胡少震,李蓮瑞
1 塔里木大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300
2 塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300
3 塔里木畜牧科技兵團重點試驗室,新疆阿拉爾 843300
關(guān)鍵字:變質(zhì)原料乳;假單胞菌;分離鑒定;蛋白酶活力
原料乳是各種乳制品的基本原料,其質(zhì)量是保證乳制品安全的關(guān)鍵因素[1]。原料乳中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),是天然的微生物培養(yǎng)基,極適合微生物的生長繁殖[2]。隨著冷鏈技術(shù)在食品運輸中的廣泛應(yīng)用,嗜熱鏈球菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等一些嗜溫、嗜熱微生物生長受到抑制,而具有嗜冷特性的細菌可以在低溫下繼續(xù)生長,成為原料乳中的優(yōu)勢菌[3],該菌可通過在MPC瓊脂板上6.5 ℃培養(yǎng)10 d進行靶向分離。假單胞菌作為原料乳的主要污染嗜冷菌,80%的假單胞都攜帶aprX基因位點[4],該基因可以表達胞外金屬蛋白酶,這些酶具有熱不敏感性,即使通過135 ℃ 1 min熱處理,酶殘留率仍超過20%以上[5],這些殘留的蛋白酶會導(dǎo)致乳制品在貨架期出現(xiàn)乳樣變酸、乳清析出、蛋白聚集、脂肪上浮等不良現(xiàn)象,嚴重破壞乳品品質(zhì),造成巨大的經(jīng)濟損失[6]。本研究通過對變質(zhì)原料乳中嗜冷微生物分離鑒定,明確造成原料乳發(fā)生質(zhì)量問題的關(guān)鍵微生物,并測定了其蛋白酶活力,對原料乳的變質(zhì)機理提供一定的理論參考。
1.1.1 試劑
異常原料乳樣品:出現(xiàn)蛋白水解、脂肪上浮、變酸等現(xiàn)象,用于污染菌株的分離鑒定,由廣東省恒遠市規(guī)?;翀鎏峁?。
培養(yǎng)基:MPC瓊脂培養(yǎng)基,北京依珊匯通科技有限公司;LB液體培養(yǎng)基、脫脂乳瓊脂培養(yǎng)基,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
試劑:蛋白胨鹽溶液,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;細菌基因組提取試劑盒、Lysozyme (50 mg/mL)、Trans2K? Plus II DNA Marker、2x Taq PCR Master Mix,天根生化科技(北京)有限公司;瓊脂糖、GeneGreen核酸染料,金連寶生物技術(shù)(北京)有限公司;PBS 緩沖液(50 mmol/L)、溴酚藍、β-巰基乙醇、2x Laemmli Sample Buffer、甲醇、冰醋酸、考馬斯亮藍有R-250,北京廣達恒益科技有限公司;偶氮酪蛋白,上海源葉生物科技有限公司;SurePAGE, Bis-Tris, 10%, 10 wells、Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder,南京金斯瑞生物科技有限公司。
偶氮酪蛋白(15 g/L):取0.15 g偶氮酪蛋白用10 mL無菌水定容。
考馬斯亮藍溶液:稱取0.125 g考馬斯亮藍R-250溶于dd H2O中,加入30 mL甲醇,10 mL冰醋酸,最后加ddH2O定容至100 mL。
脫色液:甲醇30 mL,冰乙酸10 mL,加dd H2O至100 mL。
1.1.2 設(shè)備
超凈工作臺,北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海恒科技有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;水浴鍋,寧波新芝科技有限公司;ABI 9700 PCR儀,ThermoFisher公司;高速臺式冷凍離心機,北京維根技術(shù)有限公司;TACAN全波長酶標(biāo)儀,帝肯(上海)貿(mào)易有限公司。
1.2.1 原料乳中蛋白質(zhì)的水解測定
通過SDS-PAGE凝膠電泳對原料乳中蛋白質(zhì)水解進行測定[7],具體方法如下:
