王巧祎,趙希芹,郭雨辰,張璐,李曉欣,王云

(青島大學(xué),山東 青島 266071 1 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系； 2 附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科； 3 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2018級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè))

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性生命的惡性腫瘤之一，2020年研究數(shù)據(jù)顯示，宮頸癌的發(fā)病率和病死率在全球女性惡性腫瘤中位居第4位[1]。宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)是反映宮頸癌持續(xù)發(fā)展的重要指標(biāo)，而持續(xù)人乳頭瘤病毒(HPV)感染是導(dǎo)致CIN和宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[2]。HPV有200余種基因型，不同地區(qū)及不同宮頸疾病人群中HPV的感染率和基因型分布均存在差異。以往的個(gè)例報(bào)道和Meta分析數(shù)據(jù)均表明，在我國(guó)HPV 52型(HPV52)是與宮頸病變發(fā)生有關(guān)的一種重要的HPV基因型[3-6]。HPV編碼基因存在多態(tài)性，E6和E7是HPV致癌的關(guān)鍵蛋白，其多態(tài)性與宮頸病變發(fā)生的相關(guān)性備受關(guān)注。但目前對(duì)HPV52E6和E7基因多態(tài)性的研究相對(duì)較少，其與宮頸病變的關(guān)系尚無(wú)明確結(jié)論[7-12]。本研究分析比較青島地區(qū)正常和不同級(jí)別CIN樣本中HPV52E6和E7基因多態(tài)性，為豐富HPV52分子流行病學(xué)資料和明確HPV52基因變異在宮頸病變中的作用提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年6月—2020年12月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室行HPV基因型檢測(cè)并進(jìn)行陰道鏡下宮頸活檢的門(mén)診、住院病人及體檢女性為研究對(duì)象。首先采集宮頸脫落細(xì)胞樣本，采用HPV分型檢測(cè)試劑盒(亞能生物技術(shù)深圳有限公司)進(jìn)行HPV檢測(cè)，樣本采集和檢測(cè)步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求操作，并留取HPV52單獨(dú)陽(yáng)性標(biāo)本-20 ℃凍存。然后利用病人門(mén)診號(hào)(唯一號(hào))通過(guò)醫(yī)院醫(yī)渡云科研平臺(tái)檢索留取樣本病例的病理檢測(cè)結(jié)果，選取其中首次進(jìn)行宮頸活檢的病例，并進(jìn)一步檢索或咨詢其年齡、戶籍和民族等相關(guān)信息。最后納入177例樣本進(jìn)行HPV52E6和E7基因序列檢測(cè)和分析，其中病理結(jié)果顯示正常者68例，CIN1者57例，CIN2/3者52例；病人年齡21～77歲，平均(43.02±11.40)歲；病人均為青島地區(qū)戶籍，漢族，有性生活史，無(wú)子宮切除、宮頸手術(shù)及HPV感染治療史。177例樣本經(jīng)序列檢測(cè)后共138例樣本成功獲得E6和E7基因序列，其中病理結(jié)果正常者47例，CIN1者46例，CIN2/3者45例。正常組年齡為22～77歲，平均(44.45±12.10)歲；CIN1組年齡21～67歲，平均(43.44±12.36)歲；CIN2/3組年齡21～65歲，平均(40.91±10.53)歲，3組之間年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.100，P=0.336)。

1.2 E6和E7基因序列檢測(cè)

采用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在線設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增區(qū)域包括E6編碼區(qū)(nt 102～548)和E7編碼區(qū)(nt 553～852)。引物名稱、序列、擴(kuò)增片段大小及其在基因組中的位置見(jiàn)表1。先以HPV52-F1和HPV52-R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，出現(xiàn)擴(kuò)增條帶的直接測(cè)序；如果沒(méi)有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，則以該擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為HPV52-F2和HPV52-R2，出現(xiàn)擴(kuò)增條帶者進(jìn)行測(cè)序。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系內(nèi)含有：Taq Green PCR Master Mix(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)15.0 μL，上下游引物各1.2 μL，DNA模板2.0 μL，用水補(bǔ)足至30.0 μL。循環(huán)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取3 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增條帶。每次PCR反應(yīng)均設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為HPV陰性的宮頸癌細(xì)胞系C-33A提取的DNA，陽(yáng)性對(duì)照為已知HPV52陽(yáng)性標(biāo)本DNA。

