王恩玲，劉 寧，張飛可

(1.河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.帝斯曼維生素(上海)有限公司，上海 201400；3.洛陽鑫泰農(nóng)牧科技股份有限公司，河南 洛陽471400)

雞白痢沙門菌(Salmonellapullorum)是家禽生產(chǎn)中一種常見的致病性革蘭氏陰性菌，可感染各品種和各生長階段的家禽，尤其是雛禽。雞白痢沙門菌感染在世界各主要養(yǎng)禽國家均有發(fā)生，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為家禽精神萎靡并出現(xiàn)急性、傳染性白色腹瀉。此外，雞白痢沙門菌感染可損害家禽腸道健康，引起免疫應(yīng)激和氧化應(yīng)激，進而降低家禽的生產(chǎn)性能和存活率[1-2]，嚴重危害著養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。使用抗生素通常是防控雞白痢沙門菌感染最常見、最有效的一種方法。但由于耐藥菌的增加和藥物殘留等諸多問題，抗生素被逐步禁止在飼料中使用，目前我國農(nóng)業(yè)部頒布的飼料“禁抗令”已正式生效。因此，尋找能夠防控雞白痢沙門菌感染的抗生素替代品具有重要意義。

四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMP)又名川芎嗪，它主要是從傘形科植物中川芎的根莖中提取出的一種活性成分，屬于生物堿單體。體外研究發(fā)現(xiàn)TMP對致病性大腸桿菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌等致病菌都有不同程度的抑制作用[3]。在鼠上的研究發(fā)現(xiàn)TMP具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗組織纖維化等功能[4]。在獺兔上的研究發(fā)現(xiàn)添加TMP可緩解李斯特菌感染所導(dǎo)致的免疫應(yīng)激[5]。在肉雞上的研究表明，TMP可改善脛骨血管生成和肝臟氧化還原狀態(tài)，進而緩解其脛骨發(fā)育不良[6-7]。此外，肉雞日糧中添加TMP可緩解艾美耳球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌感染導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，并可抑制腸道中大腸桿菌、沙門菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等有害菌增殖，進而緩解肉雞的腸道損傷和生產(chǎn)性能下降[8]。添加TMP還可抑制肉雞腸道中鼠傷寒沙門菌增殖，緩解鼠傷寒沙門菌感染導(dǎo)致的腸道損傷和生產(chǎn)性能下降[9]。然而目前并不清楚TMP是否可以緩解雞白痢沙門菌感染對肉仔雞造成的負面影響。本試驗通過研究TMP對雞白痢沙門菌感染肉仔雞的生產(chǎn)性能、氧化還原狀態(tài)和PI3K/AKT通路的影響，探究TMP對感染雞白痢沙門菌肉雞生產(chǎn)性能的影響及氧化應(yīng)激機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 雞白痢沙門菌 (CVCC1792)菌株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 四甲基吡嗪 (TMP，純度≥99%)，購自濟南德瑞豐環(huán)保化工有限公司。

1.1.3 其他實驗材料 二胺氧化酶(DAO；EC 1.4.3.6；A088)、丙二醛(MDA；A003)、蛋白質(zhì)碳基(PCO；A087)測試盒均購自南京建城生物工程研究所；實時熒光定量(RT-PCR)儀為ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；RT-PCR試劑和引物購自寶生物工程(大連)有限公司；超低溫冰箱(海爾集團)。

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

從當(dāng)?shù)胤趸瘓鲑徺I健康狀況良好的1日齡AA肉公雛600只，飼養(yǎng)在河南科技大學(xué)研究中心的一個環(huán)境控制設(shè)施中。采集泄殖腔棉拭子，檢測有無雞白痢沙門菌感染，從中選出體重相近的陰性個體480只，隨機分為4組：對照組、感染組、抗生素組和TMP組。每組6個重復(fù)，每個重復(fù)20只雞。試驗期14 d。前5 d室溫保持在32 ℃，后逐漸降至28 ℃。在試驗前兩天給予24 h/d的光照，隨后提供18 h/d的光照。對照組、感染組、抗生素組和TMP組試雞分別飼養(yǎng)在4個構(gòu)造相同但互不相通的房間內(nèi)，三層半階梯籠養(yǎng)。對照組和感染組飼喂基礎(chǔ)飼糧，其配方見表1?？股亟M和TMP組肉雞于試驗全程分別在基礎(chǔ)飼糧中添加 40 mg/kg 鹽酸恩諾沙星和150 mg/kg的TMP。5日齡時，感染組、抗生素組和TMP組每只雞口腔灌服 1 mL(105CFU)雞白痢沙門菌培養(yǎng)液，對照組灌服等量無菌株培養(yǎng)液。雞群全程自由采食和飲水，各房間溫度、濕度和光照控制一致，符合白羽肉雞對環(huán)境的要求。

