楊培 梁淑雅 王苗苗 韓莎莎 李媛媛 王君

[摘要] 目的 探討皮膚扁平苔蘚（CLP）中microRNA-27b（miR-27b）與相關(guān)蛋白的表達水平及意義。

方法 采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）方法，檢測40例CLP病人（CLP組）皮損組織及40例健康人（Con組）正常皮膚組織中miR-27b的表達水平。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法，檢測兩組皮膚組織中白細胞介素1β（IL-1β）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）的表達水平。采用Spearman相關(guān)分析法分析CLP組皮損組織中miR-27b、IL-1β、MMP-2表達水平之間的相關(guān)性。

結(jié)果 與Con組相比，CLP組皮損組織中miR-27b表達水平明顯下調(diào)（t=2.501，P＜0.05），IL-1β和MMP-2表達水平明顯上調(diào)（t=－2.383、－2.487，P＜0.05）。Spearman相關(guān)性分析顯示，CLP組皮損組織中miR-27b與IL-1β、MMP-2表達水平呈負相關(guān)（r=－0.361、－0.385，P＜0.05），IL-1β與MMP-2表達水平呈正相關(guān)（r=0.332，P＜0.05）。

結(jié)論 miR-27b及其相關(guān)蛋白可能參與了CLP的發(fā)病過程。

[關(guān)鍵詞] 扁平苔蘚；皮膚疾??；微RNAs；白細胞介素1β；基質(zhì)金屬蛋白酶2

[中圖分類號] R758.65

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2022）05-0694-04doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.127

[開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.r.20220713.0951.003.html;2022-07-14 08：55：59

EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF MICRORNA-27B AND RELATED PROTEINS IN CUTANEOUS LICHEN PLANUS

YANG Pei， LIANG Shuya， WANG Miaomiao， HAN Shasha， LI Yuanyuan， WANG Jun

（Department of Dermatology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the expression levels and significance of microRNA-27b （miR-27b） and related proteins in cutaneous lichen planus （CLP）.

Methods Quantitative real-time PCR was used to measure the expression level of miR-27b in the skin lesions of 40 CLP patients （CLP group） and the normal skin tissue samples of 40 healthy controls （Con group）. ELISA was used to measure the expression levels of interleukin 1β （IL-1β） and matrix metalloproteinase-2 （MMP-2） in skin tissue of the two groups. A Spearman correlation analysis was used to analyze the correlation between the expression levels of miR-27b， IL-1β， and MMP-2.

Results Compared with the Con group， the CLP group had a significant reduction in the expression level of miR-27b （t=2.501，P<0.05） and significant increases in the expression levels of IL-1β and MMP-2 in skin lesion （t=-2.383，-2.487;P<0.05）. The Spearman correlation analysis showed that in the CLP group， miR-27b was negatively correlated with IL-1β and MMP-2 （r=-0.361，-0.385;P<0.05）， and IL-1β was positively correlated with MMP-2 （r=0.332，P<0.05）.

Conclusion This study shows that miR-27b and related proteins may be involved in the pathogenesis of CLP.

[KEY WORDS] lichen planus; skin diseases; microRNAs; interleukin-1beta; matrix metalloproteinase 2

