張慧瑩，郝婷婷△，劉 剛，王田田，王運(yùn)航，張雅雅，米耀云，李河林，敬曉棋*

(1.榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院榆林市動(dòng)物疾病診斷與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 榆林 719000；2.榆林市榆陽區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 榆林 719000；3.榆林學(xué)院 陜西省陜北絨山羊工程技術(shù)研究中心，陜西 榆林 719000；4.榆林學(xué)院 陜北羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 榆林 719000)

支原體肺炎是由多種支原體(Mycoplasmaspp，M.spp)引起人和動(dòng)物以咳嗽、喘氣、纖維素滲出為特征的急慢性傳染病[1]。其中，綿羊支原體(Mycoplasmaovine，MO)[2]、絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.Capri，Mmc)[3]、山羊支原體山羊亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capricolum，Mcc)、山羊支原體肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.Capripneumoniae，Mccp)[4]的單純或混合感染，可導(dǎo)致綿羊支原體肺炎及山羊傳染性胸膜肺炎[5-6]。

精氨酸支原體(Mycoplasmaarginini，M.arginini)是一種常在微生物，可從人、牛、駱駝、綿羊等多種動(dòng)物呼吸道組織中分離獲得[7]。精氨酸支原體具有潛在的致病能力，當(dāng)環(huán)境驟變、機(jī)體抵抗力降低時(shí)，可引起牛呼吸道感染，若與其他病原混合感染并侵入肺部，可導(dǎo)致肺部病變[7-8]。國(guó)內(nèi)有文獻(xiàn)報(bào)道，從山羊鼻拭子中分離到一株精氨酸支原體[9]，但目前未見從綿羊中分離到精氨酸支原體的報(bào)道。湖羊是我國(guó)優(yōu)良的肉用綿羊品種，2019年以來，榆林市引入大量湖羊并進(jìn)行規(guī)模化舍飼養(yǎng)殖。由于北方氣候寒冷，圈舍密閉保溫使空氣質(zhì)量下降，導(dǎo)致湖羊呼吸道疾病頻發(fā)?；疾⊙蚺R床表現(xiàn)為劇烈咳嗽、流鼻，體溫升高至40 ℃以上，多種抗生素治療無明顯效果，且多數(shù)于發(fā)病5～7 d后死亡。為了更好的預(yù)防和控制該病，減少死亡和經(jīng)濟(jì)損失，本研究從臨床早期急性發(fā)病病例中采集樣品進(jìn)行了病原的分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 陜西省榆林市某湖羊場(chǎng)26日齡的發(fā)病羔羊，未用任何藥物進(jìn)行治療。

1.1.2 試劑 PPLO培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品，特級(jí)馬血清Solarbio公司產(chǎn)品(cat：S9050)，青霉素G鈉購自山東齊魯制藥有限公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit，cat：DP304)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit：DP302)均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；PCR premix為寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品；引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病例樣本觀察及剖解 在了解羊群發(fā)病和用藥治療情況的基礎(chǔ)上，選擇未用藥的患病羔羊，觀察其臨床癥狀剖檢后，無菌采集典型病變組織樣品。

1.2.2 病原菌的初步鑒定 無菌剪取部分病料，涂片，革蘭氏染色鏡檢觀察。另取3 mm3病變組織置于含有0.5 mL生理鹽水的1.5 mL EP管中，用研磨棒擠壓、研磨，離心取上清，按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，并以其此為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為premix 10.0 μL、支原體目16s RNA基因引物Myco、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，S.pneumoniae)(表1)上下游各1.0 μL、模板DNA 5.0 μL、ddHO22.0 μL的PCR體系，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))，72 ℃延伸10 min。PCR后用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

表1 引物信息

1.2.3 病原分離培養(yǎng) 無菌采集肺臟病健結(jié)合處、眼觀無明顯變化的組織，研磨、離心后取上清接種于含10%馬血清、80萬IU/L 青霉素的液體PPLO培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，若培養(yǎng)基未見混濁則繼續(xù)培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)5 d時(shí)顏色變淡的培養(yǎng)物標(biāo)記為P1代，將其用φ0.45 μm濾器過濾并再次接種PPLO液體連續(xù)傳代，每代培養(yǎng)物均進(jìn)行革蘭氏染色、油鏡觀察。同時(shí)將P3代培養(yǎng)物接種于含20%馬血清、80萬IU/L 青霉素的固體PPLO培養(yǎng)基上，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，5～7 d時(shí)在體視顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。