表1 基礎(chǔ)日糧組成與營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 樣品采集與檢測

1.3.1 生產(chǎn)性能和死亡數(shù) 每天記錄試驗雞采食量，并于1和14日齡以重復(fù)為單位稱量空腹體重，計算累計增重、累計采食量和料重比。每天檢查雞群健康狀態(tài)兩次，及時挑出死雞，記錄死亡雞數(shù)，并校正采食量和體增重。

1.3.2 氧化反應(yīng)產(chǎn)物測定 7日齡和14日齡時，從每個重復(fù)隨機選2只雞(12只/處理組)用于心臟采血，于3 000 g、4 ℃條件下離心15 min分離得到血清。然后將雞只屠宰，分離十二指腸，用磷酸鹽緩沖鹽將其沖洗，刮取黏膜后加入三倍體積磷酸鹽緩沖液充分勻漿，于10000 g、4 ℃條件下離心30 min，取上清液備用。用比色法測定血清和十二指腸黏膜中二胺氧化酶活性及丙二醛和蛋白質(zhì)碳基的含量。

1.3.3 PI3K/AKT表達水平測定 取肉仔雞十二指腸中段組織，用DEPC水沖洗干凈后將其儲存在-80 ℃下，用于基因表達分析。通過寡聚(dT)纖維素柱層分析法進行mRNA分離純化。以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA。參照試劑盒說明書，根據(jù)PI3K、PIK3C3、AKT1、AKT2、AKT3、GAPDH基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異引物，引物信息見表2。引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系10 μL：SYBR Green Master Mix 5 μL，上、下游引物1 μL，10×稀釋后cDNA 4 μL。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次。以無菌水和無RT-RNA樣品作為擴增對照。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量[10]。

表2 實時定量PCR引物

1.4 統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表達，使用 SPSS 24.0 軟件中 GLM 程序?qū)υ囼灁?shù)據(jù)進行單因素方差分析。方差均質(zhì)時采用Tukey's-b法進行多重比較，方差異質(zhì)時采用Tamhane's T2法進行多重比較，顯著標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 生產(chǎn)性能的比較

由表3可知，與對照組相比，雞白痢沙門菌感染顯著降低了7 d和14 d肉仔雞的累計增重和累計采食量(P<0.05)，顯著提高了料重比和死亡率(P<0.05)。與感染組相比，添加四甲基吡嗪后，顯著提高了7 d和14 d肉仔雞累計增重和累計采食量(P<0.05)，顯著降低了14 d肉仔雞的料重比和死亡率(P<0.05)。與感染組相比，添加抗生素后，顯著提高了7 d和14 d肉仔雞累計增重和累計采食量(P<0.05)，顯著降低了14 d肉仔雞的料重比和死亡率(P<0.05)。添加四甲基吡嗪與抗生素相比，累計增重、累計采食量、料重比和死亡率均差異不顯著(P>0.05)。

表3 試驗各組肉仔雞生產(chǎn)性能的比較

2.2 氧化反應(yīng)產(chǎn)物含量的比較

由表4可知，與對照組相比，雞白痢沙門菌感染顯著提高了7 d、14 d肉仔雞血清和十二指腸黏膜中的二胺氧化酶活性以及丙二醛和蛋白羰基含量(P<0.05)。與感染組相比，添加四甲基吡嗪顯著降低了7 d肉仔雞十二指腸黏膜和14 d肉仔雞血清中的二胺氧化酶活性以及丙二醛、蛋白羰基的含量(P<0.05)，顯著降低了7 d肉仔雞血清中二胺氧化酶活性和14 d肉仔雞十二指腸中二胺氧化酶活性和丙二醛含量(P<0.05)。與感染組相比，添加抗生素顯著降低了7 d、14 d肉仔雞血清和十二指腸黏膜中的二胺氧化酶活性以及丙二醛和蛋白羰基含量(P<0.05)。與抗生素組相比，TMP組7 d、14 d肉仔雞十二指腸黏膜和14 d肉仔雞血清中的二胺氧化酶活性、以及丙二醛和蛋白羰基的含量差異不顯著，但7 d肉仔雞血清中的丙二醛和蛋白羰基的含量顯著提高(P<0.05)。

