert 系統(tǒng)，型號(hào)GX-XVIR2)購(gòu)于美國(guó)賽沛公司。

四、檢測(cè)方法

1.樣本采集

連續(xù)3~5 次無(wú)菌留取第一次新鮮中段晨尿，每次30~40 mL，送抗酸染色、結(jié)核菌培養(yǎng)、TB-DNA FQ-PCR 及 GeneXpert MTB/RIF 檢測(cè)。 肝素抗凝管采集周圍靜脈血5 mL，行T-SPOT.TB 檢測(cè)。

2.PPD 試驗(yàn)

按照結(jié)核菌素純蛋白衍生物藥品說(shuō)明書及操作規(guī)范進(jìn)行 PPD 試驗(yàn)，72 h 觀察結(jié)果。

在樁基礎(chǔ)施工過程中最為關(guān)鍵的施工工序就是放線定位，通過定位之后需要對(duì)鉆機(jī)基本特點(diǎn)進(jìn)行分析，然后選取最佳施工位置。在不影響成孔質(zhì)量前提下進(jìn)行拴樁，拴樁中需要合理應(yīng)用十字交叉法進(jìn)行質(zhì)量檢查，然后根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行補(bǔ)樁和復(fù)測(cè)[1]。

3.T-SPOT.TB 檢測(cè)

按照試劑盒說(shuō)明書操作及判定結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果表明樣本中存在針對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異的T 細(xì)胞。

4.AFB 鏡檢法

取新鮮晨尿 1 mL，3 000 r/min 離心 15 min (離心半徑7 cm)，棄上清，留沉渣涂片，固定，抗酸桿菌染色，鏡檢。 按照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》檢測(cè)及判定結(jié)果。

5.結(jié)核菌培養(yǎng)

取新鮮晨尿2 mL 按 《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》行結(jié)核菌培養(yǎng)及判定結(jié)果，結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性者加行藥敏試驗(yàn)。

6.TB-DNA FQ-PCR 檢測(cè)

取無(wú)菌留取的新鮮晨尿1 mL，12 000 r/min 離心5 min(離心半徑7 cm)，留取沉淀，加入1 mL 無(wú)菌生理鹽水洗滌1 次，8 000 r/min 離心5 s (離心半徑7 cm)留取沉淀，加入 50 μL DNA 提取液混勻，100 ℃恒溫干浴 10 min，4 ℃冰箱冷卻后，8 000 r/min 的速度離心5 s (離心半徑7 cm)待用。 取標(biāo)準(zhǔn)品、陰性、陽(yáng)性質(zhì)控品各1 mL，8 000 r/min 離心5 s (離心半徑7 cm)。 取陰性和陽(yáng)性質(zhì)控品各50μl 加等量已混勻的 DNA 提取液混勻，100 ℃恒溫干浴 10 min，4 ℃冰箱冷卻后，以8 000 r/min 的速度離心5 s (離心半徑7 cm)，待用。把處理過的樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品分別吸取上清2 μL 加入反應(yīng)管中，8 000 r/min 離心 5 s(離心半徑 7 cm)，置入 7600 型實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)，按預(yù)設(shè)程序進(jìn)行擴(kuò)增和分析，記錄結(jié)果。擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct 值)<40 為陽(yáng)性，>40 為陰性。

7.GeneXpert MTB/RIF 檢測(cè)

嚴(yán)格按試劑盒的說(shuō)明書操作，取無(wú)菌留取的新鮮晨尿15 mL，以6 000 r/min 的速度離心20 min(離心半徑 7 cm)，留取沉淀 2 mL，標(biāo)配處理液 1∶2 比例混合，旋緊管蓋，用力振蕩 10～20 次，靜置 5～10 min 時(shí)再次用力振搖 10～20 次，再室溫靜置 5～10 min。樣本充分液化，無(wú)未液化的沉渣。 吸取2 mL 樣本至Xpert反應(yīng)試劑盒，置于GeneXpert 檢測(cè)系統(tǒng)自動(dòng)化檢測(cè)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料通過K-S 檢驗(yàn)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，兩配對(duì)樣本率的比較（靈敏度、特異性）采用McNemar 檢驗(yàn)，兩獨(dú)立樣本率的比較（陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度） 采用Pearson 卡方檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。 P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組患者臨床資料的比較

