強文娟 屈海燕 阿英

(榆林市中醫(yī)醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 榆林 719000)

結(jié)直腸癌是全球常見第三大惡性腫瘤〔1〕，其發(fā)病率近年來呈升高和年輕化的趨勢，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康〔2〕。目前，結(jié)直腸癌的治療仍是臨床上面臨的重大挑戰(zhàn)；因此，深入了解其發(fā)生發(fā)展的分子機制對更好地治療結(jié)直腸癌具有重要意義。既往研究〔3,4〕顯示，微小RNA(miRNA)可通過靶向調(diào)控相關(guān)基因的表達影響腫瘤細(xì)胞功能，與包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究〔4,5〕指出，miR-376a在結(jié)直腸癌組織中表達下調(diào)，且其表達水平的改變與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，但其具體的作用機制并不完全清楚。本研究旨在探討并闡明在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲過程中miR-376a的作用及其與胰島素樣生長因子1受體(IGF-1R)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清(美國Sigma公司)的改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM，美國Hyclone公司)在5%二氧化碳、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱(中國賽默飛世爾科技公司)內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)正常結(jié)腸上皮NCM460細(xì)胞和結(jié)直腸癌Caco2、HCT116、SW480細(xì)胞(美國ATCC)。當(dāng)細(xì)胞長至85%密度時，加入0.25%胰蛋白酶(美國Hyclone公司)消化，并按照1∶2比例傳代。選取長勢良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.2實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測miR-376a的表達 按照Trizol試劑(美國Invitrogen公司)說明書提取Caco2、HCT116、SW480和NCM460細(xì)胞總RNA后，使用紫外可見分光光度計(上海精密儀器儀表公司)檢測RNA的濃度與完整性。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)說明書將高質(zhì)量的RNA合成單鏈cDNA，以cDNA為模板，按照實時熒光定量RCR試劑盒(大連寶生物工程)說明書上PCR儀(德國Eppendorf公司)進行擴增。以U6為內(nèi)參，2-△△Ct法計算Caco2、HCT116、SW480和NCM460細(xì)胞中miR-376a的表達水平。實驗重復(fù)3次。其中，PCR擴增引物(上海生工生物工程公司)序列如下：miR-376a 上游：5′-ATGCCAAGTTAGGTCCATTCGT-3′，下游：5′-GCACAGTGCATCATAGAGGAAAAT-3′；U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的Caco2細(xì)胞按照每孔2×105個接種至6孔細(xì)胞板上后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)；待細(xì)胞達70%融合度時，參照脂質(zhì)體2000(美國Invitrogen公司)進行瞬時轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染miR-376a模擬物(上海吉瑪公司)的細(xì)胞作為miR-376a組，轉(zhuǎn)染模擬物陰性對照的細(xì)胞作為miR-NC組，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為對照組，共轉(zhuǎn)染miR-376a模擬物和IGF-1R-pcDNA3.1過表達質(zhì)粒(NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心)的細(xì)胞作為miR-376a+IGF-1R組，共轉(zhuǎn)染miR-376a模擬物和pcDNA3.1空載體質(zhì)粒的細(xì)胞作為miR-376a+pcDNA3.1組，其中每組設(shè)置3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染5 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集各組Caco2細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

1.4細(xì)胞計數(shù)(CCK)-8法檢測細(xì)胞增殖 將待測的Caco2細(xì)胞按照每孔1×105個接種至96孔細(xì)胞板上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)至所需時間后，棄培養(yǎng)液，參照CCK-8試劑盒(北京賽因百奧生物)說明書檢測Caco2細(xì)胞在570 nm處的光密度(OD)值。實驗重復(fù)3次。

