馬文杰，鐘 裔，陸兆新，張 平，陳詩蕾，秦 淼，呂鳳霞，趙海珍，別小妹

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

Bacillomycin D是芽孢桿菌中產(chǎn)生的一類環(huán)狀抗菌脂肽[1]，屬于Iturin家族[2]，由一條含有14～17個(gè)碳原子的β-氨基脂肪酸鏈和一條七肽鏈縮合而成[3]。Bacillomycin D對(duì)黃曲霉菌、赭曲霉菌、念珠菌、禾木科鐮刀菌等真菌的生長具有一定抑制作用[4-7]，對(duì)肺泡腺癌、腎癌、結(jié)腸癌及胃癌等癌細(xì)胞有選擇性毒性，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8-11]。此外，作為一種天然抗菌脂肽，Bacillomycin D具備安全、高效、易降解等多重優(yōu)勢[12]，有望成為化學(xué)抑菌劑的良好替代品，在糧食貯藏、食品安全[13]、臨床治療、生物防治[14]方面具有極高的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。但天然抗菌脂肽的生產(chǎn)效率問題一直是制約其大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的關(guān)鍵因素，如何提高微生物源抗菌脂肽產(chǎn)率也是研究人員致力克服的一大問題。

在微生物發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基優(yōu)化是提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的重要手段。目前對(duì)Bacillomycin D的培養(yǎng)基優(yōu)化主要集中在碳源、氮源以及金屬離子等三個(gè)方面。Qian等[15]發(fā)現(xiàn)以30 g/L菊糖代替葡萄糖作為碳源可使Bacillomycin D產(chǎn)量達(dá)到252.43 mg/L，L-gln能顯著增強(qiáng)B.amyloliquefaciensfmbJ合成Bacillomycin D的能力，可將產(chǎn)量提高至199.72 mg/L[16]，外源添加7 g/L L-乳酸鈣可使Bacillomycin D產(chǎn)量達(dá)到322.88 mg/L[17]。何婷婷[18]采用包含蔗糖、谷氨酸鈉、玉米漿、KH2PO4和MgSO4·7H2O等成分的培養(yǎng)基將Bacillomycin D的產(chǎn)量提升到了原始Landy培養(yǎng)基的2倍。李偉等[19]使用麥芽糖漿、尿素、玉米漿、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、K2HPO4和MnSO4·H2O等組成的優(yōu)化培養(yǎng)基將枯草芽孢桿菌M364的Bacillomycin D產(chǎn)量提高了50%。除此之外，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加相應(yīng)的前體物質(zhì)或前體合成所需底物是促進(jìn)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成最直接的方法，這一理論已經(jīng)在一些脂肽的研究中得到了證實(shí)[20]，但在Bacillomycin D的發(fā)酵生產(chǎn)中還沒有相關(guān)嘗試。

此外，通過基因工程的方法提高前體利用效率或者減弱前體競爭途徑也是促進(jìn)抗菌脂肽高效合成的重要方法。在Surfactin的生產(chǎn)中，通過基因編輯將pps和pks等脂肪酸前體的競爭途徑失活，同時(shí)將外源硫酯酶（TE）過表達(dá)，間接地增加Surfactin合成反應(yīng)中的脂肪酸前體供應(yīng)，可以使得Surfactin的產(chǎn)量提升至對(duì)照組的6.4倍[21]。通過設(shè)計(jì)支鏈脂肪酸生物合成途徑，增加前體支鏈脂肪酸的供應(yīng)，也可以使得Surfactin產(chǎn)量有數(shù)倍乃至數(shù)十倍的提高[22]。由此可見，通過探究脂肽的合成途徑，從基因水平上增加前體供應(yīng)，構(gòu)建基因工程菌將是進(jìn)一步縮小成本、提高產(chǎn)量的潛在方向。