結(jié)核組中， 男性 25 例 (54.35%)， 女性 21 例(45.65%)，年齡(42.7±9.8)歲，范圍 21~66 歲，左腎結(jié)核 22 例(47.83%)，右腎結(jié)核 23 例(50.00%)，雙腎結(jié)核1 例 (2.17%)。 患者主要癥狀為輕微尿頻23 例(50.00%)，體檢發(fā)現(xiàn)腎積水或伴有腎實(shí)質(zhì)損害14 例(30.43%)，患側(cè)腰部酸脹不適 5 例(10.87%)，血尿 4例(8.70%)。 泌尿系彩超或CT 檢查發(fā)現(xiàn)不同程度的腎積水：輕度 38 例，中度 7 例，重度 1 例。 對(duì)照組男31 例(58.49%)，女 22 例(41.51%)，年齡(40.7±10.5)歲，范圍 23~75 歲，單純性腎囊腫(直徑>4 cm)18 例(33.96%)，慢性腎盂腎炎 15 例(28.30%)，腎盂旁囊腫4 例(7.55%)，腎盂輸尿管連接部梗阻伴腎積水13 例(24.53%)，腎錯(cuò)構(gòu)瘤(直徑>4 cm)3 例(5.66%)。

結(jié)核組患者經(jīng)尿液BACTEC MGIT960 液體培養(yǎng)陽(yáng)性或結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)陽(yáng)性或腎組織病理學(xué)檢查確診。 對(duì)照組患者經(jīng)上述結(jié)核菌檢測(cè)陰性排除腎結(jié)核， 且術(shù)后病理結(jié)果與術(shù)前診斷相符，慢性腎盂腎炎經(jīng)抗感染治療治愈。

二、不同方法的檢測(cè)結(jié)果比較

由表1 可見，T-SPOT.TB 的靈敏度為95.65%，高于 PPD 試驗(yàn)(73.91%，McNemar 檢驗(yàn)：P=0.002)，兩者特異性(McNemar 檢驗(yàn)：P=0.250)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(χ=0.12, P=0.729)、準(zhǔn)確度(χ=1.09, P=0.296)均無(wú)差異，T-SPOT.TB 陰性預(yù)測(cè)值為 95.74%， 高于PPD 試驗(yàn)(80.00%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ=5.75，P=0.002)。

表1 不同結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法的結(jié)果比較(%)

注：PPD 試驗(yàn):結(jié)核菌素試驗(yàn)；T-SPOT.TB：結(jié)核感染T 細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)；AFB 鏡檢法：涂片抗酸桿菌染色鏡檢法；TB-DNA FQ-PCR：結(jié)核分枝桿菌DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR；GeneXpert MTB/RIF：利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)

方法 靈敏度 特異性 陽(yáng)性預(yù)測(cè)值 陰性預(yù)測(cè)值 準(zhǔn)確度PPD 試驗(yàn) 73.91 90.57 87.18 80.00 82.83 T-SPOT.TB 95.65 84.91 84.62 95.74 89.90 AFB 鏡檢法 4.35 94.34 40.00 53.19 52.53液體培養(yǎng)法 28.26 100.00 100.00 61.63 66.67 TB-DNA FQ-PCR 58.70 96.23 93.10 72.86 78.79 GeneXpert MTB/RIF 84.78 100.00 100.00 88.33 92.93