取上述PCR產(chǎn)物25 μL送北京華大基因有限公司測(cè)序，測(cè)序所用引物為HPV52-F2、HPV52-R2和HPV52-R3，采用末端終止法進(jìn)行雙向測(cè)序。以HPV52標(biāo)準(zhǔn)株X74481(GenBank收錄號(hào)X74481)序列作參比，采用Lasergene軟件(version 7.0)進(jìn)行序列剪接和對(duì)排。

表1 HPV52 E6和E7基因變異檢測(cè)所用PCR和測(cè)序引物

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

從GenBank中獲取HPV52變異型或亞型A2、B1、B2、C1、C2和D代表株E6、E7序列，這些代表株GenBank收錄號(hào)分別為HQ537739、HQ537740、HQ537743、HQ537744、HQ537746和HQ537748[7]，標(biāo)準(zhǔn)株X74481為A1變異亞型。用MEGA 7.0軟件，將本研究所獲得的E6和E7序列及上述代表株序列，用Clastal W方法進(jìn)行比對(duì)和同源性分析，臨接法(Neighbor-joining)繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[13]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SAS 9.4統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用Fisher確切概率法比較不同組間HPV52E6和E7基因變異型的分布。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 E6基因序列多態(tài)性

與標(biāo)準(zhǔn)株比較，138例標(biāo)本中除2例在E6基因編碼區(qū)未出現(xiàn)變異，其余標(biāo)本均出現(xiàn)單核苷酸突變，未見(jiàn)插入或缺失。共出現(xiàn)6處錯(cuò)義突變和10處同義突變。錯(cuò)義突變中，K93R見(jiàn)于134例樣本(4例樣本核苷酸a378c和a379g突變導(dǎo)致氨基酸K93R突變，130例a379g突變導(dǎo)致K93R突變)，其中1例樣本還出現(xiàn)K93G突變(核苷酸a378g和a379g突變)；N122K(c467a)突變見(jiàn)于2例樣本；Q38H(a215t)、F45R(t235a)和L67V(c300g)同時(shí)出現(xiàn)于1例樣本；W132R(t495c)見(jiàn)于1例樣本。同義突變中，g350t見(jiàn)于133例樣本，g356a見(jiàn)于15例樣本，t191c和g356a突變各見(jiàn)于2例樣本，a180c、a278t、t309c、g371a、a422g和a530g各見(jiàn)于1例樣本。

本文138例樣本共出現(xiàn)15條不同序列，將這15條不同基因序列與GenBank中A1、A2、B1、B2、C1、C2和D代表序列共同繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1)，結(jié)果顯示，2例樣本序列屬于A1變異亞型，與代表株X74481-A1序列相同；3例樣本序列屬于A2變異亞型，與代表株HQ537739-A2比較，均出現(xiàn)錯(cuò)義突變K93R，但是未出現(xiàn)同義突變a251g；132例樣本序列屬于B變異型，與代表株HQ537740-B1和HQ537743-B2的序列相同，均同時(shí)出現(xiàn)錯(cuò)義突變K93R(1例為K93G)和同義突變g350t；1例樣本序列屬于C2變異亞型，與代表株HQ537746-C2比較，出現(xiàn)同義突變a530g，但在氨基酸83僅出現(xiàn)核苷酸g350t突變，而代表株同時(shí)出現(xiàn)核苷酸g350t和c348g突變導(dǎo)致氨基酸L83V突變。

正常、CIN1和CIN2/3組E6基因各變異型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.741)，3組均以B變異型為主。見(jiàn)表2。