Bacillomycin D是在聚酮合酶-非核糖體肽合酶（Polyketide synthase-nonribosomal peptide synthase，PKS-NRPS）共同催化下合成的，以?；o酶A以及Asn、Tyr、Pro、Glu、Ser和 Thr等六種氨基酸為直接前體[23]。其中?；o酶A以乙酰輔酶A作為底物合成，理論上提高乙酰輔酶A的胞內(nèi)含量可以促進(jìn)Bacillomycin D合成前體供應(yīng)，但乙酰輔酶A價(jià)格昂貴，直接在培養(yǎng)基中添加乙酰輔酶A即使能夠提高Bacillomycin D的產(chǎn)量，也會(huì)導(dǎo)致其生產(chǎn)成本成倍增加，因而促進(jìn)乙酰輔酶A的上游合成是提高其胞內(nèi)含量的重要途徑。丙酮酸是糖酵解反應(yīng)的最終底物，是胞內(nèi)乙酰輔酶A的主要來源之一，是菌體維持各項(xiàng)生理活動(dòng)的重要中間物質(zhì)[24]，本文分別從外源添加和基因工程兩方面增加丙酮酸或乙酰輔酶A的供應(yīng)，期望能夠促進(jìn)Bacillomycin D的合成，從而找到提高Bacillomycin D產(chǎn)量的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

B.amyloliquefaciensfmbJ（菌種保藏號(hào)為CGMCC No.0943）、E.coliJM109、Aspergillus flavus南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室；E.coliJM110感受態(tài)細(xì)胞 北京金沙生物科技有限公司；丙酮酸 上海麥克林生化科技有限公司；細(xì)菌總RNA提取試劑盒TransZolTMUP Plus RNA Kit 北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix、one step cloning kit 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 調(diào)至 7.0～7.2，固體培養(yǎng)基每100 mL另外添加2 g瓊脂；種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏3 g/L，NaCl 5 g/L，pH調(diào)至7.0～7.2；基礎(chǔ) Landy培養(yǎng)基（發(fā)酵培養(yǎng)基）：葡萄糖20 g/L，酵母浸膏 1 g/L，L-谷氨酸 5 g/L，KCl 0.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CuSO4·5H2O 0.15 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.2 mg/L，MnSO45 mg/L，pH調(diào)至7.0。

PowPacTM HC164-5052高電流電泳儀、Micro-Pulser微生物電穿孔儀 美國Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；ABI quant studio 5熒光定量PCR儀美國ABI公司；PTC-100TM PCR儀 MJ Research公司；Ultimate3000高效液相分析系統(tǒng) 美國Dionex公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)、C18反相色譜柱日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 丙酮酸外源添加 按照終濃度（體積分?jǐn)?shù)）0.05%、0.075%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%將丙酮酸添加到滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中，用除菌的4 mol/L NaOH調(diào)整培養(yǎng)基pH至7.0左右。

1.2.2 菌株發(fā)酵 將-20 ℃保存的B.amyloliquefaciensfmbJ在LB固體培養(yǎng)基上劃線，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)12～16 h，挑單菌落于LB培養(yǎng)基中37 ℃，180 r/min過夜活化。將活化后的菌液按照50倍稀釋度接入種子培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8～1.0。按照5%的接種量接種到各組發(fā)酵培養(yǎng)基中，33 ℃，180 r/min發(fā)酵120 h。

誘導(dǎo)型過表達(dá)菌株發(fā)酵的具體操作與上述基本相同，但菌株活化、發(fā)酵所用培養(yǎng)基均添加終濃度5 μg/mL的氯霉素，以保證發(fā)酵過程中無雜菌污染。在發(fā)酵液OD600達(dá)到0.8左右時(shí)向發(fā)酵液中添加IPTG溶液，設(shè)置IPTG終濃度梯度為0、50、100和200 mg/L。

1.2.3 Bacillomycin D提取及檢測 發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中，8000 r/min離心20 min，收集上清液，6 mol/L HCl調(diào)整pH至2.0，4 ℃靜置過夜。重復(fù)上述離心步驟，棄上清，收集沉淀于離心管底，按照100:2的比例加入甲醇使沉淀重懸，2 mol/L NaOH調(diào)整重懸液pH至7.0，置于超聲清洗器中超聲處理50 min，再次離心取上清獲得Bacillomycin D粗提液。粗提液過直徑0.22 μm的濾膜，通過HPLC對(duì)Bacillomycin D進(jìn)行定量檢測，檢測波長為207 nm，檢測條件見表1，其中流動(dòng)相A為含1‰三氟乙酸的乙腈，流動(dòng)相B為含1‰三氟乙酸的水。參照錢時(shí)權(quán)[17]報(bào)道的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行Bacillomycin D產(chǎn)量計(jì)算：y=7.6396x-2.3576，R2=0.9999，x表示Bacillomycin D 濃度，mg/L；y 表示峰面積，mAU·h。