扁平苔蘚（LP）是一種皮膚和黏膜的炎癥性疾病，其患病率約為1％，女性患病率高于男性。盡管LP的發(fā)病機制尚不完全清楚，但是T細胞介導(dǎo)的免疫和炎性反應(yīng)在其發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用。microRNA（miRNA）是小的非編碼RNA，可通過調(diào)控相關(guān)基因的表達來調(diào)節(jié)細胞活性，在自身免疫以及細胞增殖、分化和凋亡中起關(guān)鍵作用，而miRNA失調(diào)可能與自身免疫和炎癥性疾病的發(fā)病機制有關(guān)。miR-27b是miRNA家族中的一員，有研究顯示，在口腔扁平苔蘚（OLP）中其表達水平降低。經(jīng)雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C，白細胞介素1β（IL-1β）是miR-27b的潛在靶蛋白。已有研究表明，皮膚扁平苔蘚（CLP）組織中IL-1β的表達上調(diào)。然而，miR-27b靶向IL-1β是否在CLP的發(fā)病機制中發(fā)揮作用還未被證實。LI等通過Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，miR-27b過表達明顯抑制血小板衍生生長因子BB誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）表達升高。然而，miR-27b及其相關(guān)蛋白MMP-2在CLP中的表達關(guān)系尚未見報道。本研究旨在探討miR-27b與其靶蛋白IL-1β以及相關(guān)蛋白MMP-2在CLP中的表達水平及意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象

2019年5月—2020年5月，選取于青島大學附屬醫(yī)院皮膚科就診的CLP病人40例（CLP組），并采集皮損組織標本。CLP組納入標準：臨床表現(xiàn)典型并經(jīng)組織病理學確診（典型病例見圖1），無系統(tǒng)性疾病，3個月內(nèi)未使用免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素類藥物。同期選取在青島大學附屬醫(yī)院美容外科手術(shù)的40例健康人（Con組）作為對照，收集手術(shù)切取的正常皮膚組織標本。CLP組男22例，女18例，年齡25～64歲；Con組男19例，女21例，年齡19～61歲。兩組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，受試者自愿簽署知情同意書。

1.2 實時熒光定量PCR檢測miR-27b的表達

采用Trizol法（試劑購自日本Takara公司）提取兩組皮膚組織總RNA，并參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）操作步驟將定量后的RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，將配制好的20 μL反應(yīng)體系（含有2×SYBR Green PCR Master Mix 10.0 μL，cDNA 1.0 μL、上下游引物各0.4 μL、HO 8.2 μL）按照設(shè)定的反應(yīng)條件（94 ℃、5 min，94 ℃、15 s，58 ℃、15 s，72 ℃、30 s，共循環(huán)35次）上PCR儀進行擴增。miR-27b和U6引物由上海生工公司合成，其序列見表1。采用2法計算目的基因的相對表達水平。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測IL-1β和MMP-2的表達

根據(jù)人IL-1β和MMP-2酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（日本Takara公司）說明書操作步驟檢測兩組皮膚組織中IL-1β以及MMP-2的含量，于450 nm波長處依序測量各孔的光密度（OD）值。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s形式表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。miR-27b、IL-1β、MMP-2表達水平之間的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組miR-27b、IL-1β、MMP-2表達水平比較

CLP組miR-27b的表達水平明顯低于Con組，IL-1β和MMP-2的表達水平明顯高于Con組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=-2.487～2.501，P＜0.05）。見表2。

2.2 miR-27b、IL-1β、MMP-2表達水平的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析顯示，CLP組皮損組織中miR-27b與IL-1β、MMP-2表達水平呈負相關(guān)（r=－0.361、－0.385，P＜0.05），IL-1β與MMP-2表達水平呈正相關(guān)（r=0.332，P＜0.05）。見圖2。

3 討 論

LP是一種慢性自身免疫疾病，T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對基底層角質(zhì)形成細胞造成破壞在LP發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。miR-27b為角質(zhì)形成細胞特異性miRNA，參與了角質(zhì)形成細胞的分化。WANG等研究證實，miR-27b改善了角質(zhì)形成細胞的遷移，而miR-27b下調(diào)則增加了角質(zhì)形成細胞的凋亡。有研究表明，miR-27b作為OLP的生物標志物具有很高的敏感性（高達100%），其在OLP黏膜組織、血清和唾液中的表達均顯著下調(diào)。ZHANG等的研究證實，OLP的臨床嚴重程度與miR-27b下調(diào)水平有關(guān)。CHEN等的研究發(fā)現(xiàn)，miR-27b通過靶向Polo樣激酶2（PLK2）促進OLP角質(zhì)形成細胞增殖。另有研究證實，OLP黏膜組織中miR-27b-3p通過環(huán)蛋白D/Bcl2信號通路調(diào)控角質(zhì)形成細胞凋亡。ZHANG等認為，OLP上皮角質(zhì)形成細胞中miR-27b的下調(diào)可能是活化細胞毒性T細胞特異性炎癥反應(yīng)的一部分，并且可能觸發(fā)上皮細胞凋亡。到目前為止，還未見針對miR-27b在CLP中表達的研究。