1.5Transwell小室檢測細(xì)胞遷移和侵襲 使用無血清培養(yǎng)基將待測的Caco2細(xì)胞制成濃度為1×105個/ml的細(xì)胞懸液。在無基質(zhì)膠(美國BD公司)包被或有基質(zhì)膠包被的Transwell小室(美國corning costar公司)的上室中加入細(xì)胞懸液200 μl/孔，而下室內(nèi)加入含血清培養(yǎng)基600 μl/孔。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜后，取出小室。采用4%多聚甲醛(北京索萊寶公司)固定細(xì)胞20 min后，加入0.1%結(jié)晶紫(上海聯(lián)碩生物公司)染色15 min。洗去染色液后，室溫晾干。采用倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器六廠)觀察并統(tǒng)計隨機選取的3個視野內(nèi)的穿膜細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.6Western印跡檢測IGF-1R蛋白表達 向待測的Caco2細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液(北京索萊寶公司)抽提細(xì)胞總蛋白后，參照二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶公司)說明書檢測蛋白的濃度與純度。將蛋白樣品與上樣緩沖液等體積混勻后，置于沸水中變性5 min。按照十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)制備試劑盒(北京索萊寶公司)說明書制備的SDS-PAGE，將變性后的蛋白樣品按照每孔50 μg上樣后進行電泳分離。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)染聚偏氟乙烯膜(美國Millipore公司)上。以5%脫脂奶粉封膜2 h后，加入稀釋1 000倍的IGF-1R抗體(美國Abcam公司)和β-actin抗體(美國Abcam公司)；4℃下孵育24 h后，加入2 000倍稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物公司)室溫孵育2 h。再參照增強化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(北京索萊寶公司)說明書顯影曝光后，采用凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)掃描分析Caco2細(xì)胞中IGF-1R蛋白的表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-376a和IGF-1R的靶向關(guān)系 采用TargetScan生物學(xué)軟件預(yù)測到miR-376a與IGF-1R 3′UTR存在互補的結(jié)合位點，為了驗證miR-376a與IGF-1R的靶向關(guān)系，將IGF-1R 3′UTR克隆擴增并重組至psiCHECK熒光素酶報告基因載體(上海海吉浩格生物)上，作為IGF-1R野生型(IGF-1R-WT)報告基因質(zhì)粒；另外，將miR-376a與IGF-1R 3′UTR結(jié)合位點定點突變后，克隆重組至psiCHECK熒光素酶報告基因載體上，構(gòu)建IGF-1R突變型(IGF-1R-MUT)報告基因質(zhì)粒。參照脂質(zhì)體2000說明書將構(gòu)建的IGF-1R-WT、IGF-1R-MUT質(zhì)粒與miR-376a模擬物及其陰性對照共轉(zhuǎn)染至Caco2細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收集Caco2細(xì)胞并根據(jù)雙熒光素酶活性檢測試劑盒(上海鈺博生物)說明書檢測細(xì)胞的熒光素酶活性。實驗重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-376a在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達 在3種結(jié)直腸癌系Caco2、HCT116、SW480和正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系NCM460中miR-376a表達水平分別為0.10±0.02、0.28±0.03、0.17±0.02和1.00±0.08；4種細(xì)胞整體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=765.444，P<0.05)；與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460比較，3種結(jié)直腸癌系Caco2、HCT116、SW480中miR-376a表達水平明顯降低(P<0.05)，且Caco2細(xì)胞中miR-376a表達水平最低。故后續(xù)選用Caco2細(xì)胞進行實驗。

2.2miR-376a過表達對結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，miR-NC組細(xì)胞中miR-376a表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與對照組或miR-NC組比較，miR-376a組細(xì)胞中miR-376a表達水平明顯升高(P<0.05)。同時，miR-NC組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h后細(xì)胞增殖活力與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但miR-376a組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h后細(xì)胞增殖活力明顯低于對照組或miR-NC組(P<0.05)。見表1。

2.3miR-376a過表達對結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞侵襲和遷移的影響 與對照組比較，miR-NC組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與miR-NC組或?qū)φ战M比較，miR-376a組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目均明顯減少(P<0.001)。見表2。

表1 各組細(xì)胞中miR-376a的表達及細(xì)胞增殖活力比較

表2 各組細(xì)胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目比較個，n=9)

2.4miR-376a過表達對結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞中IGF-1R蛋白表達的影響 與對照組細(xì)胞中IGF-1R蛋白表達水平(0.68±0.05)比較，miR-NC組(0.65±0.04)無顯著差異(P>0.05)；與miR-NC組或?qū)φ战M比較，miR-376a組細(xì)胞中IGF-1R蛋白表達水平(0.35±0.03)明顯降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測IGF-1R蛋白表達

