王標詩，黃澔楊，譚文慧，劉淑敏，張世奇，韓志萍，彭元懷

辣木籽多糖的超高壓輔助提取工藝及其抗氧化活性分析

王標詩1,2，黃澔楊1，譚文慧1，劉淑敏1,2，張世奇1,2，韓志萍1,2，彭元懷1,2

1. 嶺南師范學院食品科學與工程學院，廣東湛江 524048；2. 廣東省辣木資源開發(fā)與利用工程技術研究中心，廣東湛江 524048

超高壓輔助提取技術是一種天然產物新型綠色高效提取技術，在保證提取效率的同時能最大限度保持天然產物的生物活性。為探究超高壓輔助提取技術對辣木籽多糖的提取效果及其抗氧化活性的影響，本研究以辣木籽為原料，通過超高壓輔助提取技術提取辣木籽中的水溶性多糖，以多糖得率為考察指標，以提取壓力、提取時間、料液比、粉碎度作為單因素，在單因素試驗基礎上，采用正交試驗設計方法優(yōu)化辣木籽多糖的超高壓輔助提取工藝，并通過測定總抗氧化能力、清除DPPH自由基（DPPH?）和羥自由基（?OH）的能力來分析辣木籽水溶性多糖的抗氧化活性。結果表明，辣木籽多糖最佳的超高壓輔助提取工藝條件為：提取壓力100 MPa、保壓時間6 min、料液比（g/mL）1∶15、粉碎度100目篩，在最佳提取工藝條件下辣木籽多糖最大提取得率為0.346%；在測試范圍內辣木籽多糖清除DPPH自由基能力隨多糖濃度的增加而增加，并有較好的線性關系，清除率達到50%時對應的濃度（IC50）為0.0439 g/L，但是其抗氧化能力低于相同濃度的Vc，在測試范圍內清除羥自由基能力也隨辣木籽多糖濃度的增加而增加，也有較好的線性關系，IC50為0.1666 g/L，其抗氧化能力與同濃度的Vc較接近，辣木籽多糖的總抗氧化能力為0.0482 mmol/L（以硫酸亞鐵的當量濃度表示）。與熱水提取方法相比，超高壓輔助提取方法能夠縮短提取時間，提取溫度大大降低，提取效率顯著提高；而且提取的辣木籽水溶性多糖具有較好的抗氧化能力，可以作為天然抗氧化劑進行開發(fā)利用。本研究結果可為天然抗氧化劑的開發(fā)、辣木資源的綜合開發(fā)及高值化利用提供技術支持和參考。

辣木籽；水溶性多糖；超高壓輔助提??；抗氧化活性

辣木（）屬被子門辣木科辣木屬植物，起源于印度，目前，辣木樹在非洲及世界熱帶、亞熱帶地區(qū)均有種植，被稱為“窮人的牛奶樹”“奇跡之樹”[1-2]。辣木樹渾身是寶，其葉子、花、嫩豆莢、籽均可直接食用。辣木被譽為植物中的“鉆石”，與西洋參、靈芝合稱為“世界三寶”，受到了醫(yī)學界、食品界以及營養(yǎng)學界的高度重視。與普通的食品相比，辣木中蛋白質、膳食纖維及鈣等礦物質元素含量較高，營養(yǎng)成分豐富[3]。辣木的種子即為辣木籽，辣木籽中除了含有豐富的蛋白質、油脂及礦物元素，還有多糖等活性物質[3-4]，可用于食品、醫(yī)藥等方面，具有良好的開發(fā)價值和應用前景。

近年來，從天然植物中開發(fā)利用活性多糖成為新的研究熱點，常見的多糖提取方法有很多種，如醇提法、熱水浸提法、酶提法、微波法和超聲波法等，但是大多存在提取率低、耗時較長和對多糖結構和功能造成破壞等缺點[5]。而超高壓提取技術具有效率高、用時短和破壞性低等優(yōu)點。目前關于超高壓輔助提取多糖的研究比較少[6]。從天然產物中提取的多糖，在抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂等方面均有較好的效果[5]。