GeneXpert MTB/RIF 檢測(cè)靈敏度為84.78%，高于TB-DNA FQ-PCR (58.70%)、 結(jié)核菌液體培養(yǎng)法(28.26%) 和 AFB 鏡檢法 (4.35%)(McNemar 檢驗(yàn)：P均<0.001)。 GeneXpert MTB/RIF 與液體培養(yǎng)法的特異性均為 100.00%，TB-DNA FQ-PCR 為 96.23%，AFB 鏡檢法為 94.34%，GeneXpert MTB/RIF 與三者的特異性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(McNemar 檢驗(yàn)：P=1.000、0.500 和 0.250)。 GeneXpert MTB/RIF 與液體培養(yǎng)法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均為100.00%， 高于AFB 鏡檢法(40.00%，F(xiàn)isher 確切概率法，P=0.001)， 與 TB-DNA FQ-PCR 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(93.10%，F(xiàn)isher 確切概率法，P =0.178)。 GeneXpert MTB/RIF 的 陰 性 預(yù) 測(cè) 值（88.33%） 高于 AFB 鏡檢法 (53.19%，χ=20.42, P<0.001)、液體培養(yǎng)法(61.63%，χ=12.67, P<0.001)、TBDNA FQ-PCR(72.86%，χ=4.84，P=0.028)，其準(zhǔn)確度（92.93%） 高于 AFB 鏡檢法 (52.53%，χ=40.74，P<0.001)、 液體培養(yǎng)法 (66.67%，χ=21.18，P<0.001)與TB-DNA FQ-PCR(78.79%，χ=8.15，P=0.004)。

討 論

不典型腎結(jié)核僅表現(xiàn)為輕微的甚至無(wú)任何臨床癥狀，只有部分影像學(xué)改變。 本研究的臨床資料顯示，結(jié)核組的主要癥狀為輕微尿頻、不明原因腎積水提示不典型腎結(jié)核的臨床癥狀更加隱匿，且可能較早出現(xiàn)輸尿管結(jié)核性梗阻而繼發(fā)腎積水。如何提高不典型腎結(jié)核的診斷水平，應(yīng)當(dāng)引起高度重視。

一、T-SPOT.TB 在不典型腎結(jié)核篩查中有較高的應(yīng)用價(jià)值

PPD 試驗(yàn)與T-SPOT.TB 均為輔助診斷和篩查結(jié)核病及結(jié)核分枝桿菌潛伏感染較為有效和敏感的方法。 本研究結(jié)果顯示，T-SPOT.TB 的靈敏度（95.65%）和陰性預(yù)測(cè)值 (95.74%)高于PPD 試驗(yàn)，與現(xiàn)有報(bào)道相似，但兩者特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和準(zhǔn)確度無(wú)顯著差異。究其原因，可能是由于T-SPOT.TB是通過檢測(cè)血液樣本中每個(gè)活化的結(jié)核特異效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)(即顯色的斑點(diǎn)數(shù))來(lái)判斷結(jié)核分枝桿菌感染狀態(tài)，靈敏度極高，而PPD 試驗(yàn)屬于Ⅳ型超敏反應(yīng)，需要測(cè)量和觀察皮膚的硬結(jié)和局部反應(yīng)判斷結(jié)果，易受局部炎癥因子濃度、皮膚病變、環(huán)境溫度、測(cè)量誤差等多種因素影響，導(dǎo)致T-SPOT.TB 靈敏度高于PPD 試驗(yàn)。 另外，T-SPOT.TB 在 36~48 h 即可報(bào)告結(jié)果，而PPD 試驗(yàn)一般需要48~72 h。 因此，在不典型腎結(jié)核的篩查診斷中，T-SPOT.TB 較PPD 試驗(yàn)具有更高的靈敏度和應(yīng)用價(jià)值。

