丁亞偉，劉 月, 徐艷輝，王雅麗，王海玉，郝慶紅,4，段春輝*，郭云霞,,4*，紀守坤，嚴 慧，劉月琴，張英杰

(1.河北農業(yè)大學 動物科技學院，河北 保定 071001；2.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，河北 保定 071001；3.河北農業(yè)大學 生命科學學院，河北 保定 071001；4.農業(yè)微生物河北省工程中心，河北 保定 071001)

發(fā)酵飼料可降解飼料中大分子營養(yǎng)物質[1]，利于幼齡動物腸道的消化吸收。益生菌在發(fā)酵過程中還產生有機酸和風味物質，酸化的飼料可防止飼料霉變，抑制有害菌生長，進而減弱大腸桿菌致腸毒癥的能力[2]，發(fā)酵過程中產生的有機酸可以激活與蛋白質和碳水化合物有關消化酶，提高飼料營養(yǎng)利用率[3]，最終達到增強免疫力促進生長的目的[4]。芽孢桿菌是最理想的發(fā)酵菌種，可形成芽孢，屬于兼性厭氧菌，生命力頑強，具有較高的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，產生活性抑菌物質，且獨特的奪氧機制為厭氧菌提供生長條件，同時還產生B族維生素和維生素C等。生產中常用的芽孢桿菌有地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。乳酸菌因其發(fā)酵可產生乳酸提供酸性環(huán)境，可抑制有害菌的增殖，在生產中也被廣泛應用。近年來發(fā)酵飼料作為優(yōu)質的替抗產品在單胃動物中研究較多，在幼齡反芻動物中研究較少。本試驗以玉米、豆粕、麩皮為發(fā)酵底物，以前期篩選的抗腹瀉地衣芽孢桿菌(Y5-39)[5]、乳酸桿菌(RSG-1)、枯草芽孢桿菌(B-1)為發(fā)酵菌種，研究飼料經復合益生菌發(fā)酵后營養(yǎng)物質的變化及對腹瀉病原菌的抑制作用，為益生菌發(fā)酵料的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

本試驗于2021年3月在河北農業(yè)大學動物科技學院完成。

1.2 菌種及培養(yǎng)基

發(fā)酵菌種：枯草芽孢桿菌B-1(CGMCC22064)，地衣芽孢桿菌Y5-39(CGMCC22062)，乳酸桿菌RSG-1(CGMCC22061)。腹瀉病原菌：大腸桿菌(E.coli)、沙門氏菌(Salmonella)和痢疾桿菌(ShigellaCastellani)。所有菌種均由河北農業(yè)大學生命科學學院制藥工程系實驗室分離并保存。根據(jù)Design-Expert軟件中Mixture模型，設計不同菌種分組，以酸溶蛋白為響應值，最終得到乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌1∶1∶4復合。

瓊脂培養(yǎng)基(NA)：瓊脂20 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g、1 L蒸餾水，pH 7.2～7.4；發(fā)酵培養(yǎng)基(NB)：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，1 L蒸餾水，pH7.2～7.4；肉湯培養(yǎng)基(MRS)：蛋白胨10 g、牛肉粉5 g、酵母粉5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸三銨2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、瓊脂粉15 g、1 L蒸餾水，pH7.2～7.4。使用前121 ℃滅菌20 min。

1.3 試驗設計

本試驗中飼料原料(衡水某畜牧有限公司提供)按處理方式分別為對照組和發(fā)酵組，對照組不做處理，發(fā)酵組用復合益生菌接種，接種量10%、含水量45 %，裝瓶室溫(30 ℃，發(fā)酵瓶容積為350～400 g)密閉發(fā)酵14 d。發(fā)酵結束后分別檢測兩組營養(yǎng)物質含量、酸溶蛋白、pH、消化酶、揮發(fā)性脂肪酸、抗原蛋白、霉菌毒素等指標，并進行抑菌試驗，檢測抑菌效果。

1.4 指標測定與方法

1.4.1 酸溶蛋白的測定 取烘干后對照組和試驗組飼料各3 g于50 mL離心管中，加入25 mL 15%三氯乙酸靜置沉淀4 h，離心取5 mL上清，后按照GB/T6432《飼料中粗蛋白測定方法》[6]測定酸溶蛋白含量。

1.4.2 常規(guī)營養(yǎng)成分測定 取烘干后兩組的飼料各50 g樣品，105 ℃烘干20 min，65 ℃烘48 h后，粉碎過60目篩，干物質(DM)、粗蛋白(CP)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、粗脂肪(EE)含量參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[7]測定。