樣品準(zhǔn)備:(1)a液:原料乳與去離子水按照1∶15混合為樣品處理液(a液)。(2)b液:溴酚藍與β-巰基乙醇按照1∶1混合。(3)c液:b液與2x Laemmli Sample Buffer 按照1∶1混合。(4) d液:c液與樣品處理液(a液)各取20 μL混合。(5)將上述d液于水浴鍋中100 ℃加熱5 min,備用。
電泳:將加熱處理后的d液用移液槍吸取10 μL在SurePAGE, Bis-Tris,10%,10 wells中進行點樣,點樣后放置在Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder中110 V電泳30 min。
染色,洗脫:使用Coomassie亮藍溶液對凝膠進行染色1 h,脫色液過夜脫色。
1.2.2 原料乳中假單胞的分離純化鑒定
樣品處理:為保證平板上長出單一菌落,將變質(zhì)原料乳按10倍梯度連續(xù)稀釋3 次,將稀釋后樣品均勻涂布在MPC瓊脂板培養(yǎng)基上,6.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d。
分離純化:將大小形態(tài)不一樣的單菌落于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)48 h,連續(xù)培養(yǎng)兩代,對分離的細菌進行制片,革蘭氏染色,觀察其形態(tài)。此外,把生長為對數(shù)期的菌株用25%(v/v)的甘油保存至-20 ℃冰箱。
DNA提取:按照細菌基因組提取試劑盒說明書提取培養(yǎng)細菌的DNA,放置-20 ℃冰箱保存。
P C R擴增:利用上述提取的基因組作為模板,1 6 S r D N A通用引物(2 7 F:5' - AGAGTTGATCCTGGCTCAG - 3' 和 1492R: 5' - CGGTACCTTGTTACGACTT - 3')進行細菌16S rDNA全長的擴增。擴增體系和條件如表1、圖1所示,擴增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司測序。
圖1 PCR擴增條件
表1 PCR擴增體系
序列比對:將測序序列進行拼接,完整的16S rDNA序列在NCBI上進行核苷酸序列比對,確定該菌的種屬。
1.2.3 蛋白酶活力檢測
本試驗分別采用10%的脫脂奶粉平板對菌液中蛋白酶進行可視化檢測,偶氮酪蛋白法對菌液中蛋白酶活力進行定性檢測[8]。
蛋白酶的可視化檢測:(1)菌株的活化:將甘油保存的菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)24 h,傳代兩次。(2)脫脂乳平板的配置:稱取10 g脫脂奶粉,1.5 g瓊脂粉于錐形瓶中加去離子水至100 mL,115 ℃滅菌10 min,倒平板備用。(3)菌液的接種:滅菌的牛津杯放置平板中,吸取200 μL菌液接種牛津杯中,將平板放入28 ℃培養(yǎng)箱中24 h,觀察其水解圈。
蛋白酶殘留率測定:(1)將活化后菌液經(jīng)135 ℃加熱5 s,熱處理后立即冰浴,用于蛋白酶耐熱性研究,對照組為未熱處理的菌液。(2)各取100 μL熱處理菌液和未處理菌液于2 mL無菌離心管中。(3)分別加入500 μL PBS 緩沖液(50 mmol/L),100 μL偶氮酪蛋白溶液(15 g/L)振蕩混勻,37 ℃反應(yīng)60 min。(4)加入500 μL TCA(0.2 g/mL)室溫下靜置 30 min終止反應(yīng)后。(5)將終止反應(yīng)液于10 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min。(6)取100 μL上清至96孔板中,對照組采用100 μL無菌 PBS代替上清液,在366 nm下將96孔板于酶標(biāo)儀中測定吸光值。
蛋白酶耐熱性以酶活殘余率表示,酶活殘余率(RA)按照下述公式進行計算:
其中,RA:酶活殘余率(%);HA:熱處理后蛋白酶活力(ΔΑ/h·mL);IA:未處理初始蛋白酶活力(ΔΑ/h·mL);蛋白酶活以每毫升的粗酶液每小時吸光度的增加值表示(ΔΑ/h·mL)。
