王淑娟 高翠娟 劉晶晶

（臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000）

0 引言

植物病害不僅會(huì)影響農(nóng)作物的產(chǎn)量，降低農(nóng)作物的品質(zhì)，還不利于農(nóng)產(chǎn)品的貯藏、加工和運(yùn)輸，給農(nóng)民帶來(lái)巨大損失，嚴(yán)重威脅我國(guó)糧食安全［1］。雖然目前應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥是防治植物病害的一種有效方法，但長(zhǎng)期、大量使用化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)影響植物生長(zhǎng)，還會(huì)在使用過(guò)程中對(duì)環(huán)境造成污染。隨著生活水平的提高，人們?cè)絹?lái)越重視食品安全和環(huán)境保護(hù)，對(duì)綠色食品要求越來(lái)越高，需求量越來(lái)越大。而相對(duì)于化學(xué)農(nóng)藥，農(nóng)用抗生素具有低毒、高效、無(wú)污染、選擇性強(qiáng)和安全性高等優(yōu)勢(shì)，顯然更符合未來(lái)植物病害防治的藥物應(yīng)用要求［2-3］。此外，抗生素在藥品的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用方面同樣具有廣闊的前景。人類(lèi)發(fā)展至今從未擺脫過(guò)疾病的困擾，且近年來(lái)隨著環(huán)境的惡化和藥品的濫用，部分致病菌的耐藥性日益增強(qiáng)，新型感染性疾病不斷產(chǎn)生與傳播，人類(lèi)面臨的疾病威脅越來(lái)越多，因此，加快新型高效抗生素的開(kāi)發(fā)十分重要［4］。

土壤中含有豐富的微生物資源。相關(guān)研究表明，每克土壤含微生物106～109個(gè)，其中細(xì)菌數(shù)量最多，放線(xiàn)菌的數(shù)量?jī)H次于細(xì)菌［5］。土壤中部分微生物能產(chǎn)生抗生素、抗真菌劑和免疫抑制劑等多種有用的次生代謝物，如放線(xiàn)菌群和少部分絲狀真菌［6］。放線(xiàn)菌是介于細(xì)菌與絲狀真菌之間而又接近于細(xì)菌的一類(lèi)絲狀原核生物，因其能產(chǎn)生大量抗生素的特性，近年來(lái)在微生物及抗菌領(lǐng)域廣受關(guān)注。放線(xiàn)菌種類(lèi)很多，常見(jiàn)的主要有兩類(lèi)：一類(lèi)是其結(jié)構(gòu)組成中沒(méi)有大量菌絲體，如諾卡氏放線(xiàn)菌；另一類(lèi)是由大量菌絲體組成的鏈霉菌屬［7］。因?yàn)殒溍咕谌粘Ｉ钪休^為常見(jiàn)，其數(shù)量占已發(fā)現(xiàn)菌種的25%以上，所以也被稱(chēng)為常見(jiàn)放線(xiàn)菌。雖然當(dāng)前被利用的抗生素大多是由放線(xiàn)菌產(chǎn)生的，但被分離出來(lái)的放線(xiàn)菌卻很少，僅有0.1%～0.5%，還有很多抗生素產(chǎn)生菌未被發(fā)現(xiàn)或分離出來(lái)［8-11］。

此次研究從校園土壤中分離抗生素產(chǎn)生菌，對(duì)分離出的抗生素產(chǎn)生菌進(jìn)行菌種鑒定，并通過(guò)抑菌試驗(yàn)分析從土壤中分離出的抗生素產(chǎn)生菌對(duì)細(xì)菌和真菌的抑菌作用，以期進(jìn)一步探索抗生素產(chǎn)生菌的抑菌作用，為抗生素產(chǎn)生菌的研究提供更多的理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤取自山東省臨沂市臨沂大學(xué)校園內(nèi)。

1.2 指示菌

指示菌為研究團(tuán)隊(duì)所在的膜蛋白與藥物工程實(shí)驗(yàn)室保存的副溶血球菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、沙門(mén)氏菌、釀酒酵母、糞鏈球菌和蠟樣芽孢桿菌。

1.3 培養(yǎng)基

高氏1號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.00 g/L、硝酸鉀1.00 g/L、氯化鈉0.50 g/L、磷酸氫二鉀0.50 g/L、硫酸鎂0.50 g/L、硫酸亞鐵0.01 g/L、瓊脂15.00 g/L，pH值7.1～7.5。LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 g/L、肉提取物3.00 g/L、乳糖5.00 g/L、溴麝香草酚藍(lán)0.024 g/L，pH值為6.8～7.2。YPD培養(yǎng)基：酵母膏10.00 g/L、葡萄糖20.00 g/L、蛋白胨20.00 g/L、瓊脂15.00 g/L。

1.4 抗生素產(chǎn)生菌的分離純化

1.4.1 土壤取樣。采用五點(diǎn)交叉取樣法在營(yíng)養(yǎng)豐富的土壤中取樣。去除表層約2 cm厚的土壤，然后挖取深度在2～10 cm處的土壤，除去雜物（如礫石、殘根等），將土樣裝入燒杯中。土樣取回后立即進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.2 制備懸液及梯度稀釋。用電子天平稱(chēng)取1.00 g土壤樣品，倒入錐形瓶中，加入99 mL無(wú)菌水，輕輕搖晃錐形瓶10～20 min，使菌體分布均勻，將錐形瓶標(biāo)記為10-2g/mL質(zhì)量濃度的菌懸液，靜置0.5 min。再準(zhǔn)備4支無(wú)菌試管，并在試管上貼上標(biāo)簽紙，對(duì)其編號(hào)，標(biāo)簽的編號(hào)依次為10-3、10-4、10-5、10-6g/mL。在標(biāo)簽為10-3g/mL的試管中，加入4.5 mL無(wú)菌水，再加入0.5 mL濃度為10-2g/mL的土壤菌懸液，并用吹吸管吹吸三四次，使菌懸液充分混勻，即得到質(zhì)量濃度為10-3g/mL的土壤稀釋液。10-4、10-5、10-6g/mL質(zhì)量濃度的土壤稀釋液也按此方法配制。需要注意的是，操作過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格，防止受到雜菌的污染。

