陳顯柳，王素茹，陳博鈺，謝德芳

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，國家市場監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗室（熱帶果蔬質(zhì)量與安全），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶果品蔬菜質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗室，海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗室，海南?？?571101）

喹啉銅是一種廣譜、高效、低殘留的喹啉類保護(hù)性低毒殺菌劑，屬有機(jī)銅鰲合物。喹啉銅噴施后可在植物表面形成一層嚴(yán)密的保護(hù)藥膜，藥膜緩慢釋放銅離子，銅離子被病菌萌發(fā)的孢子吸收，達(dá)到一定濃度時，可殺死孢子細(xì)胞，起到殺菌作用，從而有效抑制病菌的萌發(fā)和侵入[1-2]。喹啉銅廣譜高效，同時具有喹啉和銅鹽的作用，因而在我國柑橘種植過程得到廣泛的應(yīng)用[3]。但是如果過量使用喹啉銅，不僅會造成環(huán)境污染，還會導(dǎo)致銅離子在生物體內(nèi)富集，進(jìn)而對人體健康產(chǎn)生威脅[4]。Wang等[5]研究表明當(dāng)喹啉銅超過一定劑量濃度時，會導(dǎo)致環(huán)境中斑馬魚胚胎發(fā)育缺陷的概率增加和行為發(fā)生改變。我國已經(jīng)制定了蘋果、葡萄、楊梅、荔枝中喹啉銅的最大殘留限量，但尚未制定柑橘中喹啉銅的最大殘留限量[6]。

目前檢測農(nóng)產(chǎn)品中喹啉銅殘留量的方法主要有液相色譜法[7-9]、氣相色譜法[10-11]和液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)法[12]。徐小軍等[7]采用高效液相色譜法研究了喹啉銅在枇杷中的消解動態(tài)，其半衰期為3.4～4.6 d。Li等[1]采用高效液相色譜法研究了喹啉銅在梨中的殘留及消解動態(tài)，其半衰期為6.8～9.7 d。鄭振山等[12]采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究了喹啉銅在馬鈴薯中的殘留及消解動態(tài)，其半衰期為8.89～11.1 d，最終殘留量均小于0.10 mg/kg。常培培等[8]使用超高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器研究了喹啉銅在西瓜和土壤中殘留及消解動態(tài)，其半衰期為1.1～2.3 d。柑橘是世界第一大類水果，柑橘皮經(jīng)過干燥處理后可制成陳皮作為中藥使用，是老百姓餐桌上常見的水果，其食用的安全性備受關(guān)注[13-14]。目前，國內(nèi)外關(guān)于喹啉銅在柑橘中的殘留及消解動態(tài)研究較少[15]，未見33.5%喹啉銅懸浮劑在柑橘中殘留、消解動態(tài)及膳食暴露風(fēng)險的研究報道。同時柑橘樣品基質(zhì)復(fù)雜，儲藏過程中可能影響到喹啉銅的降解[16]。因此研究喹啉銅在柑橘中的儲藏穩(wěn)定性、消解動態(tài)及膳食暴露風(fēng)險評估具有重要意義。

本研究通過高效液相色譜法測定柑橘中喹啉銅的殘留量，通過對海南、江西兩地田間試驗樣品的檢測分析，評估了柑橘中喹啉銅的儲藏穩(wěn)定性、消解動態(tài)及膳食暴露風(fēng)險，為規(guī)范33.5%喹啉銅懸浮劑在柑橘生產(chǎn)中的安全使用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)品 質(zhì)量100 mg，純度99.8%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；33.5%喹啉銅懸浮劑 質(zhì)量分?jǐn)?shù)33.5%，浙江天豐生物科學(xué)有限公司；乙腈 色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；三氟乙酸色譜純，阿拉丁試劑上海有限公司；石墨化炭黑填料（GCB） 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；氯化鈉分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。

Waters e2695高效液相色譜儀（配有2489紫外檢測器） 美國沃特世公司；CR22N高速離心機(jī) 日本HITACHI公司；Milli-Q超純水器 德國Millipore公司；HT-200高速振蕩儀 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；TTL-DCII氮吹儀 北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；KQ-250DE超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海馳唐電子有限公司；L204電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 樣品前處理 稱取5.00 g柑橘全果或果肉樣品于50 mL離心管中，加入3 g氯化鈉，10 mL 0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈的混合溶液（v:v=1:9），渦旋5 min，150 W 超聲20 min，3800 r/min 離心5 min，重復(fù)提取步驟，合并上清液[9]。取5 mL上清液于10 mL離心管中，加入5 mg GCB填料凈化，渦旋2 min，3800 r/min離心5 min，取4 mL上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈的混合溶液（v:v=1:9）定容至1 mL。經(jīng)0.22 μm水相濾膜過濾，供高效液相色譜法測定樣品中喹啉銅的質(zhì)量濃度，由外標(biāo)法進(jìn)行定性定量。