表1 HPLC檢測條件Table 1 Detection conditions of HPLC

1.2.4 RT-PCR 分別取丙酮酸調(diào)控下fmbJ發(fā)酵24、36、48和60 h的菌液樣品，采用TransZolTMUPPlus RNA Kit提取fmbJ的總RNA，具體步驟參照試劑盒說明書。然后按照HiScript III RT SuperMix for qPCR （+gDNA wiper）試劑盒說明書獲取 cDNA。反應(yīng)結(jié)束后采用NanoDrop 2000測定所得cDNA濃度，置于-20 ℃冰箱備用。

通過RT-PCR檢測Bacillomycin D合成基因bamA、bamB、bamC、bamD和TE，調(diào)控因子編碼基因comA、comP、comQ、degU、degQ、spo0A、codY、rapC、rapI、sigH、sigM、sigV、abrB，以及編碼丙酮酸和乙酰輔酶A合成相關(guān)酶的pyk和acs基因的表達(dá)量的變化。反應(yīng)體系為上下游引物以及cDNA各 1 μL，Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，并用 ddH2O 補(bǔ)充至 20 μL，將配制完成的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至RT-PCR儀上進(jìn)行兩步法擴(kuò)增，反應(yīng)程序參照文獻(xiàn)[25]。以16S rRNA為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt法分析目的基因的表達(dá)。引物序列如表2。

表2 RT-PCR所需引物Table 2 Oligonucleotide primers for RT-PCR

1.2.5acs、pyk基因過表達(dá)菌株構(gòu)建

1.2.5.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)B.amyloliquefaciensfmbJ全基因組測序結(jié)果，設(shè)計(jì)過表達(dá)載體構(gòu)建所需引物序列如表3。

表3 過表達(dá)載體構(gòu)建所需引物Table 3 Primers required for the construction of overexpression vectors

1.2.5.2acs、pyk過表達(dá)載體構(gòu)建 采用無縫克隆的方法構(gòu)建過表達(dá)載體。以pHT43質(zhì)粒為模板，以pHT-F/R為上下游引物，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增載體框架pHT01。同時(shí)以B.amyloliquefaciensfmbJ基因組為模板，分別以acs-pHT-F/R、pyk-pHT-F/R為上下游引物，擴(kuò)增得到目的基因acs、pyk，所得PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳及GelRed染色檢測，對(duì)條帶大小正確的片段進(jìn)行切膠回收。

在one step cloning kit的作用下，將pHT01線性載體框架分別與acs、pyk片段連接起來，并轉(zhuǎn)化至E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含有氨芐青霉素（100 mg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min 培養(yǎng) 12～16 h，按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書所述方法提取質(zhì)粒pHT01-acs、pHT01-pyk。將驗(yàn)證正確的pHT01-acs、pHT01-pyk質(zhì)粒繼續(xù)轉(zhuǎn)化至E.coliJM110感受態(tài)，挑取陽性轉(zhuǎn)化子提取獲得去甲基化的過表達(dá)質(zhì)粒。質(zhì)粒構(gòu)建示意圖如圖1。

圖1 pHT01-pyk和pHT01-acs的質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of plasmid construction of pHT01-pyk and pHT01-acs

1.2.5.3acs、pyk過表達(dá)菌株構(gòu)建 首先制備B.amyloliquefaciensfmbJ感受態(tài)，并通過電轉(zhuǎn)化的方法將去甲基化的pHT01-acs、pHT01-pyk轉(zhuǎn)入B.amyloliquefaciensfmbJ中，具體方法參照文獻(xiàn)[25]所述。轉(zhuǎn)化菌株涂布于含有氯霉素（5 μg/mL）的LB固體平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。挑取長出的單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證和測序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子即為acs、pyk的誘導(dǎo)型過表達(dá)菌株，分別命名為fmbJ-acs、fmbJ-pyk。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文所涉實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所有圖形采用Graph-Pad Prism 9.0繪制，并采用SPSS 19進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙酮酸對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響

