曾紫微 彭爽 余維維 王敏

1 南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院研究生協(xié)作培養(yǎng)基地， 湖南衡陽(yáng) 421001；2 長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院艾滋病研究所，長(zhǎng)沙 410005

抗病毒治療（ART）的出現(xiàn)控制了HIV 的復(fù)制，但由于在急性感染期形成的病毒儲(chǔ)存庫(kù)，病毒難以從人體清除，而這也是目前艾滋病可以治療但尚不能夠徹底治愈的原因之一。 嵌合抗原受體T 細(xì)胞（CAR-T）免疫療法在治療血液系統(tǒng)疾病以及實(shí)體瘤方面卓有成效，為其治療艾滋病提供了新的契機(jī)。 本綜述概述了抗HIV CAR-T 免疫療法的不同設(shè)計(jì)策略、效果、不良反應(yīng)及可能的解決方法及在治療其他疾病方面的應(yīng)用等內(nèi)容。

一、CAR-T 免疫療法治療艾滋病

1.設(shè)計(jì)策略

CAR-T 細(xì)胞是將單克隆抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)與T 細(xì)胞的信號(hào)激活機(jī)制結(jié)合，擺脫MHC 的限制，擴(kuò)大細(xì)胞治療的應(yīng)用范圍。 嵌合抗原受體的主要結(jié)構(gòu)包括胞外、跨膜及胞內(nèi)3個(gè)部分：胞外結(jié)構(gòu)也稱細(xì)胞外域，起著與抗原特異性結(jié)合的作用，跨膜部分為錨定受體的作用，而胞內(nèi)部分即信號(hào)傳導(dǎo)域，負(fù)責(zé)傳輸信號(hào)。細(xì)胞外域通常由單鏈可變抗體（ScFV）組成，跨膜部分主要來(lái)源于 CD28、CD8α 或 CD4，信號(hào)傳導(dǎo)域由來(lái)自 T 細(xì)胞抗原受體（TCR）復(fù)合體的 CD3ζ 鏈組成。 利用上述特性， 研究人員設(shè)計(jì)了嵌合抗原受體來(lái)識(shí)別特定抗原，并且激活嵌合抗原受體表達(dá)的效應(yīng)細(xì)胞。CAR-T 免疫療法通常包括以下步驟：（1）從患者血液中分離出外周血單核細(xì)胞（PBMCs）；（2）用嵌合抗原受體載體轉(zhuǎn)染 T 細(xì)胞；（3）表達(dá)嵌合抗原受體的T 細(xì)胞在體外擴(kuò)增；（4） 對(duì)表達(dá)嵌合抗原受體的T 細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估后回輸至患者體內(nèi)。

20 世紀(jì)90 年代至今，抗HIV 特異性CAR-T 細(xì)胞已發(fā)展到第 4 代。 第 3 代 CAR-T 細(xì)胞則擁有兩個(gè)共刺激域，在細(xì)胞持久性、細(xì)胞毒性以及長(zhǎng)期生存等方面優(yōu)于第2 代。 第4代CAR-T 細(xì)胞，即T 細(xì)胞重定向通用細(xì)胞因子介導(dǎo)的殺傷T細(xì)胞，將IL-12 基因添加至嵌合抗原受體盒中，故在嵌合抗原受體表達(dá)的同時(shí)，還存在著IL-12 的釋放，這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)增強(qiáng)了T 細(xì)胞的活化，并吸引及激活先天免疫細(xì)胞以消除靶向病變中的抗原陰性靶向細(xì)胞。 但有研究表明，基于CD4T 細(xì)胞為受體的嵌合抗原受體更易感染HIV，研究人員針對(duì)該問(wèn)題設(shè)計(jì)出了基于廣泛中和抗體（bNAbs）的ScFV。在約20%的HIV 感染者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了bNAbs， 它能與HIV 的包膜糖蛋白（Env）特異性結(jié)合，有效中和大多數(shù)循環(huán)中的HIV，為設(shè)計(jì)bNAb-CAR 提供了基礎(chǔ)。 Ali 等設(shè)計(jì)并研究了 7 個(gè)基于bNAbs 的 不 同 序 列 ， 包 括 10E8、3BNC117、PG9、PGT126、PGT128、VRC01 和 X5，發(fā)現(xiàn)病毒復(fù)制受到控制，并對(duì) HIV 感染的細(xì)胞有激活及殺傷作用。Hale 等發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有HIV 復(fù)制的情況下，HIV 感染的細(xì)胞被基于bNAbs 的抗HIV CAR-T細(xì)胞特異性激活和殺死?；赟cFV 的嵌合抗原受體，其目標(biāo)位點(diǎn)有CD4 結(jié)合位點(diǎn)、糖蛋白120 （gp120）的幾種抗原、gp41的膜氧化區(qū)、富含甘露糖區(qū)和可變聚糖區(qū)等。 為了克服HIV 突變逃逸機(jī)制、提高親和力以及特異性，研究者們?cè)O(shè)計(jì)出了雙特異性和三特異性嵌合抗原受體。CD4-甘露糖結(jié)合凝集素（MBL） 嵌合抗原受體在與單獨(dú) CD4和 CD4抗 gp120 比較中，顯示出最佳效力。 Anthony-Gonda 等利用雙特異性和三特異性CAR-T 細(xì)胞在人源化小鼠模型中有效殺死了HIV 感染細(xì)胞，同時(shí)能夠保護(hù)CAR-T 細(xì)胞免受感染。目前，至少有2 項(xiàng)用于消除潛伏性儲(chǔ)存庫(kù)的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中：一項(xiàng)是使用改良的基于 bNAb 的 CAR-T 免疫療法（NCT03240328）， 一項(xiàng)是使用基于 CD4 的 CAR-T 免疫療法聯(lián)合 CCR5 消融（NCT03617198）。

