孫雪婷，李國(guó)偉，華文浩，李瑞士

（南通海關(guān)，江蘇 南通 226299）

在動(dòng)植物體內(nèi)生命代謝活動(dòng)中具有很多相同的酶，在不同物種體內(nèi)發(fā)揮著不同的作用。如4-羥苯基丙酮酸雙氧化酶（4-hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase，HPPD）參與了酪氨酸(Tyrosine)代謝，但大多數(shù)生物體內(nèi)前兩步代謝是相同的，即生物體內(nèi)的酪氨酸在酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Tyrosine aminotransferase，TAT)的作用下生成對(duì)羥基苯基丙酮酸（4-hydroxyphenylpyruvate，HPP），HPPD 進(jìn)一步催化HPP 轉(zhuǎn)化為尿黑酸（2,5-dihydroxyphenylacetate,HGA）[1]。之后則根據(jù)物種不同分化出不同的代謝途徑，如分成哺乳動(dòng)物、植物及微生物代謝等。

在人體內(nèi)，HPPD 同樣也發(fā)揮著重要的生理功能，參與人體的酪氨酸和苯丙氨酸分解代謝。若酪氨酸的代謝過(guò)程受損，將產(chǎn)生一系列酪氨酸血病。Ⅰ型酪氨酸血癥是一種因延胡索酰乙酰乙酸酶缺乏引起酪氨酸代謝異常。其主要癥狀是肝功能衰竭、肝硬化，最終導(dǎo)致肝癌[2]。可喜的是，1992年，研究發(fā)現(xiàn)尼替西農(nóng)（2-(2-nitro-4-trifloromethylbenzoyl)-cyclohexane-1,3-dione，NTBC）可通過(guò)抑制HPPD 的活性進(jìn)而阻斷酪氨酸代謝通路，該酶的抑制劑NTBC 臨床上已經(jīng)應(yīng)用于治療酪氨酸病。該藥由瑞典Swedish Orphan 公司推出，于2002年4月開(kāi)始在美國(guó)上市，對(duì)患有Ⅰ型酪氨酸血癥及尿黑酸尿癥病人有較顯著的療效，可明顯減輕對(duì)肝臟、腎臟和心臟的毒害癥狀[3]。

在植物體內(nèi)，如果對(duì)羥苯基丙酮酸（HPP）轉(zhuǎn)化為尿黑酸（HGA）的過(guò)程被抑制，導(dǎo)致質(zhì)體醌和生育酚的合成受阻[4-5]。質(zhì)體醌和生育酚是光合作用中電子傳遞所需要的重要物質(zhì)。其中，生育酚是植物生長(zhǎng)所必須的抗氧化劑；此外，質(zhì)體醌還是八氫番茄紅素去飽和酶的關(guān)鍵輔助因素，質(zhì)體醌的減少使八氫番茄紅素去飽和酶的催化作用受阻，從而影響類(lèi)胡蘿卜素的生物合成。質(zhì)體醌是光合作用中電子傳遞的關(guān)鍵輔因子，它使電子從光合系統(tǒng)Ⅱ到達(dá)光合系統(tǒng)Ⅰ，從而將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能，而類(lèi)胡蘿卜素則保護(hù)植物免受日光的傷害。類(lèi)胡蘿卜素既可作為光吸收體，又可作為保護(hù)性物質(zhì)，降低三線態(tài)葉綠體或單線態(tài)氧的激發(fā)，胡蘿卜素的生物合成被抑制，出現(xiàn)白化癥狀，最終將導(dǎo)致植物最終死亡[6-7]。據(jù)此，很多HPPD 類(lèi)除草劑已被商業(yè)化，如先正達(dá)公司于2001年上市的硝磺草酮在全球范圍內(nèi)廣泛使用，其2019年銷(xiāo)售額高達(dá)7.8 億美元[8]。