1.4.3 消化酶含量與抗原蛋白測定 飼料中淀粉酶采用α-淀粉酶(α-amylase，α-AL)試劑盒測定，蛋白酶采用酸性蛋白酶(Acid protease, ACP)試劑盒檢測，脂肪酶采用脂肪酶(Lipase，LPS)試劑盒檢測，纖維素酶采用纖維素酶(Cellulase，CL)試劑盒檢測。酶含量檢測試劑盒均購自索萊寶試劑公司。大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白采用大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白試劑盒(龍科方舟生物工程有限公司)測定，操作步驟參照試劑盒說明書進行。

1.4.4 毒素的測定 黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素測定方法參照GB/13078-2017《飼料衛(wèi)生標準》進行測定。

1.4.5 pH與有機酸測定 樣品與蒸餾水按1∶10放于錐形瓶中，37 ℃、180 r/min振蕩30 min得到飼料浸提液，用pH計(PSH-3D，梅特勒-托利多)測定pH。參照孫蕊[8]等的方法，稱取適量樣品(1 g)于10 mL容量瓶，加流動相(0.01 mol/L磷酸二氫鉀，pH=2.55)定容至刻度，超聲30 min，利用高效液相色譜法(HPLC)進行樣品中乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸含量的測定，色譜柱(C18柱，250 mm×4.6 mm×5 um)，流速(0.5 mL/min)，柱溫(35 ℃)進樣量(10 μL)，檢測波長(210 nm)。有機酸計算公式：

式中：X為樣品中有機酸的含量，mg/kg；m為樣品稱樣量，g；V為樣品定容體積，mL；C為各有機酸在標曲上計算的濃度，μg/mL。

1.4.6 微生物含量的檢測 芽孢桿菌參照GB/T26428-2010《飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》、乳酸桿菌參照GB4789.35-2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》。其中芽孢桿菌計數(shù)選用NA培養(yǎng)基，乳酸桿菌計數(shù)選用MRS培養(yǎng)基。

1.4.7 抑菌試驗E.coli、沙門氏菌、痢疾桿菌接種到NB中，于37 ℃、180r/min培養(yǎng)24 h。按1∶100(病原菌：培養(yǎng)基)在NA中分別接種大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌菌懸液，于滅菌培養(yǎng)皿中傾注15～20 mL的NA，制成病原菌平板。取未烘干的對照組和發(fā)酵組各10 g樣品，分別加入100 mL正丁醇在37 ℃，45k Hz下超聲波震蕩浸提1 h，3 000 r/min離心10 min，收集上清液備用，用平板對峙試驗在病原菌平板上打孔，加入60 μL浸提液，每個樣品9個平行，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈直徑大小。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)基礎整理采用WPS軟件，采用SPSS軟件中T-text檢驗進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 復合益生菌發(fā)酵飼料對常規(guī)營養(yǎng)成分的影響

由表1可知，與對照組相比，飼料經復合益生菌發(fā)酵后粗蛋白含量極顯著增加了11.27%(P<0.01)，酸溶蛋白含量極顯著增加了498.06%(P<0.01)，干物質、粗灰分、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維與對照組無顯著差異(P>0.05)。

表1 飼料發(fā)酵前后營養(yǎng)成分分析(干物質基礎)

2.2 復合益生菌發(fā)酵飼料對抗原蛋白及消化酶的影響

復合益生菌發(fā)酵飼料對抗原蛋白及消化酶的影響見表2。由表2可知，飼料經復合益生菌發(fā)酵后極顯著降低了大豆抗原蛋白、β-伴大豆球蛋白含量(P<0.01)，分別下降了70.85%和66.59%，淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶極顯著增加(P<0.01)，酸性蛋白酶顯著提高(P<0.05)。

表2 復合益生菌發(fā)酵飼料對抗原蛋白及消化酶的影響

2.3 復合益生菌發(fā)酵飼料對霉菌毒素含量的影響

復合益生菌發(fā)酵飼料對霉菌毒素含量的影響見表3。由表3可知，與對照組相比，復合益生菌發(fā)酵飼料中黃曲霉毒素B1和嘔吐毒素含量分別降低44.41%(P<0.01)和79.04%(P<0.01)，玉米赤霉烯酮降低了16.89%(P<0.05)。