2.存在的問(wèn)題和困難

（1）HIV 易感性

有研究表明， 基于CD4 的嵌合抗原受體使CAR-T 細(xì)胞易受 HIV 感染，其原因主要是在結(jié)合 CCR5 或 CXCR4 共受體蛋白之前，嵌合抗原受體中的胞外結(jié)構(gòu)域（CD4 細(xì)胞或bNAb）可以替代天然CD4 細(xì)胞，從而能夠感染CD8或CCR5T 細(xì)胞。配有 CD4ζCAR 病毒融合抑制劑（C46 肽）或利用短發(fā)夾RNA（shRNA）敲除 CCR5 并降解病毒 RNA，這兩種方法都成功地使CD4ζCAR-T 細(xì)胞對(duì)HIV 感染產(chǎn)生耐藥性， 并使得它們具有長(zhǎng)期的持久性以及部分控制體內(nèi)的HIV 感染。此外，有研究使用了幾種基因組編輯技術(shù)，比如鋅指核酸酶（ZFNs）、 轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALENs）、CRISPR/CAS9 等來(lái)敲除T 細(xì)胞中的CCR5， 以賦予其對(duì)HIV 感染的永久耐受性。

（2）擴(kuò)增困難

Scholler 等觀察到基于 CD4細(xì)胞的 CAR-T 細(xì)胞在體內(nèi)并未出現(xiàn)擴(kuò)增現(xiàn)象，而CAR-T 細(xì)胞在治療腫瘤時(shí)，同樣存在著擴(kuò)增困難的問(wèn)題。 為此，Sockolosky 等對(duì) IL-2 進(jìn)行了設(shè)計(jì)， 避免了其他效應(yīng)T 細(xì)胞受到刺激而擴(kuò)增， 這使得CAR-T 細(xì)胞均勻表達(dá)效應(yīng)增大，還延遲了效應(yīng)T 細(xì)胞的分化和衰竭。 此外，F(xiàn)raietta 等通過(guò)敲除甲基胞嘧啶雙加氧酶2（TET2）基因來(lái)促進(jìn)CAR-T 細(xì)胞的擴(kuò)增。

（3）脫靶效應(yīng)

CAR-T 細(xì)胞能夠攻擊HIV 感染細(xì)胞，但也能夠攻擊表達(dá)相同或相似靶抗原的其他健康細(xì)胞，這一現(xiàn)象稱之為脫靶效應(yīng)。 正常細(xì)胞可以表達(dá)CD19，而惡性B 細(xì)胞同樣能夠表達(dá)。 所幸， 目前尚無(wú)證據(jù)表明表達(dá)MHC-Ⅱ的細(xì)胞在與CD4 CAR-T 細(xì)胞結(jié)合后會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞溶解的情況，而基于bNAb的CAR-T 免疫療法甚至更安全，因?yàn)閎NAb 是HIV 特異性靶向包膜糖蛋白。