最近，先正達(dá)公司吡唑萘菌胺因生殖毒性被歐盟撤銷(xiāo)登記，引起了人們對(duì)農(nóng)藥分子生殖毒性的廣泛關(guān)注。HPPD 在動(dòng)植物體生命活動(dòng)中均發(fā)揮著重要的作用，無(wú)論是醫(yī)藥領(lǐng)域還是農(nóng)藥領(lǐng)域，世界各大公司都一直在進(jìn)行深入研究。在農(nóng)藥中，拜耳公司在專(zhuān)利WO2015135946A1 中報(bào)道了一種新型雜環(huán)酰胺類(lèi)化合物，其在作用機(jī)制上也屬于HPPD 抑制劑類(lèi)除草劑[9]。本文從拜耳公司的專(zhuān)利 WO 2012126932A1 中選取一個(gè)列表化合物[10]，編號(hào)為2-235（本文中的CP531），來(lái)研究這種新型HPPD類(lèi)抑制劑在動(dòng)物體內(nèi)代謝以及對(duì)動(dòng)物體的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由遼寧長(zhǎng)生生物科技有限公司提供 SPF 級(jí)C57BL/6 雌性小鼠，體重18～25 g。所有小鼠染毒前適應(yīng)性喂養(yǎng)及檢疫一周，均在SPF 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，控制相對(duì)濕度為50%～70%，溫度為（23±2）℃，明暗周期為12 h∶12 h，自由進(jìn)食飲水，所有動(dòng)物處理均按照動(dòng)物機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)的指導(dǎo)執(zhí)行。

1.1.2 主要試劑與儀器

BCA 蛋白定量試劑盒，Solarbio 公司；重組Anti-G-protein coupled receptor 30 抗體，美國(guó)abcam公司；Estrogen Receptor alpha 抗體（D-12），美國(guó)santa 公司；Estrogen Receptor beta 抗體，美國(guó)Gene Tex 公司；β-actin 單克隆抗體，美國(guó)abcam 公司；ECL 顯影液，美國(guó)Millipore 公司；蛋白Marker，美國(guó)thermo 公司；RIPA 蛋白裂解液，上海碧云天公司；PMSF，上海碧云天公司；過(guò)硫酸胺（ammonium persulfate,APS），上海碧云天公司；脫脂奶粉，Solarbio 公司；HE 染色試劑盒，Solarbio 公司；電鏡固定液，武漢賽維爾公司；30%聚丙烯酰胺，Solarbio公司；姬姆薩染液，Solarbio 公司；ELISA 試劑盒，Elabscience 公司；PVDF 膜，美國(guó)Millipore 公司；一抗稀釋液，上海碧云天公司；二抗稀釋液，上海碧云天公司；甘氨酸，上海碧云天公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris），上海碧云天公司；十二烷基苯磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate,SDS），上海碧云天公司。

環(huán)氧樹(shù)脂包埋套裝，北京中鏡科儀技術(shù)有限公司；醋酸雙氧鈾，北京中鏡科儀技術(shù)有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-red 公司；電泳儀，美國(guó)Bio-red 公司；轉(zhuǎn)膜夾，美國(guó)Bio-red 公司；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，美國(guó)thermo 公司；倒置顯微鏡，日本NiKon公司；透射電子顯微鏡，日本JEOL 公司；全自動(dòng)脫水包埋一體機(jī)（YB-6LF），孝感市亞光醫(yī)用電子科技公司；萊卡旋轉(zhuǎn)式超薄切片機(jī)（M2135），德國(guó)萊卡公司；萊卡攤片機(jī)（HI1210），德國(guó)萊卡公司；萊卡烘片機(jī)，德國(guó)萊卡公司；臺(tái)式低溫水平離心機(jī)（TDL-5000bR），上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.1.3 主要試劑配制

1）70%乙醇：取70 mL 無(wú)水乙醇，加入30 mL高壓滅菌后的純水，于常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2）80%乙醇：取80 mL 無(wú)水乙醇，加入20 mL高壓滅菌后的純水，于常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

3）90%乙醇：取90 mL 無(wú)水乙醇，加入10 mL高壓滅菌后的純水，于常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

4）95%乙醇：取95 mL 無(wú)水乙醇，加入5 mL高壓滅菌后的純水，于常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

5）1×PBS 緩沖液：取出一小袋PBS 粉末溶于雙蒸水（900 mL），普通玻璃棒輔助攪拌使其溶解充分，添加雙蒸水補(bǔ)足終末體積為1 000 mL，調(diào)整pH 值為7.2～7.4。

6）10×電泳液：稱(chēng)取甘氨酸144 g，Tris 30 g，SDS 10 g，全部加入到三蒸水（900 mL）中至完全溶解，繼續(xù)加入三蒸水補(bǔ)足終體積1 000 mL。臨用前需加三蒸水稀釋為1×電泳緩沖液即可。