通過SDS-PAGE凝膠電泳對變質(zhì)原料乳中的蛋白進行表征,結(jié)果如圖2所示。其中,變質(zhì)原料乳的乳鐵蛋白、血清白蛋白無電泳條帶,κ-酪蛋白電泳條帶極其淺,ɑ-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳白蛋白、ɑ-乳白蛋白有較清晰的電泳條帶。結(jié)果表明乳鐵蛋白、血清白蛋白已經(jīng)完全被水解,K-酪蛋白、β-乳白蛋白、ɑ-乳白蛋白有部分被水解,說明原料乳中微生物產(chǎn)生的蛋白酶較復(fù)雜,含有多個蛋白的識別位點,可將多種蛋白質(zhì)水解成多種氨基酸小分子物質(zhì)[9]。
圖2 原料乳蛋白質(zhì)水解圖
將原料乳進行梯度稀釋后,6.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d,結(jié)果如圖3所示。菌落比較單一,菌落形態(tài)為白色、表面光滑、隆起、有光澤、不透明。挑取兩株菌(S1、S2)28 ℃培養(yǎng)24 h,傳代兩次革蘭氏染色如圖4,該菌株為革蘭氏陰性菌、形狀為短桿狀。
圖3 菌落形態(tài)
圖4 革蘭氏染色結(jié)果
提取分離菌株的DNA,用細菌通用引物16S rDNA對其擴增,PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖5。該菌的16S rDNA 基因大小約為1 500 bp,與預(yù)期大小相符,送至北京六合華大基因科技有限公司測序。
圖5 電泳結(jié)果
將測序序列在NCBI上進行核苷酸序列比對,判定分離菌株的物種,比對結(jié)果見表2,兩株分離菌株均為霍氏假單胞菌。通過對提交的序列進行進化樹的繪制,如圖6所示。該菌株與登陸號為NR_024911.1霍氏假單胞菌序列相似度為100%,可以確定這兩株分離菌株為霍氏假單胞菌。
表2 兩株菌BLAST結(jié)果
圖6 分離菌株的進化樹
圖7為霍氏假單胞菌的可視化鑒定結(jié)果,該菌株的水解圈為(15.35±0.56)mm。通過135 ℃加熱5 s后,蛋白酶殘留率為43.63%,說明該菌產(chǎn)生的蛋白酶即使經(jīng)過高溫鈍化仍保持較高的酶活力,它的存在會水解乳中的蛋白質(zhì),造成一定的質(zhì)量問題,因此應(yīng)該加大對該菌的防控。
圖7 蛋白酶對脫脂乳的水解圈
隨著冷鏈技術(shù)在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,嗜溫微生物生長受到抑制。嗜冷菌在長期進化中通過膜蛋白的磷酸化、去磷酸化等體內(nèi)的一切復(fù)雜代謝反應(yīng)完成對溫度的感知,減少冷休克蛋白生產(chǎn),防止非必要的蛋白生成,可以在低溫下生長,成為原料乳的優(yōu)勢菌[10]。目前,已有人從低溫冷藏的原料乳中鑒定出隸屬于61 個屬169 個種的分離株,其中假單胞菌為主要的嗜冷菌[11]。它可以分泌一些胞外蛋白酶,這些酶具有熱不敏感性,即使通過高溫處理仍有較高的酶殘留率,會對長期保存的乳及乳制品持續(xù)破壞,出現(xiàn)凝膠、沉淀、苦味或酸味等現(xiàn)象[12]。
原料乳隨著保存時間的延長,假單胞菌的豐度不斷升高。大多數(shù)假單胞菌的存在會產(chǎn)生水解原料乳的蛋白酶,且該菌株的總數(shù)和蛋白酶活力呈現(xiàn)正相關(guān)[13]。徐煜等[14]對原料乳中嗜冷菌進行分離鑒定及蛋白酶活力檢測,結(jié)果顯示,在分離到的假單胞菌中,66.67%(36/54)假單胞菌都能產(chǎn)生胞外蛋白酶,并且所產(chǎn)的蛋白酶都有一定的耐熱能力,將分離鑒定的假單胞菌按照濃度為103CFU/mL接種到脫脂奶中,6 ℃培養(yǎng)5 d就能使脫脂乳溶液產(chǎn)生沉淀。本試驗結(jié)果與前人相似,變質(zhì)原料乳中分離到的微生物為霍氏假單胞菌,并且該菌有較強的蛋白水解能力。因此,原料乳變質(zhì)的原因可能是該菌產(chǎn)生的胞外蛋白酶分解乳中的蛋白質(zhì),從而使原料乳出現(xiàn)蛋白水解現(xiàn)象。牧場應(yīng)加大對假單胞菌的防范措施。
本試驗通過對變質(zhì)原料乳中的微生物進行分離、純化、鑒定,發(fā)現(xiàn)可能引發(fā)原料乳變質(zhì)的細菌為霍氏假單胞菌,并且該菌有較強的蛋白水解能力。