表4 試驗各組肉仔雞血清和十二指腸抗氧化指標(biāo)的比較

2.3 十二指腸PI3K/AKT信號通路的比較

由表5可知，與對照組相比，雞白痢沙門菌感染顯著提高了7 d和14 d肉仔雞的PI3K、PIK3C3、AKT1和AKT3的表達水平(P<0.05)。與感染組相比，TMP組顯著降低了7 d肉仔雞PI3K、PIK3C3、AKT1的表達水平(P<0.05)和14 d肉仔雞PI3K、AKT1和AKT2的表達水平(P<0.05)。與感染組相比，抗生素組顯著降低了7 d肉仔雞PI3K、PIK3C3、AKT1的表達水平(P<0.05)和14 d肉仔雞PI3K、AKT1和AKT3的表達水平(P<0.05)。與抗生素組相比，TMP組7 d、14 d肉仔雞PI3K、PIK3C3、AKT1、AKT3和7 d肉仔雞AKT2的表達水平均差異不顯著(P>0.05)，但TMP可以顯著降低14 d肉仔雞AKT2的表達水平。

表5 試驗各組肉仔雞十二指腸PI3K/AKT信號分子表達水平的比較

3 討 論

3.1 四甲基吡嗪對雞白痢沙門氏菌感染肉仔雞生產(chǎn)性能的影響

雞白痢沙門菌感染在家禽生產(chǎn)中常有發(fā)生，尤其是對雛雞具有很高的易感性。本試驗發(fā)現(xiàn)雞白痢沙門菌感染顯著降低了肉仔雞7 d和14 d的累計增重和采食量，同時顯著提高了料重比和死亡率。前人研究同樣發(fā)現(xiàn)雞白痢沙門菌感染可導(dǎo)致肉仔雞的平均日增重和平均日采食量顯著下降，料重比和死亡率顯著增加[11-12]。使用抗生素通常是治療或緩解雞白痢沙門菌感染非常有效的一種手段，可明顯緩解生產(chǎn)性能的下降，這在本試驗的結(jié)果中也有所體現(xiàn)。但鑒于抗生素所帶來的危害，目前已禁止在飼料中添加抗生素，因此亟需尋找能夠治療雞白痢沙門菌感染的抗生素替代品。TMP具有抑菌和免疫調(diào)節(jié)等多種功效。研究表明，肉仔雞日糧中添加適量TMP對死亡率沒有影響，但可以顯著提高平均日增重、平均日采食量和飼料利用效率，并緩解艾美爾球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌等細菌感染導(dǎo)致的平均日增重、平均日采食量和飼料利用效率的下降[8-9]。本試驗表明，添加TMP緩解了雞白痢沙門菌感染肉仔雞7 d和14 d累計增重和采食量的下降以及料重比的增加，同時緩解了14 d死亡率的增加。值得注意的是，使用TMP達到了與使用抗生素相當(dāng)?shù)男Чf明TMP可替代抗生素來緩解雞白痢沙門菌感染導(dǎo)致的肉仔雞生產(chǎn)性能下降。

3.2 四甲基吡嗪對雞白痢沙門氏菌感染肉仔雞氧化反應(yīng)的影響

二胺氧化酶是腸黏膜中一種具有高度活性的細胞內(nèi)酶，當(dāng)腸道受損時，二胺氧化酶可被釋放至血液中，導(dǎo)致血液中二胺氧化酶的活性增加[13]。因此，血清和腸黏膜中二胺氧化酶活性可有效反映腸道結(jié)構(gòu)和功能的完整狀態(tài)。丙二醛是一種反應(yīng)性醛，能夠?qū)е录毎a(chǎn)生有毒應(yīng)激，它是自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要終代謝產(chǎn)物。蛋白質(zhì)羰基的形成是自由基攻擊蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化過程中發(fā)生酶促水解的結(jié)果[14]。蛋白質(zhì)羰基化已被廣泛用于衡量蛋白質(zhì)氧化損傷和功能異常的重要指標(biāo)[15]。因此，組織中丙二醛和蛋白質(zhì)羰基的含量可作為體內(nèi)氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物。研究表明沙門菌感染可誘導(dǎo)肉雞氧化應(yīng)激，降低抗氧化酶活性，增加組織中氧化產(chǎn)物如丙二醛的含量[16-17]。本試驗中，雞白痢沙門菌感染顯著增加了肉仔雞血清和十二指腸黏膜中丙二醛和蛋白質(zhì)羰基的含量，說明肉仔雞體內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡，這種情況有利于病原菌的進一步感染，進而可能引起腸黏膜受損，導(dǎo)致血清二胺氧化酶活性增加。TMP具有良好的抗氧化功效，可抑制細胞內(nèi)活性氧的生成，增加細胞超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的活性，減少細胞丙二醛和一氧化氮等氧化產(chǎn)物和炎性介質(zhì)的含量[18]。試驗表明，TMP給藥可抑制紅細胞自氧化和過氧化氫所致紅細胞溶血，還可促進超氧化物歧化酶表達，提高抗氧化能力，減少丙二醛的生成，降低脂質(zhì)過氧化損傷程度[19]。目前，關(guān)于TMP對肉雞抗氧化能力影響的報道幾乎沒有。本試驗發(fā)現(xiàn)，添加TMP顯著降低了感染狀態(tài)下肉仔雞血清和十二指腸黏膜中丙二醛和蛋白質(zhì)羰基的含量以及二胺氧化酶活性，且達到了與使用抗生素相當(dāng)?shù)男Чf明TMP可替代抗生素來緩解雞白痢沙門菌感染所導(dǎo)致的肉仔雞氧化應(yīng)激，緩解其對腸道結(jié)構(gòu)和功能的破壞，進而有利于肉仔雞生產(chǎn)性能的改善。