表3 復合益生菌發(fā)酵飼料對霉菌毒素含量的影響

2.4 復合益生菌發(fā)酵飼料的抑菌性能分析

2.4.1 復合益生菌發(fā)酵飼料對pH和揮發(fā)性脂肪酸的影響 復合益生菌發(fā)酵飼料對pH和揮發(fā)性脂肪酸的影響見表4。由表4可知，復合益生菌發(fā)酵飼料后pH顯著下降(P<0.01)，乳酸、乙酸及總揮發(fā)性脂肪酸含量極顯著增加(P<0.01)，丁酸和戊酸顯著降低(P<0.01)，丙酸無顯著性差異(P>0.05)。

表4 復合益生菌發(fā)酵飼料對pH和揮發(fā)性脂肪酸的影響

2.4.2 復合益生菌發(fā)酵飼料后活菌數(shù)量和抑菌性能分析 復合益生菌發(fā)酵飼料后活菌數(shù)量和抑菌性能分析見表5。由表5可知，飼料經復合益生菌發(fā)酵后極顯著增加乳酸菌與芽孢桿菌的菌落數(shù)(P<0.01)。采用正丁醇對發(fā)酵料的抑菌物質提取后結果顯著，發(fā)酵飼料對大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌的抑菌圈直徑大小分別比未發(fā)酵飼料增加了60.00%(P<0.01)、31.58%(P<0.01)、42.86%(P<0.01)。

表5 復合益生菌發(fā)酵飼料后活菌數(shù)量和抑菌性能分析

3 討 論

3.1 復合益生菌發(fā)酵飼料對營養(yǎng)成分的影響

酸溶蛋白是評價發(fā)酵飼料品質的主要指標之一，主要由肽和游離氨基酸等低分子量的蛋白水解物組成，具有溶于酸性溶液(三氯乙酸)的特性，可以一定程度上反映抗原蛋白和其他蛋白質抗營養(yǎng)因子被水解的程度，同時也反映小肽含量的高低[9]。王梅等[10]研究表明，益生菌發(fā)酵豆粕組中粗蛋白含量比對照組提高了6.5%，酸溶蛋白含量是對照組的3倍。本研究發(fā)現(xiàn),益生菌發(fā)酵后的飼料粗蛋白顯著增加，可能是由于益生菌發(fā)酵過程中微生物的大量增殖，提高了微生物菌體蛋白含量；酸溶蛋白含量的顯著增加可能是發(fā)酵過程中產生的有機酸激活與蛋白質有關的消化酶，促進大分子蛋白降解成小肽利于動物消化吸收[3]。本試驗中試驗組DM含量低于對照組，與王洋等[11]研究相似，可能是因為飼料在發(fā)酵過程中微生物的增殖會消耗發(fā)酵底物成分，造成DM的損失。研究表明，乳酸菌發(fā)酵飼料對NDF和ADF無影響[12]。本試驗結果表明，發(fā)酵后NDF、ADF與對照組均無顯著性影響，可能是與飼料中含有DM有關，試驗組NDF、ADF含量下降可能是發(fā)酵過程中芽孢桿菌產生的纖維素酶可以破壞纖維間的氫鍵，釋放細胞內容物形成單糖[13]。進過益生菌發(fā)酵飼料可以提升CP、酸溶蛋白含量，降低不易吸收NDF、ADF含量，提升了飼料品質。

3.2 復合益生菌發(fā)酵飼料對抗原蛋白影響

腸道作為機體最大的營養(yǎng)器官，滲透性吸收是腸道固有的形態(tài)，指腸粘膜分子會把一些小分子物質以被動擴散吸收，大分子物質不被吸收的能力[14]。大豆球蛋白和β-大豆球蛋白是豆粕中主要的抗營養(yǎng)因子。日糧中大豆抗原蛋白含量高會破壞幼齡反芻動物腸道上皮完整性，抑制上皮細胞增殖，提高腸道上皮細胞炎性因子的分泌，引起過敏反應，導致腹瀉[15]。陳中平等[16]研究表明，米曲霉發(fā)酵過程中產生的活性蛋白酶可將豆粕大分子蛋白亞基降解為小分子蛋白，有效降解豆粕的抗營養(yǎng)因子和致敏化合物。本試驗結果顯示，益生菌發(fā)酵后，酸性蛋白酶活性顯著提升，使大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白降解，這與酸溶蛋白含量上升結果一致，說明經過益生菌發(fā)酵后的飼料更有利于動物腸道的消化吸收。