1.2.2 儀器條件 色譜柱：SunFire?C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm），流動相：0.1% 三氟乙酸水溶液和乙腈，柱溫 25 ℃，進(jìn)樣量 10 μL，流速 1.0 mL/min，等梯度洗脫 v（0.1% 三氟乙酸水）:v（乙腈）=9:1，檢測波長254 nm。

1.2.3 添加回收試驗設(shè)計 在柑橘全果和果肉的空白樣品中設(shè)立喹啉銅質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2、2、5 mg/kg的添加水平，每個添加水平設(shè)5個平行，同時設(shè)空白對照，按照1.2.1方法進(jìn)行樣品前處理，在以上儀器條件下，通過高效液相色譜法測定質(zhì)量濃度，并計算回收率。

1.2.4 儲藏穩(wěn)定性試驗設(shè)計 按照植物源性農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留儲藏穩(wěn)定性試驗準(zhǔn)則[17]，進(jìn)行喹啉銅在柑橘中的儲藏穩(wěn)定性試驗，取樣分析時間為0、30、60、90、180 d。稱取5.00 g柑橘全果空白樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，往樣品中添加喹啉銅，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為2 mg/kg，共10個試驗樣品，于2 h內(nèi)儲藏于-20 ℃冰柜內(nèi)。每次取樣測定儲藏穩(wěn)定性試驗樣品2個、柑橘全果空白對照樣品1個、添加水平為5 mg/kg的柑橘全果質(zhì)控樣品2個，通過1.2.1的分析方法測定試驗樣品中的喹啉銅質(zhì)量濃度。根據(jù)式（1）計算柑橘全果樣品儲藏過程中喹啉銅殘留的降解率[17]。

式中：C為1.2.3中試驗樣品喹啉銅的初始?xì)埩袅浚╩g/kg）；Ci為樣品保存i天后，樣品中喹啉銅的殘留量（mg/kg）；Di為樣品保存i天后，樣品中喹啉銅降解率（%）。當(dāng)Di＜30%，表明農(nóng)藥在樣品中儲藏i天穩(wěn)定，反之，則不穩(wěn)定。

1.2.5 田間試驗設(shè)計 按照農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則[18]及田間試驗[19]要求，于2019年在海南省和江西省進(jìn)行了喹啉銅在柑橘中的規(guī)范殘留試驗。每個地區(qū)的試驗點(diǎn)設(shè)試驗小區(qū)和對照小區(qū)各1個，試驗小區(qū)前后未施用過相同的農(nóng)藥，每個小區(qū)有4株柑橘樹，小區(qū)之間設(shè)有隔離區(qū)，周邊設(shè)有保護(hù)行。試驗小區(qū)柑橘樹全株噴霧施藥33.5%喹啉銅懸浮劑3次，施藥劑量為 333.3 mg a.i./kg（1000 倍液），施藥間隔7 d。對照小區(qū)噴施清水。最終殘留試驗樣品于最后一次施藥后20、30 d采集，殘留消解試驗樣品于最后一次施藥后 2 h（0 d）、3、7、14、20、30 d 采集，空白小區(qū)樣品于0、30 d采集。每次采集獨(dú)立樣品2份，每份樣品隨機(jī)至少采集2 kg生長正常、無病害的柑橘果實(shí)，采集部位遍及樹體上中下部。樣品采收后沿縱向均勻地切成4瓣，分取不相鄰的2瓣，直接進(jìn)行勻漿，制備成柑橘全果樣品；或者去除橘皮后進(jìn)行勻漿，制備成柑橘果肉樣品。

1.2.6 半衰期 采用一級動力學(xué)方程模型對殘留消解試驗中獲得的柑橘中喹啉銅殘留量進(jìn)行分析擬合。喹啉銅在柑橘中的降解方程和半衰期[20-21]按照式（2）、式（3）進(jìn)行計算：