對辣木葉和辣木籽中多糖的提取已有相關報道，如陳瑞嬌[7]和孫鳴燕[8]分別研究了辣木葉多糖的提取工藝條件；董成國[9]研究了熱水提取辣木籽多糖的工藝條件及其抗氧化活性；CHEN等[10]研究了微波輔助提取辣木葉水溶性多糖的工藝條件及其降糖活性，而利用超高壓輔助提取辣木籽多糖的研究尚無報道。

本文以辣木籽為原料，對辣木籽多糖的超高壓輔助提取工藝進行優(yōu)化，并研究辣木籽多糖的抗氧化活性?？蔀槔蹦举Y源的綜合開發(fā)和高值化利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 辣木籽購于湛江市旭昇南藥種植專業(yè)合作社。

1.1.2 主要試劑 1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH自由基）分裝產品購自Sigma公司；總抗氧化能力（T-AOC）測試盒購自南京建成生物工程研究所；其他化學試劑均為分析純。

1.1.3 主要設備 DFY-800搖擺式高速萬能粉碎機，購自溫嶺市林大機械有限公司；FA1004N電子天平，購自上海精密科學儀器有限公司；W1-400/1.0型超高壓試驗殺菌機，購自天津華泰森淼生物工程技術股份有限公司；TU-1810DASPC紫外可見分光光度計，購自北京普析通用儀器有限公司；TGL16M高速冷凍離心機，購自鹽城市凱特實驗儀器有限公司；RE-2000B旋轉蒸發(fā)儀，購自上海亞榮生化儀器廠；DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱，購自上海精宏實驗設備有限公司；SHZ-D3循環(huán)水式真空泵，購自鞏義市英峪儀器廠；HZS-HA水浴振蕩器，購自哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；ELX808IU酶標儀，購自美國Bio-Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預處理 選擇色澤均勻、無蟲蛀、無霉變的辣木籽，置于55℃干燥箱中烘72 h，冷卻后用高速萬能粉碎機進行破碎；然后把辣木籽粉置于55℃的干燥箱中烘2 h，冷卻后用索氏抽提器脫脂處理，殘留物干燥過篩備用。

1.2.2 辣木籽多糖測定 參考梁琰等[11]的方法。分別取0.1 g/L葡萄糖溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，用蒸餾水補足至1.00 mL，分別加入5.00 mL濃硫酸及1.00 mL 5%苯酚，每根試管加完后一起放置在90℃熱水中水浴15 min，然后取出冷卻至室溫，于490 nm測吸光度。多糖得率的計算公式如下：

式中，表示從標準曲線中求出的辣木籽多糖質量（g），0表示辣木籽粉總質量（g）。

1.2.3 辣木籽多糖超高壓輔助提取工藝 參考奚灝鏘等[12]的方法。稱取預處理后的脫脂辣木籽粉3 g，按不同料液比加入一定體積的水，裝袋封口（盡量排出空氣），放入超高壓設備，按照不同壓力和保壓時間進行超高壓處理。處理后進行抽濾，取上清液與Sevage試劑混合（脫蛋白），振搖30 min后離心：3500 r/min離心15 min，取上清液在低溫下醇沉24 h，于20℃ 9000 r/min條件下離心10 min，沉淀物為辣木籽多糖，然后加蒸餾水溶解再定容至100 mL。

單因素試驗分別探討料液比、壓力、保壓時間和粉碎度對辣木籽多糖提取率的影響。料液比（g/mL）分別選取1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40；保壓時間分別選取0、2、4、6、8、10 min；壓力分別選取50、100、150、200、250、300、350、400 MPa；粉碎度分別選取過篩20、40、60、80、100目。