3.3 復合益生菌發(fā)酵對飼料中霉菌毒素的影響

霉菌毒素是一種有毒的次級代謝產物。黃曲霉毒素是世界公認的毒性最強的物質，主要與肝損傷有關，主要抑制DNA合成。嘔吐毒素主體是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，其作用機制主要是抑制蛋白質合成以及細胞膜的通透性，從而破壞機體免疫機能。另外，玉米赤霉烯酮是一種類雌激素，它可以與雌激素競爭結合位點結合，對動物生殖生理造成損傷。原料以及配合飼料中極易受到霉菌毒素的污染，因此，飼料中有效的解毒措施是必不可少的。目前認為一些微生物主要通過降解與吸附作用進行有效的解毒。Petchkongkaew等[17]和Cho等[18]研究表明，芽孢桿菌通過代謝后產生的酶水解作用可降解黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮。Chen等[19]研究表明，乳酸菌和芽孢桿菌作為革蘭氏陽性菌，有相同的細胞壁特征，通過細胞膜疏水性和細胞壁碳水化合物組分吸附真菌毒素使毒素含量降低。本研究表明，經過復合益生菌發(fā)酵后三種毒素菌顯著降低，說明枯草芽孢桿菌B-1、地衣芽孢桿菌Y5-39和乳酸桿菌復合后發(fā)酵飼料可有效降低霉菌毒素含量，與以上研究結果一致。

3.4 復合益生菌發(fā)酵對飼料抑菌性能的影響

pH和有機酸作為評價發(fā)酵品質重要指標，良好的發(fā)酵飼料pH會從6.0左右降到4.0以下[20]。本試驗結果表明經過益生菌發(fā)酵后飼料pH從6.0降低到3.4，與候楠楠等[21]研究結果一致。主要是因為固態(tài)發(fā)酵初期利用芽孢桿菌的好氧發(fā)酵消耗密閉環(huán)境的氧氣為乳酸菌的厭氧發(fā)酵提供條件，乳酸菌可以將飼料中的葡萄糖等碳水化合物轉化為乳酸等有機酸，從而降低飼料的pH。另外，乳酸具有調節(jié)腸道生態(tài)平衡、抑制病原菌、緩解腹瀉、促進鈣質吸收以及減緩應激的功能[10]，說明益生菌發(fā)酵飼料可能對促進羔羊健康生長有重要作用。乙酸是良好的酸味劑以及降低環(huán)境惡臭的有益物質，丙酸是很好的防腐劑和誘食劑[22]。本研究中，發(fā)酵后期主要是乳酸菌起作用，飼料碳水化合物經過同質性乳酸與異質性乳酸發(fā)酵產生乳酸和乙酸，因此乙酸和乳酸含量較高，這與王梅等[10]研究結果相似。丁酸是腐敗菌等微生物降解蛋白質、葡萄糖和乳酸的產物，丁酸含量增加會伴隨著pH的升高及蛋白質的快速降解[23]，本研究中益生菌發(fā)酵飼料丁酸含量比對照組降低了64.86%，提高了發(fā)酵飼料的品質。

動物腸道中主要由致病菌、有益微生物和病原體構成動態(tài)平衡[24]。腸道菌群微生物與宿主是共生關系，如果腸道菌群紊亂會造成動物腹瀉。腸道主要致病菌有大腸桿菌和沙門氏菌，病原菌最適生長pH為6.0～7.0，發(fā)酵過程中會產生抗菌代謝產物、乳酸等有機酸，飼料乳酸菌菌落數(shù)提高又可進一步證明乳酸的產生，降低飼料pH，處于酸性環(huán)境，抑制有害菌的增長[25]。本研究結果表明，益生菌發(fā)酵后芽孢桿菌菌落數(shù)明顯提高，經過正丁醇提取發(fā)酵后的代謝產物抑菌直徑顯著提高，酸性環(huán)境可加速乳酸菌代謝，產生的過氧化氫、乙醛、有機酸等物質，及芽孢桿菌代謝中產生桿菌素等物質，均對革蘭氏陰性菌有抑制作用，同時產生的大量有益菌與有害菌形成競爭關系，主要是對飼料營養(yǎng)物質和空間位點的競爭，芽孢桿菌占有絕對優(yōu)勢后，有害菌不滿足增殖條件從而達到抑菌作用。因此，益生菌發(fā)酵飼料的抑菌功能提高。

4 結 論

本試驗條件下，玉米-豆粕型飼料經過復合益生菌發(fā)酵后品質顯著提高，顯著降低飼料中的抗營養(yǎng)因子與霉菌毒素且抑菌效果較好，有望用于動物飼養(yǎng)的一種新型功能性飼料。