式中：Ct為時間t時的喹啉銅殘留量（mg/kg）；C0為殘留消解試驗0 d樣品中喹啉銅的初始?xì)埩袅浚╩g/kg）；k 為降解速率常數(shù)；T1/2為半衰期（D）。

1.2.7 慢性膳食暴露風(fēng)險評估 根據(jù)規(guī)范殘留試驗中值和我國人群每人每天的柑橘消費(fèi)量計算喹啉銅的估算每日攝入量（estimated daily intake，EDI）（μg/kg·bw）。根據(jù)EDI與喹啉銅的每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）的百分比得到喹啉銅的慢性膳食暴露風(fēng)險概率（risk quotiety，RQ）（%）。計算公式如下[22-23]：

式中：STMR為喹啉銅在柑橘中的規(guī)范農(nóng)作物殘留試驗中值（supervised trials median residue，STMR）（mg/kg）；FI為我國不同人群每人每天的柑橘消費(fèi)量（food intake，F(xiàn)I）（g/d），數(shù)據(jù)來源于《中國居民營養(yǎng)與健康狀況調(diào)查報告》[24]；bw為我國普通人群的平均體重（body weight，bw）（kg）；ADI為喹啉銅每日允許攝入量（mg/kg·bw），我國規(guī)定喹啉銅的ADI為0.02 mg/kg bw[6]。當(dāng)RQ的值≤100%時，表示對普通人群健康產(chǎn)生的風(fēng)險在可接受范圍之內(nèi)，數(shù)值越小，風(fēng)險越低；當(dāng)RQ的值＞100%時，表示風(fēng)險在不可接受范圍，數(shù)值越大，風(fēng)險越大。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品平行處理3次，采用Waters公司的液相色譜分析工作站Empower 3進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過Excel 2016進(jìn)行均值、標(biāo)準(zhǔn)差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差計算，通過Origin 2018進(jìn)行一級動力學(xué)擬合并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)品用流動相稀釋并配制成0.1、0.2、0.5、1.0、5.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，在以上的儀器條件下，通過高效液相色譜法進(jìn)行測定。以喹啉銅質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明：在0.1～5.0 μg/mL的范圍內(nèi)，其線性方程為 y=125038x+1513，決定系數(shù)R2為0.9999，線性關(guān)系良好。在1.2.1的前處理及儀器條件下，以檢測器上的3倍信噪比對應(yīng)的質(zhì)量濃度確定喹啉銅的檢出限（limit of detection，LOD）為 1 ng；喹啉銅在柑橘全果和果肉中的最低檢測濃度均為0.2 mg/kg，因此方法的定量限（limit of quantitation，LOQ）為0.2 mg/kg。添加回收試驗結(jié)果如表1所示：在柑橘全果中，喹啉銅的平均回收率為89.3%～98.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 1.9%～3.7%；在柑橘果肉中，喹啉銅的平均回收率為92.6%～102.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.8%～5.5%。方法的準(zhǔn)確度和精密度符合《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》[18]規(guī)定的殘留分析方法要求。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品譜圖見圖1。

圖1 喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)樣品、空白樣品及添加樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of oxine-copper standard solution, blank citrus samples and spiked Citrus samples

表1 喹啉銅在柑橘全果、果肉中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 1 Recoveries and relative standard deviations of oxine-copper in Citrus whole fruit and pulp (n=5)

2.2 喹啉銅在柑橘中的儲藏穩(wěn)定性

由表2可以看出，喹啉銅添加水平為2 mg/kg的柑橘全果樣品隨著儲藏時間的增加，殘留量變化不大，降解速度緩慢。質(zhì)控樣品的回收率為97.4%～103.9%，整個儲藏試驗期間喹啉銅的降解率為0～8.0%，未超過植物源性農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留儲藏穩(wěn)定性試驗準(zhǔn)則[17]規(guī)定的30%，因此喹啉銅在上述條件下，可以在柑橘中穩(wěn)定存在180 d以上。

表2 喹啉銅在柑橘全果樣品中的儲藏穩(wěn)定性（添加水平2 mg/kg）Table 2 Storage stability of oxine-copper in Citrus whole fruit(spiked level 2 mg/kg)

2.3 消解動態(tài)