在單因素試驗結果的基礎上，選取對辣木籽多糖得率影響比較大的3個因素（料液比、提取壓力和保壓時間）作為考察因素，每個因素選取3個水平設計正交試驗，以多糖得率為試驗指標，優(yōu)化提取工藝。正交試驗設計因素與水平如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平

1.2.4 辣木籽多糖熱水提取工藝 參考王麗波等[13]的方法，略有修改。稱取3 g辣木籽粉（精確到0.0001 g），量取45 mL水，在溫度為90℃下提取4 h；趁熱抽濾，取上清液與Sevage試劑混合（脫蛋白），振搖30 min后離心：3500 r/min離心15 min，取上清液醇沉24 h，于20℃ 9000 r/min離心10 min，棄上清液，取沉淀加蒸餾水定容至100 mL，以苯酚硫酸法測吸光度，根據標準曲線計算多糖得率。

1.2.5 辣木籽多糖清除DPPH自由基的測定 參考王麗波等[13]的方法。取多糖溶液2 mL于試管中，加入2 mL 0.3 mol/L DPPH，于暗處反應30 min，在517 nm波長處測定吸光度（i）；再取上述2 mL多糖液，加入無水乙醇2 mL，反應30 min，在517 nm 波長處測定吸光度（j）；取DPPH 2 mL，加入無水乙醇2 mL，反應30 min測定吸光度（0）。每個濃度的樣品測定3次，然后取平均值。以VC作陽性對照。DPPH自由基清除率計算公式如下：

1.2.6 辣木籽多糖清除羥自由基的測定 參考WANG等[14]的方法。根據鄰二氮菲-鐵離子-過氧化氫體系，取2.0 mL pH為7.4的0.05 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）于試管中，加1.5 mL 0.005 mol/L鄰二氮菲溶液后充分混合均勻，加1.0 mL 0.0075 mol/L硫酸亞鐵溶液，立刻混合均勻，再加1.0 mL 0.1%過氧化氫，最后用蒸餾水補定容至10 mL，反應液置于37℃的水浴鍋中保溫1 h，于536 nm處測吸光度，按1.2.5方法，分別加入不同濃度多糖溶液，37℃水浴鍋中保溫1 h，測吸光度。羥自由基清除率計算公式如下：

式中，損傷為加過氧化氫未加樣品所測得的吸光度，加樣為加過氧化氫和樣品所測得的吸光度，未損傷為未加過氧化氫和樣品所測得的吸光度。

1.2.7 辣木籽多糖總抗氧化性（T-AOC）的測定 參照試劑盒說明書及相關操作測定。FRAP法測定辣木籽水溶性多糖的總抗氧化能力的原理是在酸性條件下抗氧化物質可以還原Fe3+-TPTZ產生藍色的Fe2+-TPTZ，在593 nm處讀取吸光度可以計算出樣品中的總抗氧化能力。首先把試劑1、試劑2、試劑3按10∶1∶1比例配成FRAP工作液，避光37℃保溫，現配現用。稱取27.8 mg的FeSO4·7H2O，溶解后定容至1 mL，此時濃度為100 mmol/L。取上述配好的FeSO4·7H2O溶液稀釋至0.15、0.30、0.60、0.90、1.20 mmol/L。最后按照說明書添加試劑到96孔板，在37℃下孵育5 min，最后置于酶標儀測定各孔值（即吸光度）。

1.3 數據處理

試驗數據重復測定3次，結果以平均值±標準偏差表示。采用Excel軟件等對實驗數據進行處理與分析。

2 結果與分析

2.1 多糖標準曲線的制作

以吸光度為縱坐標，標準葡萄糖溶液濃度為橫坐標，所得其線性回歸方程為=0.9221– 0.0029，相關系數為0.9992（圖1），說明在測定的濃度范圍內，標準曲線線性關系較好、準確度高，可以用于辣木籽多糖含量的測定。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 辣木籽多糖超高壓輔助提取單因素試驗