二、GeneXpert MTB/RIF 在不典型腎結(jié)核病原學(xué)診斷中有較高的應(yīng)用價(jià)值

腎結(jié)核的病原學(xué)診斷包括抗酸染色（AFB 鏡檢法）、結(jié)核菌培養(yǎng)以及結(jié)核菌DNA 檢測(cè)，以尿結(jié)核菌培養(yǎng)為“金標(biāo)準(zhǔn)”。 AFB 鏡檢法無(wú)法區(qū)分結(jié)核分枝桿菌和其他抗酸桿菌，如包皮桿菌等。 尿結(jié)核分枝桿菌DNA 檢測(cè)雖然對(duì)尿結(jié)核分枝桿菌具有較高的特異性和靈敏度，但當(dāng)腎自截、腎無(wú)功能或輸尿管梗阻導(dǎo)致結(jié)核菌無(wú)法隨尿排出及DNA 被污染或發(fā)生變性時(shí)，可出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果。 另外結(jié)核菌能自發(fā)或經(jīng)理化、生物因素誘導(dǎo)形成L 型結(jié)核分枝桿菌， 可導(dǎo)致臨床癥狀不典型、PPD 試驗(yàn)不敏感、 抗酸染色不能檢出等后果。 本研究顯示，GeneXpert MTB/RIF 的靈敏度（84.78%）、陰性預(yù)測(cè)值（100.00%）和準(zhǔn)確度（92.93%）均高于 TB-DNA FQ-PCR、 液體培養(yǎng)法和AFB 鏡檢法， 證實(shí)了Xpert檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌具有高度的靈敏度和準(zhǔn)確性，且具備較高的陰性預(yù)測(cè)診斷價(jià)值。 GeneXpert MTB/RIF 與BACTEC MGIT96 液體培養(yǎng)法的特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均為100%， 兩者特異性與TB-DNA FQPCR 和AFB 鏡檢法無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高于AFB 鏡檢法， 與 TB-DNA FQ-PCR 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 分析原因可能為：（1） 對(duì)樣本的含菌量要求不同， 理論上，AFB 鏡檢法檢查樣本含菌量需5×10～5×10/mL，結(jié)核菌培養(yǎng)需 100/mL，TB-DNA 檢測(cè)只需樣本中含有1 根結(jié)核菌即可， 少于此數(shù)時(shí)不易獲得陽(yáng)性結(jié)果；（2）結(jié)核菌培養(yǎng)要求樣本中含有存活的可繁殖的結(jié)核菌，而且生長(zhǎng)緩慢，條件苛刻，耗時(shí)長(zhǎng)，需要 4~8周；（3）TB-DNA FQ-PCR 與 GeneXpert MTB/RIF 雖然都采用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)， 但由于操作設(shè)備靈敏度、密閉條件和檢測(cè)樣本量的不同(15 mL 和 1 mL)， 造成兩者靈敏度的差異。 因此，GeneXpert MTB/RIF 在不典型腎結(jié)核的病原學(xué)診斷中具有更高的靈敏度和應(yīng)用價(jià)值。

三、結(jié)語(yǔ)

本研究發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB 與GeneXpert MTB/RIF在不典型腎結(jié)核的篩查和病原學(xué)診斷中有較高的靈敏度和應(yīng)用價(jià)值，推薦臨床應(yīng)用。 但由于研究對(duì)象數(shù)量有限，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)行大型、多中心的前瞻性研究。 目前部分有條件的科研和臨床研究中心已經(jīng)開展了更先進(jìn)的Xpert MTB/RIF Ultra， 進(jìn)一步提高了檢測(cè)靈敏度， 但其特異性稍低于GeneXpert MTB/RIF，同時(shí)還探討了如何使用現(xiàn)有設(shè)備條件促進(jìn)Xpert MTB/RIF 的推廣應(yīng)用， 以上研究對(duì)臨床上提高不典型腎結(jié)核診治水平給予極大的信心。

利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

李崇斌：研究設(shè)計(jì)和實(shí)施，采集數(shù)據(jù)，分析和解釋數(shù)據(jù)，撰寫論文；尹航、朱曉黎、劉建震：實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)和分析；方鵬：分子生物技術(shù)指導(dǎo)和實(shí)施，范正超；論文審閱和工作指導(dǎo)