3.3 PI3K/AKT信號通路

PI3K/AKT信號通路是與細胞功能相關(guān)最為密切的通路之一，它可調(diào)控細胞的新陳代謝、增殖分化和存活等生命過程，此通路在機體多種疾病狀況下均存在異常表達[20]。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，它是由調(diào)節(jié)亞基和催化亞基所組成的一種異源二聚體[21]。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)和底物特性的不同，P13K家族可分為三類：I型、Ⅱ型、Ⅲ型，分別包括I型催化亞基(PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD和PIK3CG)、I型調(diào)節(jié)亞基(PIK3RI、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5和PIK3R6)、Ⅱ型P13K亞基(PIK3C2A、PIK3C2B和PIK3C2G)和Ⅲ型P13K亞基(PIK3R4和PIK3C3)[21].AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括 AKT1、AKT2、AKT3 三種亞型，AKT是PI3K 信號通路中的一種非常重要的下游效應(yīng)分子[22]。PI3K被激活后，會在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，后者與細胞內(nèi)含有相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的信號蛋白結(jié)合，促使AKT結(jié)構(gòu)中的絲氨酸磷酸化，進而導(dǎo)致AKT活化?；罨蟮腁KT再繼續(xù)磷酸化其下游激酶和轉(zhuǎn)錄因子，最終調(diào)節(jié)細胞的功能[22]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)在細菌感染過程中也扮演重要角色[23-24]。PI3K/AKT信號通路的異常激活可能與機體氧化應(yīng)激產(chǎn)生聯(lián)系[25-26]。本試驗中，肉仔雞感染白痢沙門菌后，其十二指腸中PI3K、PIK3C3、AKT1、AKT3表達量都顯著上調(diào)，說明雞白痢沙門菌感染激活了肉仔雞腸道PI3K/AKT1或PI3K/AKT3通路，進而可能引起腸道氧化應(yīng)激，導(dǎo)致十二指腸黏膜中丙二醛和蛋白質(zhì)羰基含量增加。通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路可緩解機體氧化應(yīng)激[26]。研究發(fā)現(xiàn)，TMP處理可抑制MAPK和Akt信號分子的磷酸化，減少活性氧的生成，阻斷核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)從細胞質(zhì)到細胞核的易位，從而緩解脂多糖誘導(dǎo)的細胞氧化損傷[27]。本試驗發(fā)現(xiàn),TMP和抗生素均顯著下調(diào)了感染組肉仔雞7 d十二指腸PI3K、PIK3C3和AKT1的表達量，此外，TMP顯著下調(diào)了14 d十二指腸PI3K、AKT1和AKT2的表達量，而抗生素則顯著下調(diào)了14 d十二指腸PI3K、AKT1和AKT3的表達量，這說明隨著感染日齡的增加，TMP和抗生素對腸道PI3K/AKT信號通路的調(diào)節(jié)作用不盡一致，這有待進一步研究。TMP和抗生素均可能通過抑制PI3K/AKT1信號通路而緩解雞白痢沙門菌感染導(dǎo)致的肉仔雞氧化損傷。

4 結(jié) 論

日糧中添加適量TMP可有效替代抗生素緩解雞白痢沙門菌感染導(dǎo)致的肉仔雞氧化應(yīng)激，進而緩解其生產(chǎn)性能下降。TMP對肉仔雞氧化應(yīng)激的緩解作用可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT1信號通路實現(xiàn)。