2.2.1 壓力對辣木籽多糖超高壓輔助提取的影響 由圖2可知，多糖提取得率在處理壓力為100 MPa時達到最高，在50～100 MPa時提取得率隨壓力的增大而增大；在100～400 MPa時提取得率隨壓力的增大而減小?；诔邏禾崛≡?，在小于100 MPa時，壓力越大，超高壓提取的效果越顯著（<0.05）；在大于100 MPa時，由于壓力過大，辣木籽細胞膜結構有所損壞，再增加壓力，反而有部分水溶性雜質被釋放出來，同時，辣木籽多糖黏度也會提高，從而使擴散速率降低，在卸壓的時候無法隨著滲透壓將細胞內的多糖物質輸送出去，因此多糖得率有所下降。

圖2 提取壓力對辣木籽多糖得率的影響

2.2.2 時間對辣木籽多糖超高壓輔助提取的影響 由圖3可知，在前2 min內隨著保壓時間的增加，辣木籽水溶性多糖的提取得率逐漸增加，2 min后隨時間的增加辣木籽多糖得率呈緩慢下降趨勢，下降幅度不大，在2 min時提取得率最大，其余時間均高于保壓0 min（升壓后立即泄壓）的結果。其原因可能是隨著保壓時間的增加，在長時間的超高壓處理下，辣木籽細胞膜通透性變差，影響了卸壓時多糖的滲透速度。

圖3 時間對辣木籽多糖得率的影響

2.2.3 料液比對辣木籽多糖超高壓輔助提取的影響 由圖4可知，辣木籽水溶性多糖的提取得率隨著料液比的增加呈先輕微增加而后逐漸降低的趨勢，在1∶20時達到最高得率；而1∶20和1∶15兩個條件下的多糖得率相差不大，無明顯差異（<0.05），可能是在此范圍內能提取到的多糖量基本上達到最大，多糖得率無明顯變化。料液比在1∶20～1∶40之間，隨著溶劑量的減少，卸壓時所提供的滲透壓增大，同時，水溶性多糖基本完全溶出，如再繼續(xù)增加溶劑量，多糖量不變，而溶劑會增加，故其濃度反而會降低。

圖4 料液比對辣木籽多糖得率的影響

2.2.4 粉碎度對辣木籽多糖超高壓輔助提取的影響 由圖5可知，粉碎度在20～80目篩之間，超高壓提取辣木籽水溶性多糖得率基本無變化，100目篩粉碎度時辣木籽多糖得率最高，可能是由于在一定范圍內，高壓對多糖的溶出影響不大，超出范圍后樣品經過過細粉碎后，增大了與溶劑的接觸面積，更有利于多糖的提取和溶出。

圖5 粉碎度對辣木籽多糖得率的影響

2.3 超高壓輔助提取辣木籽多糖工藝優(yōu)化

單因素試驗結果表明，粉碎度對超高壓提取辣木籽水溶性多糖的得率影響變化不大，基于單因素試驗結果，采用三因素三水平L9(34)正交表設計實驗優(yōu)化方案，考察壓力、保壓時間和料液比對辣木籽多糖提取得率的影響，結果如表2所示。從表2的極差分析可知，影響辣木籽多糖提取率的因素主次順序為料液比（C）＞保壓時間（A）＞壓力（B），即對辣木多糖提取得率影響因素最大的是料液比，其次是時間，最后是壓力，根據正交試驗結果得出最優(yōu)提取工藝參數組合為A3B2C1，即保壓時間6 min，料液比1∶15，提取壓力100 MPa。

優(yōu)化后的最優(yōu)組合存在于正交試驗組中，最優(yōu)條件下辣木籽多糖的得率為0.345%，在上述最優(yōu)工藝條件下經驗證得到辣木籽多糖得率為0.346%±0.005%，與正交試驗方案的結果基本一致，所以可認為該工藝條件為最優(yōu)工藝條件。