1.4.3 稀釋倒平板法分離土壤中目的菌株。分別 取 10-3、10-4、10-5g/mL菌 懸 液1 mL注 入 平 板培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)梯度兩個(gè)平板。取出已配制好的高氏1號(hào)培養(yǎng)基，在微波爐中加熱使其融化，待其溫度冷卻至45～50 ℃后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，微微晃動(dòng)，使菌落分散均勻；待其凝固后，將平板倒扣在恒溫箱中，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀(guān)察菌落產(chǎn)生情況，并做好記錄。

1.4.4 目的菌株菌落的純化。挑取培養(yǎng)皿上質(zhì)地緊密、表面呈絨狀的菌落或干燥、褶皺、較小的單菌落，接種于高氏1號(hào)培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化，在培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃培養(yǎng)7 d，觀(guān)察菌落表面的形態(tài)特征。

1.5 抗菌譜測(cè)定

將配制好的LB固體培養(yǎng)基在微波爐中進(jìn)行加熱，待其冷卻至室溫后倒入培養(yǎng)皿內(nèi)。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，用涂布棒將指示菌涂布在培養(yǎng)基上。挖取適量已純化的目的菌株置于培養(yǎng)基分區(qū)的中央，培養(yǎng)1 d后，觀(guān)察抑菌圈形成情況。

1.6 菌株16S rDNA和18S rDNA序列測(cè)定和分析

用細(xì)菌引物和真菌引物分別對(duì)7種菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行序列分析。

1.6.1 基因組DNA的提取。采用基因組DNA抽提試劑盒（Ezup柱式）分別提取目的菌株基因組。

1.6.2 PCR擴(kuò)增。菌種鑒定所用引物如表1所示。PCR反應(yīng)體系如表2所示。PCR反應(yīng)程序如表3所示，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。

表1 菌種鑒定所用引物及其序列

表2 PCR反應(yīng)體系

表3 PCR反應(yīng)程序

1.6.3 序列測(cè)定和分析。將擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒（SanPrep柱式）進(jìn)行純化，純化后的目的片段立即送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將得到的序列用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST程序進(jìn)行序列比較分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 土壤中抗生素產(chǎn)生菌菌株的分離純化

挑選從土壤中篩選出的單菌落，以蠟樣芽孢桿菌或大腸桿菌為指示菌進(jìn)行初篩，共篩選出25株抑菌效果明顯的菌株。通過(guò)分離純化和分析菌絲形態(tài)，發(fā)現(xiàn)25株菌株屬于7種不同類(lèi)型菌種，分別編號(hào)為S1～S7（見(jiàn)圖1）。

圖1 土壤中篩選出的7種抗生素產(chǎn)生菌

2.2 16S rDNA與18S rDNA的擴(kuò)增與菌種鑒定

提取7種菌株的基因組DNA，分別使用16S rDNA、18S rDNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR結(jié)果如圖2所示，菌株S1和S2為真菌，S3～S7為細(xì)菌。

圖2 菌株S1～S7的16S rDNA、18S rDNA擴(kuò)增結(jié)果

將純化后的目的片段進(jìn)行測(cè)序，得到的DNA序列用BLAST程序進(jìn)行比較分析，結(jié)果如表4所示，7種菌株的形態(tài)特征與相關(guān)文獻(xiàn)描述相符。

表4 7種菌株的鑒定結(jié)果

2.3 抗生素產(chǎn)生菌抑菌性分析

為檢測(cè)7種菌株的抑菌效果，以實(shí)驗(yàn)室保存的8種菌株作為指示菌進(jìn)行抑菌活性分析，結(jié)果如表5所示。

表5 7種菌株抑菌活性測(cè)定結(jié)果

由表5可知，S1、S4、S5、S6、S7菌株對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)有較強(qiáng)抑制作用；蠟樣芽孢桿菌可被除S2以外的其余菌株抑制；S2、S6菌株對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)有抑制作用；S3、S4、S6、S7菌株對(duì)糞鏈球菌生長(zhǎng)有抑制作用；S4、S7對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)有抑制作用；菌株S1～S7對(duì)綠膿桿菌、沙門(mén)氏菌和副溶血球菌的生長(zhǎng)均沒(méi)有明顯的抑制作用。

3 結(jié)論與討論

土壤中的微生物既存在互惠互利關(guān)系，也有敵對(duì)關(guān)系。土壤中能夠產(chǎn)生抗生素的抗性微生物，不僅可抑制病原微生物的生長(zhǎng)繁殖，還能防止和減少病原微生物對(duì)農(nóng)作物造成的侵害。通過(guò)研究篩選出了7種能產(chǎn)生不同抗生素的菌株，為下一步研究抗生素產(chǎn)生菌的生產(chǎn)性能和新藥劑的開(kāi)發(fā)創(chuàng)造了條件。此外，目前關(guān)于部分菌株如產(chǎn)紅青霉、山丘鏈霉菌、墨西哥鏈霉菌和華麗黃鏈霉菌的報(bào)道還較少。研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)紅青霉、山丘鏈霉菌、墨西哥鏈霉菌和華麗黃鏈霉菌能抑制多種細(xì)菌或真菌生長(zhǎng)，這為抗生素產(chǎn)生菌的研究提供了新的方向。