2.2 E7基因序列多態(tài)性

與標(biāo)準(zhǔn)株比較，138例標(biāo)本中除2例標(biāo)本在E7基因編碼區(qū)未出現(xiàn)變異，其余標(biāo)本均出現(xiàn)單核苷酸突變，未見(jiàn)插入或缺失。共出現(xiàn)12處錯(cuò)義突變和7處同義突變。在錯(cuò)義突變中，M1T(t554c)和Y11C(a584g)同時(shí)出現(xiàn)于1例樣本；T37I(c662t)、S52D(a706g、g707a)、Y59D(a728g)、H61Y(c733t)、D64N(g742a)和L99R(t848g)同時(shí)見(jiàn)于1例樣本，其中D64N還見(jiàn)于另外2例樣本；M84I(g804t)見(jiàn)于1例樣本。在同義突變中，a801g出現(xiàn)于136例樣本，c751t出現(xiàn)于133例樣本，t583g、a681g、t765c、a793t和c837g各見(jiàn)于1例樣本。

本文138例樣本共出現(xiàn)12條不同序列，將這12條不同基因序列與GenBank中A1、A2、B1、B2、C1、C2和D代表序列共同繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖2)，結(jié)果顯示，2例樣本序列與代表株X74481-A1和HQ537739-A2序列均相同，在系統(tǒng)樹(shù)中屬于A變異型，這2條序列與E6基因?qū)儆贏1變異亞型的2條序列來(lái)源于相同樣本；135例樣本序列與代表株HQ537740-B1和HQ537743-B2比較，均同時(shí)出現(xiàn)同義突變c751t和a801g，屬于B變異型；1例樣本序列屬于C變異型，其與E6基因?qū)儆贑變異型的序列來(lái)源于同一樣本，該序列與HQ537746-C2的序列相同，出現(xiàn)6處錯(cuò)義突變(T37I、S52D、Y59D、H61Y、D64N和L99R)和2處同義突變(t583g和a801g)。除3例在E6區(qū)屬于A2變異亞型的序列在E7區(qū)屬于B變異型外，其余序列在E6和E7區(qū)的變異型分類一致。

正常、CIN1和CIN2/3組中E7基因各變異型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.472)，3組均以B變異型為主。見(jiàn)表3。

圖中X74481-A1、HQ537739-A2、HQ537740-B1、HQ537743-B2、HQ537744-C1、HQ537746-C2和HQ537748-D為代表株，標(biāo)本名稱以阿拉伯?dāng)?shù)字表示，標(biāo)本名稱后括號(hào)中數(shù)字表示與該標(biāo)本序列相同的標(biāo)本數(shù)量。

表2 HPV52 E6變異型在正常、CIN1和CIN2/3組中的分布(例(χ%))

圖中X74481-A1、HQ537739-A2、HQ537740-B1、HQ537743-B2、HQ537744-C1、HQ537746-C2和HQ537748-D為代表株，標(biāo)本名稱以阿拉伯?dāng)?shù)字表示，標(biāo)本名稱后括號(hào)中數(shù)字表示與該標(biāo)本序列相同的標(biāo)本數(shù)量。

表3 HPV52 E7變異型在正常、CIN1和CIN2/3組中的分布(例(χ%))

3 討 論

HPV52編碼基因具有多態(tài)性，根據(jù)其編碼的E6、E7、主要衣殼蛋白L1和長(zhǎng)控制區(qū)(LCR)基因多態(tài)性，將HPV52分為A、B、C、D等4種基因變異型，進(jìn)一步分為A1、A2、B1、B2、C1、C2和D等7種變異亞型[7]。以往研究顯示，HPV52變異型的分布具有地域差異，亞洲以B變異型為主，歐洲、美洲和非洲均以A變異型為主，C和D變異型在各地域檢出率均較低[8-9,14-21]。本研究首次對(duì)來(lái)自青島地區(qū)正常和CIN樣本中HPV52E6和E7基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示本地區(qū)樣本E6和E7基因均以B變異型為主，分別占95.7%和97.8%。這與日本、我國(guó)四川、上海和北京等地的檢測(cè)結(jié)果相似，2篇來(lái)自日本的研究中B變異型檢出率分別為96.2%(50/52)和92.3%(36/39)，四川為97.6%(41/42)，上海為96.3%(52/54)，北京為90.0%(45/50)[9,14-17]。但本研究樣本中HPV52E6和E7變異型的分布與臺(tái)灣和湖北荊州的檢測(cè)數(shù)據(jù)存在明顯差異，臺(tái)灣280例樣本中A、B和C變異型的檢出率分別為0.7%、88.2%和11.1%，湖北荊州168例樣本中B、C和D變異型的檢出率分別為85%、5%和10%[18-19]，這兩個(gè)地區(qū)B變異型的檢出率相對(duì)較低，C或者D變異型的檢出率相對(duì)較高。上述各地區(qū)HPV52 B變異型的檢出率均高于越南(73.7%，28/38)和菲律賓(62.5%，20/32)[9]?？梢?jiàn)亞洲不同地域或國(guó)內(nèi)不同地域HPV52E6和E7基因變異型的分布存在差異，對(duì)不同地域樣本的檢測(cè)可為全面了解HPV52的分子流行病學(xué)特征提供有價(jià)值的信息。