以B.amyloliquefaciensfmbJ菌株在基礎(chǔ)Landy培養(yǎng)基中的發(fā)酵產(chǎn)物作為對(duì)照，分別測定了不同濃度丙酮酸對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖2。與對(duì)照組相比，當(dāng)丙酮酸添加濃度為0.05%時(shí)，Bacillomycin D產(chǎn)量沒有顯著變化（P＞0.05）；在添加濃度為0.075%時(shí)，Bacillomycin D產(chǎn)量極顯著提高（P＜0.001），達(dá)到 485.85 mg/L，約為對(duì)照組（344.45 mg/L）的1.41倍；在添加濃度為0.10%時(shí)，處理組產(chǎn)量顯著提高（P＜0.01），達(dá)到 429.51 mg/L，為對(duì)照組產(chǎn)量的1.25倍，但顯著低于0.075%丙酮酸處理組（P＜0.05）；當(dāng)添加濃度增加至0.15%～0.50%，處理組產(chǎn)量與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；當(dāng)添加濃度達(dá)到0.75%時(shí)，Bacillomycin D 產(chǎn)量顯著降低（P＜0.001），而當(dāng)丙酮酸添加濃度繼續(xù)升高至1.00%，發(fā)酵產(chǎn)物的脂肽粗提液中基本檢測不到Bacillomycin D，且各平行處理組間情況一致。由此可見，較低濃度的丙酮酸能夠促進(jìn)Bacillomycin D的合成，而高濃度的丙酮酸會(huì)抑制Bacillomycin D的合成。

圖2 丙酮酸對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of pyruvate on the yield of Bacillomycin D

2.2 丙酮酸對(duì)Bacillomycin D合成基因表達(dá)的影響

結(jié)合上述結(jié)果，丙酮酸外源添加濃度為0.075%時(shí)，最大程度提高了Bacillomycin D的產(chǎn)量。為了進(jìn)一步驗(yàn)證丙酮酸對(duì)Bacillomycin D合成的促進(jìn)作用，本研究通過RT-PCR，分析了此條件下丙酮酸對(duì)Bacillomycin D合成基因表達(dá)的影響。

Bacillomycin D的合成操縱子包括4個(gè)ORF，即bamD、bamA、bamB和bamC[26]，分別編碼BamD、BamA、BamB和BamC四個(gè)亞基。其中，TE結(jié)構(gòu)域（由TE基因編碼）位于BamC的C末端，主要負(fù)責(zé)Bacillomycin D的環(huán)化和釋放。本研究主要針對(duì)上述5個(gè)基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖3。在發(fā)酵初期即發(fā)酵24～36 h，丙酮酸顯著上調(diào)了bamD、bamA、bamB和bamC的表達(dá)（P＜0.05），最大上調(diào)倍數(shù)分別可達(dá)對(duì)照組菌株的5.80、4.19、7.13和5.72倍。而在發(fā)酵 48和 60 h，bamD、bamA、bamB和bamC的表達(dá)均較對(duì)照組出現(xiàn)不同程度的下調(diào)。但TE的表達(dá)在發(fā)酵24～60 h內(nèi)均呈現(xiàn)顯著上調(diào)（P＜0.05），上調(diào)倍數(shù)最大可達(dá)2.91倍。

圖3 丙酮酸對(duì)Bacillomycin D合成基因表達(dá)的影響Fig.3 Effects of pyruvate on the expression of Bacillomycin D synthetic gene

由此可見，丙酮酸可以在加速Bacillomycin D的合成裝配，促進(jìn)其環(huán)化及釋放，并最終促進(jìn)Bacillomycin D產(chǎn)量的提高。但這種促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在B.amyloliquefaciensfmbJ發(fā)酵前期，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，丙酮酸逐漸被消耗殆盡，促進(jìn)作用逐漸減弱，Bacillomycin D的合成趨于平穩(wěn)。