（4）細(xì)胞因子釋放綜合征

當(dāng)CAR-T 細(xì)胞輸入人體， 它們與感染HIV 的細(xì)胞特異性結(jié)合后， 短時(shí)間內(nèi)能夠分泌大量的 TNF-α、IL-6 和 IFN-γ等，導(dǎo)致人體出現(xiàn)高熱、肌肉酸痛、疲勞等癥狀，甚至可能出現(xiàn)低血壓、氣促乃至器官功能衰竭，這被稱為細(xì)胞因子釋放綜合征 （CRS）， 多發(fā)生于輸注 CAR-T 細(xì)胞后的 1 周內(nèi)。 在CAR-T 細(xì)胞介導(dǎo)清除的過(guò)程中IL-6 水平明顯升高，故將IL-6視為CRS 的標(biāo)志性細(xì)胞因子。 CRS 期間IL-6 最重要的來(lái)源是PBMC，因此去除人單核細(xì)胞或托珠單抗阻斷IL-6 受體均可預(yù)防CRS。

二、CAR-T 免疫療法治療其他疾病

許多研究顯示，CAR-T 免疫療法在治療慢性乙型肝炎、惡性血液系統(tǒng)疾病、實(shí)體瘤等方面也同樣有效。 對(duì)于治療慢性乙型肝炎，研究方向多集中在第2 代CAR-T 細(xì)胞上。有研究以HBV 表面的 L、S 蛋白為靶點(diǎn)， 設(shè)計(jì)出 L-CAR 以及S-CAR 細(xì)胞，注入構(gòu)建的小鼠模型中，結(jié)果表明這兩種細(xì)胞均能裂解HBV 感染的細(xì)胞， 并且該過(guò)程僅有短暫的肝損傷甚至沒(méi)有出現(xiàn)肝衰竭或是肝損傷，而最近設(shè)計(jì)出的針對(duì)于HBsAg 的CAR，即HBs-CAR 細(xì)胞，注入小鼠模型后，小鼠血漿HBsAg 和HBV DNA 水平顯著降低，這些研究對(duì)于CAR療法治療慢性乙型肝炎提供了強(qiáng)有力的證據(jù)。

在血液腫瘤方面， 研究人員利用自體CD19 特異性CAR-T 細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了如慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）、彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤、頑固性免疫化療和移植或治療后復(fù)發(fā)的完全緩解。 Zhang等設(shè)計(jì)了一種以O(shè)X40 為共刺激體的，針對(duì)難治性復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性B 淋巴瘤的CAR-T 細(xì)胞， 該項(xiàng)研究共納入了5 例難治性復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性B 淋巴瘤患者，在經(jīng)過(guò)CAR-T 免疫療法后，所有患者癥狀均得到緩解，其中3 例達(dá)到部分緩解，2 例更是達(dá)到了完全緩解。 2017 年， 由諾華制藥生產(chǎn)的 CAR-T 細(xì)胞Kymriah 以及凱特制藥生產(chǎn)的Yescarta， 均已被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于B 細(xì)胞淋巴瘤的治療。2021 年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)由Juno Therapeutics 公司開(kāi)發(fā)的Breyanzi 上市，同年，由百時(shí)美施貴寶和Bluebird 公司開(kāi)發(fā)的治療復(fù)發(fā)或難治性多發(fā)性骨髓瘤的Abecma 也已被批準(zhǔn)上市。

在實(shí)體瘤方面，CAR-T 多應(yīng)用于兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胃癌、肝癌、卵巢癌等疾病。 在一項(xiàng)由19 例兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者參加的研究中，3 例患者出現(xiàn)完全緩解的情況，并且體內(nèi)持續(xù)存在CAR-T 細(xì)胞。 有研究表明，1 例經(jīng)過(guò)多次化療的晚期卵巢漿液性腺癌患者， 在復(fù)發(fā)后使用了CAR-T 免疫療法，腫瘤5 個(gè)月內(nèi)無(wú)進(jìn)展，患者生存時(shí)間達(dá)到了17 個(gè)月，未曾出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。 在胃癌、肝癌等消化系統(tǒng)腫瘤中，患者經(jīng)過(guò)CAR-T 免疫療法后的效果也十分顯著。

三、展望

CAR-T 免疫療法作為細(xì)胞免疫治療的一個(gè)重大突破，不論是在感染性疾病，還是在血液系統(tǒng)疾病、實(shí)體瘤等方面，其優(yōu)勢(shì)及有效性日益顯現(xiàn)，帶來(lái)了新的希望。 但不可否認(rèn)的是，其存在的擴(kuò)增困難、脫靶效應(yīng)、細(xì)胞因子釋放綜合征等問(wèn)題，阻礙著CAR-T 免疫療法的進(jìn)一步發(fā)展。 國(guó)內(nèi)外對(duì)于CAR-T免疫療法的研究越來(lái)越多， 相信在不久的將來(lái)，CAR-T 免疫療法將發(fā)展得更加成熟，包括艾滋病在內(nèi)的越來(lái)越多的疾病能夠從中獲益。

利益沖突