7）10×電轉(zhuǎn)液：稱(chēng)取甘氨酸144 g，Tris 30.3 g，全部加入到三蒸水（900 mL）中至完全溶解，繼續(xù)加入三蒸水補(bǔ)足終體積1 000 mL。臨用前按三蒸水∶甲醇∶10×電轉(zhuǎn)液=7∶2∶1 的體積稀釋為1×電轉(zhuǎn)液即可。

8）10%過(guò)硫酸胺（APS）：將過(guò)硫酸胺（1 g）充分溶于三蒸水（10 mL）配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%過(guò)硫酸胺待用。

9）5%脫脂奶粉：稱(chēng)取脫脂奶粉（0.5 g）溶解于新鮮1×TBST（10 mL）溶液中，充分溶解后待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、染毒及處理

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置以下組別：對(duì)照組（玉米油溶劑）、CP531 低劑量組（14 mg·kg-1）、CP531 中劑量組（68 mg·kg-1）、CP531 高劑量組（340 mg·kg-1）。采取每日同一時(shí)間段染毒，分別持續(xù)灌胃染毒28 d和90 d，灌胃體積均為10 mL·kg-1（化合物溶于玉米油）。染毒期間密切觀察小鼠染毒后癥狀及生長(zhǎng)發(fā)育情況，每日灌胃前記錄小鼠體重計(jì)算染毒前后體重增長(zhǎng)并調(diào)整灌胃劑量。

所有小鼠于末次染毒后禁食不禁水12 h，眼球取血，收集血液標(biāo)本于非抗凝管中，放置2～3 h，3 000 r·min-1離心15 min，分離血清放入-80 ℃冰箱，用于測(cè)定小鼠血清中激素水平；取血后迅速分離、采集小鼠子宮、卵巢并清除表面結(jié)締組織，臟器表面血污用生理鹽水洗凈，多余水分用濾紙吸干，精確稱(chēng)量臟器濕重，臟器系數(shù)以臟器濕重（g）/100 g動(dòng)物體重來(lái)表示；之后每組取小鼠子宮和卵巢組織于4%多聚甲醛中進(jìn)行固定用于病理檢查；取小鼠子宮和卵巢剪切成約0.1 cm3組織，于電鏡固定液中固定用于透射電鏡檢查；4 ℃保存待用；其余分裝并迅速轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)蛋白水平測(cè)定。

1.2.2 陰道脫落細(xì)胞采集

采用生理鹽水沖洗法于小鼠處死前10 d每日固定時(shí)間段，預(yù)先將生理鹽水倒入一次性平皿中，將所需的載玻片毛玻璃端提前標(biāo)記好編號(hào)。左手固定小鼠，將小鼠仰臥于手中，用10 μL 移液槍吸取無(wú)菌生理鹽水后插入小鼠陰道內(nèi)約2～3 mm 處，打入生理鹽水并抽吸1～2 次，觀察液體變渾濁后即可，涂于載玻片一端，自然風(fēng)干。注意不要插入太深，溫和的操作可以避免引發(fā)炎癥反應(yīng)。隨后浸泡在95%的乙醇溶液中固定15～20 min，室溫下晾干后進(jìn)行吉姆薩染色（8～10 min），最后在光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，按照雌性小鼠動(dòng)情周期判斷標(biāo)準(zhǔn)確定其不同階段：動(dòng)情前期（proestrus，P）、動(dòng)情期（estrus，E）、動(dòng)情后期（metaestrus，M）、動(dòng)情間期（anestrus，A）。動(dòng)情周期判斷標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 雌性小鼠動(dòng)情周期判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 ELISA 檢測(cè)CP531 化合物染毒小鼠血清激素水平

根據(jù)ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)小鼠血清中雌二醇激素（Estradiol，E2）、促黃體生產(chǎn)素（Luteinizing hormone，LH）、孕酮（Progesterone，P）、促卵泡生產(chǎn)激素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）的分泌水平。