2.3 丙酮酸對(duì)B.amyloliquefaciens fmbJ調(diào)控因子表達(dá)的影響

研究表明，部分調(diào)控因子對(duì)Bacillomycin D的合成具有明顯的調(diào)節(jié)作用。因此，本研究繼續(xù)檢測了丙酮酸調(diào)控下，B.amyloliquefaciensfmbJ部分調(diào)控因子表達(dá)量的變化。所得結(jié)果如圖4所示：在發(fā)酵24 h時(shí)，丙酮酸對(duì)調(diào)控因子表達(dá)的影響較顯著，comA、comP、comQ、degU、degQ和spo0A的表達(dá)量顯著（P＜0.01 或P＜0.001）） 上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)分別可達(dá)對(duì)照組的 24.57、25.30、18.33、2.56、8.95和 7.14倍。在發(fā)酵36 h時(shí)，大多數(shù)調(diào)控因子的表達(dá)均有不同程度的下調(diào)，其中包括負(fù)調(diào)控因子abrB的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.001），僅為對(duì)照組的0.47倍；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到48 h，degU、spo0A、rapI和sigV基因顯著上調(diào)（P＜0.05），上調(diào)倍數(shù)分別可達(dá)到對(duì)照組的2.18、1.83、5.83和2.25倍，與此同時(shí)，rapC的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05），僅能達(dá)到對(duì)照組的 0.16倍；在發(fā)酵60 h時(shí)，degU和sigH的表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001），rapC的表達(dá)仍顯著下調(diào)（P＜0.05），并且自發(fā)酵48 h起，各調(diào)控因子表達(dá)開始與對(duì)照組趨近，這也與上述所得隨著發(fā)酵時(shí)間延長，丙酮酸的調(diào)控效果逐漸減弱的結(jié)論是相符的。但值得注意的是，在發(fā)酵36 h時(shí)，多個(gè)調(diào)控因子均較對(duì)照組顯著下調(diào)，這可能與丙酮酸的外源添加使得Bacillomycin D合成反應(yīng)提前有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，Bacillomycin D產(chǎn)量在發(fā)酵36～48 h后才開始快速增加[17,27]，但在本研究中，在fmbJ菌株發(fā)酵24 h時(shí)，多個(gè)調(diào)控因子以及Bacillomycin D合成基因的顯著上調(diào)表明fmbJ在這一階段的Bacillomycin D合成能力顯著增強(qiáng)，這從基因水平上證明了丙酮酸調(diào)控下fmbJ中Bacillomycin D合成反應(yīng)提前，而這所帶來的營養(yǎng)物質(zhì)消耗和菌體滲透壓變化會(huì)使得一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子表達(dá)量在達(dá)到一定水平后出現(xiàn)顯著下降[28]，從而導(dǎo)致圖4中36 h所示結(jié)果，但隨著Bacillomycin D的繼續(xù)合成，在胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)下，各調(diào)控因子的表達(dá)會(huì)逐漸恢復(fù)正常，這也與本研究所得結(jié)果是一致的。

此外，由圖4可見，在發(fā)酵24和36 h內(nèi)，丙酮酸可以上調(diào)乙酰輔酶A合成酶的表達(dá)，這為胞內(nèi)乙酰輔酶A含量的增加提供了積極條件。

圖4 丙酮酸對(duì)調(diào)控因子表達(dá)的影響Fig.4 Effects of pyruvate on the expression of regulatory factors

2.4 acs、pyk基因過表達(dá)載體構(gòu)建

由以上結(jié)果可見，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加丙酮酸可以顯著提高Bacillomycin D的產(chǎn)量，且丙酮酸的添加也在基因水平上促進(jìn)了乙酰輔酶A合成酶的表達(dá)。然而利用基因工程的方法，直接促進(jìn)丙酮酸和乙酰輔酶A的合成能否實(shí)現(xiàn)相同的效果仍有待進(jìn)一步研究。因此，本研究分別構(gòu)建了pyk和acs基因的誘導(dǎo)型過表達(dá)菌株。

首先以B.amyloliquefaciensfmbJ基因組為模板，擴(kuò)增得到acs、pyk的基因片段，產(chǎn)物長度應(yīng)分別為1719和1737 bp；同時(shí)以pHT43質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增得到pHT線性載體，產(chǎn)物長度應(yīng)為7858 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖5A，acs、pyk以及pHT線性載體產(chǎn)物條帶大小與預(yù)期相符。經(jīng)無縫克隆連接后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞中，挑取PCR驗(yàn)證陽性的轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒后繼續(xù)轉(zhuǎn)入E.coliJM110感受態(tài)細(xì)胞中，此時(shí)提取得到的質(zhì)粒已完成去甲基化，將其通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入B.amyloliquefaciensfmbJ中，平板上長出的單菌落首先通過 PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖5B，pHT01-acs、pHT01-pyk陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物的理論值應(yīng)分別為1891和1909 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測所得結(jié)果與之基本相符。同時(shí)，陽性轉(zhuǎn)化子中過表達(dá)質(zhì)粒上插入片段的測序序列也與預(yù)期完全一致，此時(shí)獲得的陽性轉(zhuǎn)化子即為誘導(dǎo)型過表達(dá)菌株B.amyloliquefaciensfmbJ-acs和 fmbJ-pyk。