表2 正交試驗方案及結果

2.4 辣木籽多糖超高壓輔助提取與熱水提取比較分析

由圖6可知，辣木籽多糖通過熱水提?。弦罕?∶15，90℃下提取4 h）得率為0.296%± 0.006%，而超高壓輔助提取在最優(yōu)條件下（料液比1∶15，保壓時間6 min，提取壓力100 MPa）的辣木籽多糖得率為0.345%±0.005%。通過比較可知，在相同的料液比下，超高壓輔助提取用時僅需6 min，提取結果明顯高于熱水提取4 h的結果（<0.05），可見，超高壓輔助提取與熱水提取相比可大大縮短提取時間、提高提取效率，而且在常溫下提取對辣木籽多糖的結構和性質影響相對較小。

圖6 提取方法對辣木籽多糖的提取效果的影響

2.5 辣木籽多糖的抗氧化活性測定

2.5.1 辣木籽多糖清除DPPH自由基能力 辣木籽多糖對DPPH自由基的清除能力如圖7所示。由圖7可知，在0.02～1.00 g/L多糖濃度范圍內，辣木籽多糖對DPPH自由基的清除效果與濃度有較好的量效關系，多糖濃度（）與清除率（）的回歸線性方程為=748+16.566，相關系數為0.962。測得辣木籽多糖清除DPPH自由基的IC50值為0.0439 g/L，在相同濃度情況下，Vc對DPPH自由基的清除率均高于辣木籽多糖，VC清除DPPH自由基的IC50值為0.0088 g/L。以上結果表明，辣木籽多糖具備一定的DPPH自由基清除能力，但是低于相同濃度下VC對DPPH自由基的清除能力。

圖7 辣木籽多糖對DPPH自由基的清除結果

2.5.2 辣木籽多糖清除羥自由基能力 辣木籽多糖對羥自由基清除能力如圖8所示。由圖8可知，辣木籽多糖的清除率與濃度成正比，多糖濃度（）與清除率（）的回歸線性方程為=215.66+ 14.071，相關系數為0.9946。根據數據測得辣木籽多糖清除羥自由基的IC50約為0.1666 g/L，VC清除羥自由基的IC50約為0.1873 g/L，在低濃度條件下（<0.045 g/L），辣木籽多糖清除羥自由基能力高于同濃度的VC，高濃度條件下（>0.045 g/L），辣木籽多糖清除羥自由基能力低于同濃度的VC。

2.5.3 辣木籽多糖總抗氧化能力 由圖9可知，標準曲線的線性關系較好，其線性回歸方程為=0.1349+0.0805，相關系數為0.9983，說明在測定的濃度范圍內，標準曲線線性關系較好。

相同條件下測3次辣木籽多糖樣品，其吸光度為0.087，由公式求得，其值對應的硫酸亞鐵標準溶液濃度為0.0482 mmol/L，即辣木籽多糖溶液的總抗氧化能力為0.0482 mmol/L（以硫酸亞鐵的當量濃度表示）。

圖8 辣木籽多糖對DPPH自由基的清除結果

圖9 試劑盒測定用硫酸亞鐵的標準曲線

3 討論

辣木多糖為辣木中重要的有效成分之一，目前，對辣木多糖的提取、分離和功能研究的相關報道較少，孫鳴燕[8]研究了辣木葉多糖的提取工藝條件，不同方法的辣木葉多糖提取率在17.10%～20.17%之間，其中超聲波提取法的多糖得率最高，水提法的多糖得率最低，5種方法提取的多糖量差異均達到極顯著水平；CHEN等[10]研究了微波輔助提取辣木籽葉多糖的工藝條件，該工藝條件下多糖提取率僅有2.96%?？梢姡煌崛》椒▽蹦救~中的多糖提取效果差別較大。董成國[9]研究了辣木籽水溶性多糖的熱水提取工藝，其提取率比本研究結果高，可能與原料預處理方法及不同產地原料有關。