1）使用前取出-80 ℃中凍存?zhèn)溆玫难?，于常溫解凍?/p>

2）設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔在已包被抗體的酶標(biāo)板。

3）用封板膜密封酶標(biāo)板，37 ℃孵育指定時(shí)間后甩盡酶標(biāo)板內(nèi)的液體。

4）加入生物素化抗體工作液，封板膜密封酶標(biāo)板，37 ℃孵育一定時(shí)間。

5）孵育完成后，甩盡孔內(nèi)液體，在干凈的吸水紙上拍干，然后每孔用1×洗滌緩350 μL 沖液洗滌酶標(biāo)板1 min，甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，拍干，重復(fù)此步驟3 次。

6）每孔加入100 μL 酶結(jié)合工作液，封板膜密封酶標(biāo)板，37 ℃孵育一定時(shí)間。

7）甩盡孔內(nèi)液體，洗板5 次。

8）每孔加入底物溶液（TMB）90 μL，置于37℃避光孵育15～30 min。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)（前4 個(gè)顯色孔出現(xiàn)明顯藍(lán)色梯度），即可終止。

9）每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)，藍(lán)色立即變成黃色。

10）立即用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm 測(cè)定各孔的光密度（OD）值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各血清樣品的濃度。

1.2.4 HE 染色檢查CP531 化合物對(duì)卵巢、子宮組

織病理學(xué)改變

1）脫水、包埋：將于4%多聚甲醛固定好的卵巢、子宮組織，按順序放入70%、80%、90%、95%、100%的梯度酒精中分別脫水，然后分別置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明40 min，用液體石蠟將其包埋后制備成蠟塊，冷卻凝固后備用。

2）切片貼片：用石蠟切片機(jī)將包埋好的小鼠卵巢、子宮石蠟塊切成厚度約為5μm 的切片，置于45 ℃水浴中待小鼠卵巢、子宮組織完全攤平后撈取切片，避免褶皺，置于37 ℃烘干箱中至水分烘干。

3）HE 染色：按照順序把切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ分別5 min 進(jìn)行脫蠟，100%酒精Ⅰ、Ⅱ、95%、80%、70%酒精各5 min 進(jìn)行脫水，后用流水一過(guò)性沖洗；蘇木精染核5 min，流水輕輕沖洗，稀鹽酸分化液分化3～5 s，流水沖洗反藍(lán)，伊紅染色3 min，依次放進(jìn)70%、80%、95%、100%酒精和二甲苯Ⅰ、Ⅱ各5 s 進(jìn)行脫水透明。脫水透明完成后將載玻片取下，滴加1～2 滴中性樹(shù)膠封片，室溫下保存。

4）顯微鏡下觀察拍照并分析組織病理學(xué)變化。

1.2.5 透射電鏡檢測(cè)CP531 化合物對(duì)卵巢、子宮超微結(jié)構(gòu)的影響

1）取電鏡固定液固定好的卵巢、子宮組織，經(jīng)30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的丙酮逐級(jí)脫水，其中在100%的丙酮中脫水3 次。

2）將脫水后的卵巢、子宮先后經(jīng)過(guò)比例為3∶1、1∶1、1∶3 的脫水劑和環(huán)氧樹(shù)脂滲透液，每步約30～60 min。完成后放入適當(dāng)?shù)哪ゾ咧?，灌上包埋液?jīng)過(guò)加溫聚合形成包埋塊，備下一步切片。

3）采用超薄切片機(jī)制備約50 nm 厚的超薄切片，漂浮于刀槽頁(yè)面上，再撈至銅網(wǎng)。分別使用醋酸鈾和枸櫞酸鉛室溫下染色15～20 min。

4）使用JEM-1400PLUS 透射電鏡觀察卵巢、子宮細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)CP531 化合物對(duì)卵巢、子宮雌激素受體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

1）卵巢、子宮組織總蛋白的提?。?80 ℃冰箱中取出約25 mg 的組織，加入適量的組織裂解液（每100 μL 的裂解液含1 μL 的PMSF），加入2顆研磨珠，充分研磨后置于冰上裂解1 h，4 ℃，12 000 r·min-1，離心5 min。取離心后上清至EP 管中即為細(xì)胞總蛋白，-80 ℃冰箱中保存待用。