圖5 B.amyloliquefaciens fmbJ-acs和fmbJ-pyk的構(gòu)建及驗(yàn)證Fig.5 Construction and verification of B.amyloliquefaciens fmbJ-acs and fmbJ-pyk

2.5 pyk和acs過表達(dá)對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響

理論上，IPTG添加量越高，基因過表達(dá)程度越高。如圖6可見，在fmbJ-pyk的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，添加了50 mg/L IPTG的處理組Bacillomycin D產(chǎn)量為207.88 mg/L，較同批次對(duì)照組產(chǎn)量（155.02 mg/L）極顯著提高（P＜0.001），為對(duì)照組的1.34倍。但隨著IPTG添加量的繼續(xù)增加這種提高作用反而逐漸減弱，在fmbJ-acs的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中也出現(xiàn)了類似的情況：添加了50 mg/L IPTG的處理組Bacillomycin D產(chǎn)量為 200.42 mg/L，為對(duì)照組（172.84 mg/L）的 1.16倍（P＜0.01），之后隨著IPTG添加量的逐漸提高，產(chǎn)量開始降低，當(dāng)IPTG添加量為200 mg/L時(shí)，fmbJ-acs的Bacillomycin D產(chǎn)量甚至顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖6 pyk和acs基因過表達(dá)對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of pyk and acs overexpression on Bacillomycin D yield

結(jié)合上述結(jié)果，當(dāng)丙酮酸激酶過表達(dá)達(dá)到一定水平后，Bacillomycin D的產(chǎn)量不會(huì)隨其表達(dá)量的提高而提高，反而會(huì)逐漸恢復(fù)到與對(duì)照組相似的產(chǎn)量。為了進(jìn)一步探究其對(duì)Bacillomycin D合成的影響，本研究檢測了丙酮酸對(duì)fmbJ-pyk的Bacillomycin D產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖7所示：在0.075%的丙酮酸調(diào)控下，50 mg/L IPTG誘導(dǎo)的fmbJ-pyk處理組Bacillomycin D產(chǎn)量較對(duì)照組提高了1.1倍，低于50 mg/L IPTG誘導(dǎo)的fmbJ-pyk的產(chǎn)量。由此可見，在基礎(chǔ)Landy培養(yǎng)基條件下，外源添加丙酮酸、過表達(dá)丙酮酸激酶或者乙酰輔酶A合成酶均可以促進(jìn)Bacillomycin D的合成，但這種促進(jìn)作用具有一定的濃度依賴性。

圖7 丙酮酸對(duì)fmbJ-pyk的Bacillomycin D產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of pyruvate regulation on Bacillomycin D yield of fmbJ-pyk