2.5miR-376a與IGF-1R靶向關(guān)系的驗證 miR-376a與IGF-1R 3′UTR存在互補的結(jié)合位點，見圖2；將miR-376a模擬物與構(gòu)建的IGF-1R-WT熒光素酶報告基因載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后Caco2細(xì)胞的熒光素酶活性較相應(yīng)對照miR-NC明顯降低(P<0.05)，見表3。

圖2 miR-376a與3′UTR存在互補的結(jié)合位點

表3 各組細(xì)胞熒光素酶活性的比較

2.6上調(diào)IGF-1R表達逆轉(zhuǎn)miR-376a過表達對結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞的影響 與miR-376a+pcDNA3.1組比較，miR-376a+IGF-1R組細(xì)胞中IGF-1R蛋白表達水平、細(xì)胞增殖活力、遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目均明顯升高(P<0.05)。見圖3和表4。

1～4：miR-NC組、miR-376a組、miR-376a+pcDNA3.1組、miR-376a+IGF-1R組圖3 Western印跡檢測各組細(xì)胞中IGF-1R蛋白表達

表4 各組細(xì)胞中IGF-1R蛋白表達水平、細(xì)胞增殖活力、細(xì)胞遷移數(shù)目和細(xì)胞侵襲數(shù)目比較

3 討 論

miRNAs是一類廣泛分布于生物體內(nèi)的非編碼RNA，約由22個氨基酸組成，可通過與靶基因mRNA 3′UTR不完全互補配對在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，參與細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，被認(rèn)為是腫瘤基因治療的重要靶標(biāo)〔6，7〕。在結(jié)直腸癌中存在著異常表達的miRNAs，而這些miRNAs中有的如miR-466和miR-490-3p等在結(jié)直腸癌中發(fā)揮著重要抑癌作用〔8，9〕，有些如miR-196a-5p和 miR-142-5p等則發(fā)揮著重要的促癌作用〔10，11〕。

miR-376a是miR-376家族成員，定位于人第14q32染色體上。Wang等〔12〕研究指出，miR-376a在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞中異常低表達，且可通過靶向調(diào)控c-Myc表達抑制細(xì)胞增殖、侵襲并促進細(xì)胞凋亡；miR-376a被認(rèn)為是非小細(xì)胞肺癌潛在的治療靶點。Fan等〔13〕在腎細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)，miR-376a低表達與患者總體生存率低密切相關(guān)；miR-376a過表達可通過靶向調(diào)控血清與糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶(SGK)3影響細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，在腎細(xì)胞癌惡性進展過程中發(fā)揮著抑癌作用。本研究結(jié)果與莫展豪〔14〕研究所得到的miR-376a過表達可抑制結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞增殖和遷移的結(jié)果相吻合。本研究結(jié)果表明，miR-376a可抑制結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。提示，在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中miR-376a可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移和侵襲發(fā)揮著重要的抑癌作用。

IGF-1R是一種跨膜的酪氨酸激酶蛋白，屬于胰島素樣生長因子家族成員，可通過磷酸化或與相應(yīng)配體結(jié)合等激活下游相關(guān)信號通路，在細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞侵襲和生長發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要作用，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔15〕。IGF-1R在膀胱癌和肺癌等腫瘤組織中過表達，而靶向抑制其表達可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等發(fā)揮著抗腫瘤作用〔16～19〕。張靖宇等〔20〕研究指出，IGF-1R在結(jié)直腸癌組織中異常高表達，且其表達水平與腫瘤組織學(xué)分級、浸潤深度和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Wu等〔21〕研究指出，靶向干擾IGF-1R表達可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。本研究結(jié)果提示，miR-376a抑制結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制與其靶向調(diào)控IGF-1R表達有關(guān)。

綜上，miR-376a可通過靶向調(diào)控IGF-1R表達抑制結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。該結(jié)果進一步豐富了miR-376a抑制結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。