1.2.4 分離株種屬鑒定 取第3代液體培養(yǎng)物3 mL，3 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀物用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒抽提基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，分別用M.spp、MO、Mcc、Mccp、Mmc、M.arginine等6個(gè)支原體引物(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和程序同1.2.2。

1.2.5 分離株的遺傳進(jìn)化分析 將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收后送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行序列比對(duì)，并通過DNASTAR 11的MegAlign進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病羊臨床癥狀及剖檢結(jié)果

羊場(chǎng)統(tǒng)計(jì)記錄顯示，該場(chǎng)湖羊發(fā)病率為26.56%，羔羊發(fā)病率較高，臨床主要表現(xiàn)為咳嗽、流濃稠鼻液、呈典型腹式呼吸等。使用氟苯尼考、頭孢噻呋鈉等治療，無明顯效果，且發(fā)病羊在治療7 d內(nèi)死亡。剖解結(jié)果顯示，肺組織部分為正常粉紅色，部分組織暗紅色、肉樣變且覆蓋大量纖維素性滲出物。

2.2 病原的初步鑒定

病料涂片革蘭氏染色后鏡檢，未觀察到典型細(xì)菌。肺組織病原核酸檢測(cè)結(jié)果顯示，支原體目擴(kuò)增出275 bp的條帶，與預(yù)期一致，而其余病原菌無特異性擴(kuò)增條帶(圖1)。

圖1 肺組織樣品PCR檢測(cè)

2.3 分離培養(yǎng)結(jié)果

每代液體培養(yǎng)物抹片革蘭氏染色觀察，菌體均為粉紅色，形態(tài)不一，呈桿狀、球狀、短絲狀或長(zhǎng)絲狀(圖2)。第3代分離培養(yǎng)物PPLO固體培養(yǎng)上培養(yǎng)7 d后，形成大量圓形菌落，體視顯微鏡下觀察可見菌落形態(tài)為典型的煎蛋樣，中央乳頭狀突起(圖3)。

圖2 培養(yǎng)物革蘭氏染色(1000×)

圖3 菌落形態(tài)(10×)

2.4 分離株種屬鑒定結(jié)果

以第3代培養(yǎng)物基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果表明，M.spp和M.arginine引物分別擴(kuò)增出275 bp和546 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小一致，而MO、Mcc、Mccp、Mmc未見預(yù)期特異性擴(kuò)增條帶。

2.5 分離株測(cè)序結(jié)果及遺傳進(jìn)化分析

將測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行序列比對(duì)結(jié)果顯示，與NCBI中已公布的U15794.1、HQ661827.1、NR_041743.1、GQ409971.1、JN935883.1、MN564911.1等20多株精氨酸支原體16S RNA序列相似性為100%(圖4)，說明其為精氨酸支原體，命名為精氨酸支原體榆林株(M.arg YL strain)。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，分離株與其他精氨酸支原體均處于同一分支，親緣關(guān)系最近，其次與MO Y98(NR_025989.1)較近，而與Mcc ATCC27343(NR_036952.1)、MCCP(NR_037061.1)、Mmc(NR_044772.1)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖5)。