3 討論與結(jié)論

本研究首先通過外源添加丙酮酸，研究了增加胞內(nèi)丙酮酸供應(yīng)對(duì)Bacillomycin D合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在終濃度0.075%的丙酮酸調(diào)控下，B.amyloliquefaciensfmbJ的Bacillomycin D產(chǎn)量可達(dá)到485.85 mg/L，較對(duì)照組顯著提高41%，是目前在基礎(chǔ)Landy培養(yǎng)基中通過單體調(diào)控得到的較高產(chǎn)量，Bacillomycin D合成基因的上調(diào)也從基因水平上證實(shí)了這一提高作用。通過對(duì)丙酮酸代謝通路的分析，可以發(fā)現(xiàn)丙酮酸是乙酰輔酶A的重要來源之一，提高胞內(nèi)丙酮酸含量可以促進(jìn)其轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，進(jìn)而為Bacillomycin D的脂肪酸鏈合成提供前體物質(zhì)；同時(shí)也可以加速三羧酸循環(huán)，促進(jìn)氨基酸合成和胞內(nèi)能源物質(zhì)的產(chǎn)生，從而促進(jìn)Bacillomycin D的合成[29]。此外，正如本研究所報(bào)道的，在發(fā)酵24 h時(shí)，comA、comP、degQ、degU、spo0A、sigH、sigM的表達(dá)顯著上調(diào)，這些調(diào)控因子涉及生物被膜形成、芽孢形成、DNA轉(zhuǎn)錄、胞內(nèi)蛋白分泌等多種生理過程[30]，其上調(diào)均可對(duì)Bacillomycin D的合成發(fā)揮正調(diào)控作用[31-32]；CodY是一個(gè)全局調(diào)控因子，其對(duì)Bacillomycin D合成的促進(jìn)作用具有一定的濃度依賴性，在一定程度的積累也有利于Bacillomycin D的合成[32]；而rapC的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，已知敲除rapC會(huì)促進(jìn)Bacillomycin D的合成，可見其下調(diào)有利于Bacillomycin D的合成[33]；Spo0A對(duì)全局調(diào)控因子AbrB也有一定抑制作用[34]，AbrB能夠抑制細(xì)菌中100多種基因的表達(dá)，且在一些Bacillomycin D產(chǎn)量降低的處理組也檢測到了abrB表達(dá)量的上調(diào)[35]，因而其下調(diào)極有可能對(duì)Bacillomycin D產(chǎn)量提高起到積極作用。綜上所述，在發(fā)酵前期丙酮酸上調(diào)了正調(diào)控因子的表達(dá)，使得Bacillomycin D的合成反應(yīng)提前，而在發(fā)酵的后期，丙酮酸可以上調(diào)關(guān)鍵正調(diào)控因子的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)，維持Bacillomycin D的持續(xù)合成，從而使得Bacillomycin D合成周期變長，并最終提高Bacillomycin D的產(chǎn)量。綜合上述結(jié)果，可得到如圖8所示調(diào)控圖。

圖8 丙酮酸對(duì)Bacillomycin D合成調(diào)控機(jī)制的探索Fig.8 Exploration of the regulatory mechanism of pyruvate on Bacillomycin D synthesis

丙酮酸激酶催化糖酵解過程中丙酮酸和ATP的生成，在調(diào)節(jié)碳通量分布中起關(guān)鍵的作用。通過過表達(dá)丙酮酸激酶能夠促進(jìn)葡萄糖的利用和胞內(nèi)ATP、NADH的產(chǎn)生[36-37]，從而起到與外源添加丙酮酸相似的作用。本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)：在一定程度上過表達(dá)丙酮酸激酶可以促進(jìn)Bacillomycin D的產(chǎn)量提高為對(duì)照組的1.34倍。此外，除了葡萄糖等糖類物質(zhì)，乙酸、乙醇等其他碳源在乙酰輔酶A合成酶的催化下也可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。已有研究報(bào)道，過表達(dá)乙酰輔酶A合成酶能夠提高胞內(nèi)乙酰輔酶A的含量[38]。這與本文的結(jié)果是一致的，本文構(gòu)建的乙酰輔酶A合成酶過表達(dá)菌株fmbJ-acs的Bacillomycin D產(chǎn)量較野生菌也提高了16%。

這種直接從基因水平上促進(jìn)Bacillomycin D合成的方法在降低生產(chǎn)成本方面具有重要意義。但也可以看到，丙酮酸激酶和乙酰輔酶A合成酶過表達(dá)對(duì)Bacillomycin D的產(chǎn)量提高具有一定的濃度依賴性。然而對(duì)于丙酮酸激酶而言，如果能夠在其過表達(dá)的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)丙酮酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等其他丙酮酸代謝酶的過表達(dá)，可以促進(jìn)丙酮酸的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化[39-40]，從而有可能促進(jìn)Bacillomycin D產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。而對(duì)于乙酰輔酶A合成酶，這與本文選擇的基礎(chǔ)培養(yǎng)基類型是有關(guān)系的。因?yàn)榛A(chǔ)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)有限，不能夠持續(xù)為乙酰輔酶A的合成提供足夠的底物，但如果在fmbJ-acs的發(fā)酵培養(yǎng)基中分批補(bǔ)料乙醇、乙酸等可以直接用于合成乙酰輔酶A的物質(zhì)[41]，并將發(fā)酵體系擴(kuò)大，隨著底物量的充足及各方面設(shè)施的完備，Bacillomycin D產(chǎn)量也有可能獲得大幅提高，這為尋找更有效的提高Bacillomycin D產(chǎn)量的方法開辟了新的思路。