辣木多糖具有較好的抗氧化活性，董成國[9]對提取的辣木籽多糖進行純化后再測定其抗氧化活性，分離得到的3種多糖組分抗氧化活性（清除羥自由基IC50均大于10 g/L）低于本研究結果，可見，超高壓輔助提取的辣木多糖抗氧化活性更高，超高壓技術對多糖活性影響較小，可以更好地保持多糖的抗氧化活性。本研究首次通過超高壓提取技術提取辣木籽多糖并對其抗氧化活性進行分析，與熱水提取法相比，超高壓輔助提取的辣木籽多糖的得率更高，且具有較好的抗氧化活性，本研究為進一步開發(fā)利用辣木資源奠定基礎，同時為辣木資源的高值化利用提供參考。

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Ultra-high Pressure Assisted Extraction and Antioxidant Activity of Polysaccharide fromSeeds

WANG Biaoshi1,2, HUANG Haoyang1, TAN Wenhui1, LIU Shumin1,2, ZHANG Shiqi1,2, HAN Zhiping1,2, PENG Yuanhuai1,2

1. School of Food Science and Engineering, Lingnan Normal University, Zhanjiang, Guangdong 524048, China; 2. Guangdong Engineering and Technology Research Center of Development and Utilization of,Zhanjiang, Guangdong 524048, China

Ultra-high pressure assisted extraction (UHP) is a new green and high efficient extraction technology for natural products, and the biological activity of the natural products can be kept as much as possible. Withseeds powder as the experimental material, the water-soluble polysaccharide was extracted by a new ultra-high pressure assisted extraction technology. The antioxidant activities of the water-soluble polysaccharide fromseed were evaluated by the total antioxidant capacity and DPPH and hydroxyl radicals scavenging ability. Taking the yield of polysaccharide as an evaluation index, the effects of pulverization degree, pressure, pressure holding time and ratio of material to liquid on the yield of water-soluble polysaccharide fromseed were investigated by the single factor experiment method. The orthogonal experiment design method was used to get the optimum ultra-high pressure assisted extraction conditions of polysaccharide fromseed. The experiment results showed that the optimum technological conditions of the polysaccharide fromseed were determined as follows: holding pressure of 6 min, solid-liquid ratio of 1∶15 (g/mL), extraction pressure of 100 MPa and degree of pulverization of 100 mesh. The yield of the polysaccharide fromseed under this optimum condition was 0.346%. The experiment results also showed that the scavenging abilities for DPPH and hydroxyl radicals increased with the increase of concentration of the polysaccharide fromseed and there was a good linear relationship between concentration of the polysaccharide fromseed and the radical scavenging ability. The IC50(the concentration when the radical scavenging rate is 50%) of the polysaccharide fromseed for DPPH and hydroxyl radicals was 0.0439 g/L and 0.1666 g/L respectively, and the antioxidant ability was lower than that of Vc at the same concentration, which indicated that the water-soluble polysaccharide fromseed had certain antioxidant capacity within a certain concentration range. The total antioxidant capacity of the water-soluble polysaccharide fromseed was 0.0482 mmol/L (Expressed as the equivalent concentration of FeSO4). The water-soluble polysaccharide fromseedcan be extracted effectively in lower temperature and shorter time by ultra-high pressure assisted extraction technology compared with hot-water extraction method and the water-soluble polysaccharide fromseedhas good antioxidant activities and can be exploited and used as a natural antioxidant. The results of this study could provide technical support and reference for the exploration of natural antioxidant and the development and high value comprehensive utilization of.

seeds; polysaccharide; ultrahigh pressure assisted extraction; antioxidant activity

S202.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.10.020

2022-02-15；

2022-03-12

廣東省自然科學基金項目（No. 2022A1515010360）；中央財政支持地方高校發(fā)展專項資金項目（No. 0003018015）；嶺南師范學院自然科學基金項目（No. ZL1817）。

王標詩（1980—），男，博士，副教授，研究方向：農副產品深加工及綜合利用。E-mail：hang_kong2002@163.com。