研究表明，LP的組織病理學特征之一是基底膜的破壞。基底膜依賴性酶的蛋白水解活性升高可造成基底膜損傷，進而觸發(fā)角質(zhì)形成細胞的凋亡?；|(zhì)金屬蛋白酶是鋅和鈣依賴性的蛋白水解酶，MMP-2是所有基質(zhì)金屬蛋白酶中分布最廣泛的一種。MMP-2或Ⅳ型膠原酶可以破壞基底膜的主要糖蛋白成分Ⅳ型膠原蛋白，并參與血管和炎癥過程的調(diào)節(jié)。在對卵巢癌細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞（ARPE-19）的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-27b可以下調(diào)MMP-2的表達。WANG等研究證實，OLP中MMP-2的表達顯著上調(diào)，miR-125b可通過PI3K/Akt/mTOR途徑靶向MMP-2抑制角質(zhì)形成細胞的增殖并促進角質(zhì)形成細胞凋亡。關(guān)于CLP中MMP-2表達的研究結(jié)果仍有差異。GIANNELLI等首次研究了CLP和MMP-2的關(guān)系，結(jié)果顯示，在CLP急性期MMP-2的表達和活性增加，并暗示MMP-2和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子2（TIMP-2）之間的失衡可能在基底膜破壞中發(fā)揮作用。但GUNDUZ等研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2在CLP皮損的表皮基底層中表達弱，在基底層破壞顯著區(qū)域甚至不表達，認為這一結(jié)果可以用表皮基底層的破壞來解釋，得到不同的結(jié)果可能因疾病所處階段不同所致。

目前生物信息學研究證明，IL-1β是miR-27b的靶蛋白之一。人角質(zhì)形成細胞是促炎細胞因子IL-1β的主要來源。IL-1β作為角質(zhì)形成細胞激活的啟動子，可激活各種細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑。此外，IL-1β已被證實有促進膠原酶合成、抑制膠原分泌的作用。在一項關(guān)于成纖維樣滑膜細胞凋亡的研究中，作者發(fā)現(xiàn)miR-27b表達增加可抑制IL-1β表達和核因子κB（NF-κB）信號傳導(dǎo)。另有研究表明，IL-1β以劑量和時間依賴性方式提高前交叉韌帶成纖維細胞中MMP-2蛋白表達和酶活性。本研究檢測了miR-27b、IL-1β和MMP-2在CLP中的表達水平，結(jié)果顯示，與Con組相比，CLP組miR-27b的表達水平顯著下降，IL-1β和MMP-2的表達水平顯著上調(diào)。相關(guān)性分析顯示，CLP組病人miR-27b與IL-1β和MMP-2的表達水平均呈顯著負相關(guān)，IL-1β與MMP-2的表達水平呈顯著正相關(guān)。提示miR-27b的異常表達可能導(dǎo)致IL-1β、MMP-2的表達上調(diào)，破壞基底膜，觸發(fā)角質(zhì)形成細胞的凋亡，參與CLP的發(fā)病過程。

綜上所述，miR-27b可能通過負調(diào)控相關(guān)蛋白的表達參與CLP的發(fā)病過程。這為進一步揭示LP的發(fā)病機制提供了有益參考，為未來該病治療靶點的篩選提供了一定的理論依據(jù)。

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（本文編輯 馬偉平）