2）蛋白濃度的測(cè)定：從-80 ℃冰箱中取出已提取的細(xì)胞總蛋白，室溫解凍。按照說(shuō)明書(shū)將標(biāo)準(zhǔn)品按0，2，4，8，12，16，20 μL 加入96 孔板中配制標(biāo)準(zhǔn)系列，各孔加PBS 補(bǔ)足20 μL。設(shè)置樣品孔，分別加入稀釋好的樣品20 μL，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。向各標(biāo)準(zhǔn)孔及樣品孔中加200 μL BCA 工作液（BCA∶Cu=50∶1），37 ℃孵育30 min，用酶標(biāo)儀于562 nm 處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品蛋白濃度。根據(jù)樣品蛋白濃度，使用PBS、1×上樣buffer 調(diào)整各樣品濃度，放入100 ℃的蛋白變性?xún)x10 min，使蛋白充分變性，-80 ℃冰箱中保存待用。

3）制備SDS 聚丙烯酰胺凝膠：安裝固定清潔的玻璃板于配膠裝置中，根據(jù)目的蛋白分子量大小選擇相應(yīng)濃度的分離膠進(jìn)行制膠，用移液槍將制備好的分離膠溶液小心的加入兩塊玻璃板的間隙中，直至液面達(dá)到綠色帶中間線高度后，在膠上面加入一層無(wú)水乙醇?jí)耗z及隔離空氣。待分離膠完全凝固后倒掉無(wú)水乙醇，接著再分離膠上加滿(mǎn)濃縮膠，立即插上梳子，靜止完全凝固后輕輕豎直向上拔出梳子并加入電泳液。

4）SDS-PAGE 凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜：按實(shí)驗(yàn)分組順序依次向加樣孔中加入蛋白Marker 和已制備好的蛋白樣品（上樣體積為10 μL）。連通電源，先用90 V 穩(wěn)壓電泳，使樣品壓成一條線且蛋白Marker開(kāi)始分離后，將電泳電壓換成120 V 繼續(xù)電泳，待溴酚藍(lán)跑到分離膠底部即可終止電泳。電泳即將結(jié)束半小時(shí)前，預(yù)先準(zhǔn)備好PVDF 膜（用甲醇活化）、轉(zhuǎn)膜夾等，并將其浸泡在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液中。電泳結(jié)束后小心剝出凝膠，依次按照（負(fù)極）海綿墊、凝膠、PVDF 膜、海綿墊（正極）的順序裝好在電轉(zhuǎn)夾中，同時(shí)加入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液以及冰塊，根據(jù)目的蛋白的分子量，調(diào)整合適的轉(zhuǎn)膜條件即可。

5）封閉、孵育抗體、顯影：轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，根據(jù)目的蛋白分子量大小將PVDF 膜相應(yīng)蛋白Marker 處剪下，完全浸泡在含有5%脫脂奶粉的TBST溶液中，置于搖床上緩慢水平搖動(dòng)，室溫封閉2 h。封閉結(jié)束后轉(zhuǎn)入TBST 溶液中，置于搖床上漂洗3 次×10 min·次-1，結(jié)束后放入配好的一抗中，放4℃冰箱中孵育過(guò)夜。次日取出PVDF 膜，用TBST 溶液漂洗3 次×10 min·次-1后，再放入相應(yīng)的二抗溶液中，搖床緩慢搖動(dòng)室溫孵育1 h，用TBST 溶液洗膜3 次，每次10 min。最后將PVDF 膜放在顯影機(jī)上，將配置好的顯影液均勻的滴到膜上，采用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集和條帶分析。各目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin 條帶灰度值的比值為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 確定染毒劑量

根據(jù)霍恩法檢測(cè)CP531 急性毒性，用半數(shù)致死劑量（Median lethal dose，LD50）表示，通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出CP531 兩種化合物L(fēng)D50 為6 810 mg·kg-1。對(duì)照農(nóng)藥毒性評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)判定以上化合物質(zhì)屬低毒類(lèi)。根據(jù)亞慢性毒性試驗(yàn)劑量選擇要求和研究分別設(shè)化合物高劑量組為340 mg·kg-1（1/20 LD50），再以5倍組距設(shè)中、低劑量組分別為68 mg·kg-1（1/100 LD50）、14 mg·kg-1（1/500 LD50）。使用體表面積（BSA）標(biāo)準(zhǔn)化方法計(jì)算得出本研究中使用的CP531 化合物劑量的人等效劑量（HED）分別為低劑量：1.14 mg·kg-1；中劑量為：5.51 mg·kg-1；高劑量為：27.57 mg·kg-1。