HPV基因變異與宮頸病變的關(guān)系是HPV致癌機(jī)制研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。有研究比較同一地區(qū)不同程度宮頸病變或細(xì)胞學(xué)異常人群與正常人群中HPV52E6和(或)E7基因變異情況，結(jié)果顯示不同宮頸病變?nèi)巳杭罢Ｈ巳褐g基因變異型或基因突變分布無(wú)明顯差異，從而認(rèn)為HPV52E6和E7基因變異與宮頸病變發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)或病變嚴(yán)重程度不相關(guān)[9,22-23]。本研究結(jié)果顯示，HPV52E6和E7基因變異型分布在正常、CIN1和CIN2/3組中差異無(wú)顯著性，且多數(shù)樣本序列相同，提示HPV52E6和E7基因多態(tài)性與CIN發(fā)生發(fā)展無(wú)明顯相關(guān)性。但也有研究結(jié)果顯示，HPV52E6和E7基因某變異型或特定突變?cè)黾恿薈IN或?qū)m頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)，如韓國(guó)的一項(xiàng)研究中，HPV52E6基因以B變異型和C變異型為主，而且B變異型E6基因的K93R(A379G)突變與宮頸惡性病變相關(guān)[10]；加拿大的一項(xiàng)研究亦表明，LCR的t7744c和E6的K93R突變?cè)黾恿薈IN2/3(與CIN1+正常比較)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[24]；臺(tái)灣一項(xiàng)研究顯示，E6和E7的C變異型增加了高級(jí)別鱗狀細(xì)胞內(nèi)病變及宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[18]；美國(guó)最新的一項(xiàng)病例對(duì)照研究采用全基因組測(cè)序檢測(cè)50例CIN3和39例正常女性宮頸樣本，發(fā)現(xiàn)C2變異亞型與CIN3高風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[21]；ZHANG等[8]的研究顯示，與A型比較，B型和C型增加了CIN3及宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。與HPV52E6和E7變異增加患病風(fēng)險(xiǎn)不同，江蘇地區(qū)的一項(xiàng)研究和廣州地區(qū)的一項(xiàng)研究分別顯示，宮頸病變(CIN1/2/3和宮頸癌合并)樣本HPV52E6基因的突變頻率顯著低于正常樣本，從而認(rèn)為E6基因突變可能阻礙宮頸病變和宮頸癌的發(fā)生發(fā)展或降低HPV的致癌作用[11-12]。由此可見(jiàn)，HPV52E6和E7基因多態(tài)性與宮頸病變的相關(guān)性目前尚不能得出明確結(jié)論。導(dǎo)致不同研究結(jié)論不一致的原因，可能與研究樣本例數(shù)偏少、納入研究病種不一致、疾病分組不一致和地域局限等有關(guān)。

總之，本研究表明，來(lái)自青島地區(qū)宮頸細(xì)胞樣本中HPV52E6和E7基因主要為B變異型，且E6和E7基因多態(tài)性可能與CIN發(fā)生發(fā)展無(wú)明顯相關(guān)性。本研究結(jié)果為了解該地區(qū)HPV52分子流行病學(xué)特征以及進(jìn)一步明確HPV52基因變異與宮頸病變的關(guān)系提供了數(shù)據(jù)支持。