由圖2可知，在江西和海南試驗地的柑橘全果樣品中，當(dāng)天施藥后2 h，喹啉銅的原始沉積量分別為1.40和1.32 mg/kg。江西地樣品的初始沉積量高于海南地樣品，可能與施藥時風(fēng)速、器械和施藥操作的差異有關(guān)，同時不同地點(diǎn)作物的生長狀況也會影響喹啉銅在柑橘上的附著量[25]。隨著時間的延長，樣品中的喹啉銅殘留量逐漸降低，施藥30 d后，江西地樣品中喹啉銅殘留量為0.32 mg/kg，降解率為77%，海南地樣品中喹啉銅殘留量低于LOQ，降解率超過85%。兩地柑橘全果樣品中喹啉銅的消解動態(tài)均符合一級動力學(xué)方程：江西為Ct=1.33805e-0.046t，海南為 Ct=1.04925e-0.068t；決定系數(shù)（R2）分別為 0.9746和0.8694；半衰期分別為15.1 d和10.2 d，屬于易降解農(nóng)藥（T1/2＜30 d）。海南試驗地柑橘中喹啉銅的降解速率更快，半衰期更短，這可能主要與試驗期間海南試驗地相比江西試驗地的光照更強(qiáng)時間更長，溫度更高，降雨更頻繁有關(guān)。柑橘中喹啉銅的殘留消解趨勢殘留見圖2。消解試驗中柑橘果肉樣品中喹啉銅殘留量均低于定量限。

圖2 喹啉銅在柑橘全果樣品中的殘留消解趨勢Fig.2 Digestion curves of oxine-copper in whole fruit of Citrus samples

2.4 慢性膳食暴露風(fēng)險評估

根據(jù)最終殘留試驗設(shè)計，對柑橘噴施喹啉銅3次，末次施藥后20、30 d采集樣品進(jìn)行測定柑橘全果、果肉中喹啉銅殘留量，見表3。結(jié)果表明柑橘全果樣品藥后20和30 d的殘留試驗中值（STMR）分別為0.42和0.25 mg/kg；柑橘果肉樣品中均未檢出喹啉銅殘留，其殘留試驗中值（STMR）按照LOQ（0.2 mg/kg）計算。不同年齡段人群的平均體重和水果消費(fèi)量來自《中國居民營養(yǎng)和健康狀況調(diào)查報告》[24]。慢性膳食暴露風(fēng)險評估結(jié)果見表4。結(jié)果表明，藥后20和30 d柑橘全果樣品中喹啉銅的估算每日攝入量分別為 0.1872～1.4584 μg/kg·bw 和 0.1114～0.8681 μg/kg·bw，慢性膳食暴露風(fēng)險概率分別為0.94%～7.29%和0.56%～4.34%；柑橘果肉中喹啉銅的估算每日攝入量為 0.0891～0.6945 μg/kg·bw，慢性膳食暴露風(fēng)險概率為0.45%～3.47%。在柑橘上規(guī)范使用33.5%喹啉銅懸浮劑，對一般人群健康不會產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險。雖然柑橘全果和果肉中的喹啉銅在不同人群中的慢性膳食暴露風(fēng)險總體水平較低，但是由于體重較輕的緣故，兒童的風(fēng)險水平要高于其他人群。

表3 喹啉銅在柑橘中的最終殘留Table 3 Final residue levels of oxine-copper in Citrus

表4 不同人群中喹啉銅的慢性膳食暴露風(fēng)險評估Table 4 Dietary exposure risk assessment of oxine-copper in different populations

3 結(jié)論

在-20 ℃的條件下儲藏180 d，柑橘全果樣品中喹啉銅的降解率低于10%，因此喹啉銅可以穩(wěn)定存在柑橘果實(shí)中。同時在海南和江西兩地進(jìn)行規(guī)范殘留試驗，柑橘樹全株噴霧施藥33.5%喹啉銅懸浮劑3次，施藥劑量為 333.3 mg a.i./kg（1000 倍液），施藥間隔7 d，柑橘中喹啉銅的殘留量隨著時間的延長逐漸降低，其消解符合一級動力學(xué)方程，半衰期為10.2～15.1 d。根據(jù)規(guī)范殘留試驗中值與膳食攝入量進(jìn)行慢性膳食暴露風(fēng)險評估，結(jié)果表明，在柑橘上規(guī)范使用33.5%喹啉銅懸浮劑，我國不同人群柑橘中喹啉銅估算每日攝入量為 0.0891～1.4584 μg/kg·bw，其慢性膳食暴露風(fēng)險小于10%，在可接受范圍內(nèi)，處于安全水平。