2.2 CP531 化合物短期（28 d）和長(zhǎng)期（90 d）染毒未出現(xiàn)嚴(yán)重的系統(tǒng)毒性

C57BL/6 小鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)后按體重進(jìn)行隨機(jī)分組，分為對(duì)照組、CP531 低劑量組、CP531 中劑量組、CP531 高劑量組。灌胃染毒28 d 和90 d。在染毒過(guò)程中未出現(xiàn)小鼠死亡及嚴(yán)重的中毒現(xiàn)象。于28 d 和90 d 取材前進(jìn)行體重稱(chēng)量。結(jié)果顯示在目前劑量下，無(wú)論是短期還是長(zhǎng)期染毒均不會(huì)對(duì)小鼠體重產(chǎn)生明顯影響（圖1），提示CP531 短期和長(zhǎng)期染毒不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的全身系統(tǒng)毒性。

2.3 CP531 化合物短期（28 d）和長(zhǎng)期（90 d）染毒對(duì)卵巢和子宮臟器系數(shù)影響

臟器系數(shù)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某臟器的重量與其體重之比，又稱(chēng)臟體比。臟器系數(shù)是毒理實(shí)驗(yàn)中常用的指標(biāo)。臟器系數(shù)增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；臟器系數(shù)減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。通過(guò)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在目前的染毒劑量下，CP531 短期重復(fù)劑量染毒（28 d）有降低卵巢和子宮臟器系數(shù)的趨勢(shì)（圖2），意味著短期染毒CP531有可能引起卵巢和子宮的萎縮及退行性改變的趨勢(shì)。其中，CP531 染毒中劑量組和高劑量組卵巢臟器系數(shù)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.4 CP531 化合物染毒改變小鼠動(dòng)情周期

在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死前10 d，通過(guò)每日陰道涂片，進(jìn)行吉姆薩染色觀察小鼠動(dòng)情周期變化情況。通過(guò)觀察和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠動(dòng)情周期為4～5 d，而CP531 化合物染毒28 d、90 d 后雌性小鼠動(dòng)情周期明顯延長(zhǎng)。其中CP531 染毒28 d 后，高劑量染毒后的動(dòng)情周期顯著長(zhǎng)于對(duì)照組（圖3，P＜0.05）；CP531 染毒90 d 后，中、高劑量染毒后的動(dòng)情周期顯著長(zhǎng)于對(duì)照組（圖3，P＜0.05）；動(dòng)情周期變化提示機(jī)體內(nèi)激素分泌紊亂，動(dòng)情周期長(zhǎng)期紊亂會(huì)導(dǎo)致生殖功能障礙。

2.5 CP531 化合物染毒改變促性腺激素分泌情況

動(dòng)情周期提示體內(nèi)激素水平變化，因此，進(jìn)一步探究CP531 化合物對(duì)性腺激素的影響。染毒時(shí)間截止后，行眼球摘除術(shù)取全血，全血離心分離血清，測(cè)定雌二醇激素（Estradiol，E2）、促卵泡生產(chǎn)激素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH ）、孕酮（Progesterone，P）、促黃體生產(chǎn)素（Luteinizing hormone，LH）水平變化。經(jīng)過(guò)28 d 染毒，CP531高劑量組E2 水平顯著增加（圖8，P＜0.05）。經(jīng)過(guò)90 d 染毒，CP531 中、高劑量組E2 水平顯著下降（圖8，P＜0.05）。激素長(zhǎng)期紊亂可能引起生殖異常，增加生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)生幾率等嚴(yán)重后果。

經(jīng)過(guò)28 d 染毒，CP531 染毒組FSH 水平顯著增加（圖9，P＜0.05）。經(jīng)過(guò)90 d 染毒，CP531 染毒組FSH 略下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

經(jīng)過(guò)28 d 染毒，CP531 高劑量組P水平顯著降低（圖10，P＜0.05）。經(jīng)過(guò)90 d 染毒，CP531 低劑量染毒組P水平顯著增加。