圖4 支原體榆林分離株種屬鑒定

圖5 精氨酸支原體榆林株(M.arg YL)系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

羊支原體肺炎是由多種支原體(Mycoplasmaspp)引起的以咳嗽、喘氣、纖維素滲出為特征的急、慢性傳染病[5]，影響羊的健康并導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。本研究中，發(fā)病羊場(chǎng)為存欄3萬頭的規(guī)?；驁?chǎng)，場(chǎng)內(nèi)不同年齡羊只均有發(fā)病，臨床表現(xiàn)為間歇咳嗽、喘氣，臨床診斷為肺炎。對(duì)患病嚴(yán)重的病例采用氟苯尼考、頭孢噻呋鈉等抗生素治療無明顯效果，多數(shù)于發(fā)病5～7 d內(nèi)死亡。因發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)、常規(guī)治療群體癥狀無明顯改變，結(jié)合發(fā)病羔羊病理剖檢特征，推測(cè)該場(chǎng)湖羊肺炎可能是由支原體感染引起。為了確定其感染病原，先對(duì)未使用藥物治療的湖羊羔羊病料進(jìn)行了常規(guī)抹片革蘭氏染色鏡檢，進(jìn)而利用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的支原體目16s RNA、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌引物對(duì)肺組織病料核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果出現(xiàn)275 bp條帶，與設(shè)計(jì)的支原體目16s RNA目標(biāo)片段大小一致，而利用其它2種病原引物未擴(kuò)增出目的條帶，結(jié)果初確定患病羔羊肺炎是由支原體感染引起。

病原的分離鑒定是傳染病診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)[10]，因此本研究對(duì)病變肺組織進(jìn)行了常規(guī)的支原體分離培養(yǎng)，病原分離結(jié)果顯示，經(jīng)過3次傳代的培養(yǎng)物革蘭氏染色后，菌體為粉紅色，形態(tài)不一，成桿狀、球狀、短絲狀及長(zhǎng)絲狀，與支原體典型的多形性特征一致[11]。分離物接種于PPLO固體培養(yǎng)物上，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)7 d，觀察到大量圓形菌落，體視顯微鏡下可見菌落中央乳頭狀突起，呈典型的煎蛋樣形態(tài)[12]。因此，結(jié)合病羊癥狀、病理變化、分離培養(yǎng)物菌體特征及菌落形態(tài)可初步確定成功分離到了引起該場(chǎng)湖羊肺炎的病原為支原體。

盡管MO、Mmc、Mcc、MCCP等是引起綿羊支原體肺炎的主要病原，然而通過對(duì)10年的綿羊肺炎病原回溯檢測(cè)顯示，M.arginini也能夠?qū)е聡?yán)重綿羊肺炎[13]，僅根據(jù)臨床癥狀難以確定病原的種屬。因此，本研究用M.spp、M.arginini、Mmc、Mcc、Mccp和MO的特異性引物對(duì)分離培養(yǎng)物進(jìn)行了PCR鑒定，結(jié)果顯示Mycoplasmaspp引物擴(kuò)增出275 bp的目的片的同時(shí)，M.arginini引物也擴(kuò)增出了546 bp的目的片段，而其他4種均沒有目的產(chǎn)物。M.arginini的PCR產(chǎn)物測(cè)序后在NCBI中比對(duì)顯示，該序列與Genebank中精氨酸支原體序列一致性為100%。因此，從PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果可以確定分離物為精氨酸支原體。

精氨酸支原體是多種動(dòng)物呼吸道的常在微生物，有報(bào)道牛支原體肺炎(M.bovis)有17%的情況能夠分離到精氨酸支原體，但不能確定是不是牛肺炎的關(guān)鍵病原[14]。然而，可以確定的是精氨酸支原體能夠引起駱駝肺炎且能夠傳染人，具有較強(qiáng)的毒力和耐藥性[15]。早在1985年Jones等[16-17]就報(bào)道了精氨酸支原體感染綿羊及其對(duì)綿羊組織器官的致病性。近來的研究多認(rèn)為精氨酸支原體與溶血曼氏桿菌(Mannheimiahaemolytica，M.haemolytica)、多殺性巴士桿菌(Pasteurellamultocida，P.multocida)混合感染時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病性[13]，然而本研究中未分離到其他可疑的致病菌。限于時(shí)間和條件，本研究未進(jìn)行病原致病性試驗(yàn)，但結(jié)合臨床癥狀、病理解剖以及分離鑒定結(jié)果，可確定此次湖羊場(chǎng)發(fā)病是由于精氨酸支原體感染所致。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，精氨酸支原體為該羊場(chǎng)湖羊肺炎的病原，結(jié)果將為榆林市湖羊肺炎的防控和治療提供病原學(xué)基礎(chǔ)。