經(jīng)過(guò)90 天染毒，CP531 中劑量染毒組LH 水平顯著增加（圖11，P＜0.05）。

2.6 CP531 化合物染毒對(duì)卵巢和子宮組織影響

卵巢是雌性動(dòng)物和女性重要的性腺器官，對(duì)機(jī)體的各種性激素起著重要的調(diào)節(jié)作用。卵巢HE 染色，鏡下發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠卵巢各級(jí)卵泡可見(jiàn)，生長(zhǎng)卵泡透明帶明顯，顆粒細(xì)胞豐富，排列整齊緊密，閉鎖卵泡數(shù)量較少。28 d CP531 染毒組小鼠卵巢各級(jí)卵泡均可見(jiàn)，但隨著染毒劑量的增加，出現(xiàn)顆粒細(xì)胞排列紊亂、透明帶分界模糊，閉鎖卵泡數(shù)量較多。隨著卵巢發(fā)育，90 d 各個(gè)組閉鎖卵泡較28 d 小鼠卵巢少，但隨著染毒劑量的增加，90 d CP531 染毒組出現(xiàn)顆粒細(xì)胞排列紊亂、脫離，透明帶邊界模糊。CP531 染毒28 d 染毒影響較90 d 嚴(yán)重，可能是由于早期卵巢發(fā)育對(duì)CP531 更敏感，隨著卵巢發(fā)育成熟，激發(fā)修復(fù)機(jī)制。

子宮是雌性動(dòng)物和女性重要的生殖器官，子宮HE 染色，各個(gè)組總體上腺體豐富，子宮結(jié)構(gòu)完整。28 d CP531 染毒組子宮上皮細(xì)胞變薄，炎性細(xì)胞增加。CP531 染毒組有脫落子宮蛻膜組織。90 d 各組腺體豐富，CP531 染毒組有脫落子宮蛻膜組織，上皮細(xì)胞排列不整齊，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.7 CP531 化合物染毒對(duì)卵巢和子宮超微結(jié)構(gòu)的影響

進(jìn)一步觀察各個(gè)染毒時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)病理變化，28 d 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)CP531 染毒組隨著染毒劑量增加顆粒細(xì)胞排列越紊亂，高劑量組透明帶不完整，顆粒細(xì)胞脫落，細(xì)胞質(zhì)減少。

90 d 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組透明帶清晰，顆粒細(xì)胞排列緊密。CP531 染毒組顆粒細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞間間隙增大，核質(zhì)固縮。

28 d 子宮透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)CP531 染毒組部分子宮上皮細(xì)胞核固縮，形態(tài)不規(guī)則。

90 d 子宮透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)CP531 染毒組中劑量組和高劑量組部分子宮上皮細(xì)胞核固縮，形態(tài)不規(guī)則。

2.8 CP531 化合物染毒對(duì)卵巢和子宮雌激素受體表達(dá)的影響

雌二醇通過(guò)與細(xì)胞核膜上的雌激素受體ERα、ERβ結(jié)合，介導(dǎo)下游基因轉(zhuǎn)錄，在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。GPER 是一種非基因組受體，GPER 可與雌二醇結(jié)合，可發(fā)揮快速信號(hào)傳遞作用，調(diào)控下游信號(hào)通路。經(jīng)典雌激素受體（ERα、ERβ）與非經(jīng)典雌激素受體（GPER）對(duì)卵巢和子宮功能非常重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CP531 化合物染毒28 d 與90 d 后卵巢雌激素受體表達(dá)增加（圖18）。

對(duì)子宮組織雌激素受體蛋白表達(dá)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)CP531 化合物染毒28 d 與90 d 后雌激素受體表達(dá)增加。從結(jié)果中可發(fā)現(xiàn)CP531 中、高劑量染毒可明顯增加子宮ERα、ERβ、GPER 表達(dá)水平，提示CP531對(duì)子宮激素受體干擾效應(yīng)更明顯（圖19）。

3 結(jié)果與討論

本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：CP531 化合物短期（28 d）和長(zhǎng)期（90 d）染毒會(huì)干擾雌性小鼠卵巢和子宮功能，具有一定生殖毒性。與子宮相比，雌性小鼠卵巢對(duì)CP531 化合物更敏感，更易受到CP531 化合物影響。需Ⅱ、Ⅲ段生殖毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估CP531化合物對(duì)子代發(fā)育的影響。雜環(huán)酰胺是一類(lèi)結(jié)構(gòu)較新穎的HPPD 類(lèi)抑制劑，雖然具有較高的除草活性，但其對(duì)哺乳動(dòng)物的安全性尤其是對(duì)雌性生殖毒性值得高度關(guān)注，或許這是該類(lèi)抑制劑一直沒(méi)有實(shí)現(xiàn)商品化的主要原因。