黃燕 楊艷清 萬睿 周進(jìn)飛 張層層 劉睿 許其軍 張名 李慧娟

(1武漢市第三醫(yī)院整形外科；2襄陽市伊萊美醫(yī)療美容門診部美容皮膚科；3潛江市皮膚病防治院醫(yī)學(xué)美容科；4武漢市第三醫(yī)院皮膚科)

引起皮膚衰老的原因主要包括內(nèi)在和外在兩方面的因素，內(nèi)在因素在年齡達(dá)30歲左右時(shí)出現(xiàn)，這時(shí)細(xì)胞自我更新變慢及激素的產(chǎn)生引起皮膚上的變化；外在因素則是由于皮膚暴露于外部環(huán)境(尤其是紫外線輻射)，導(dǎo)致自由基的產(chǎn)生，自由基攻擊皮膚結(jié)構(gòu)，破壞膠原蛋白和彈性纖維，從而導(dǎo)致皮膚衰老〔1〕。氧化應(yīng)激在皮膚衰老過程中起重要作用〔2〕。因此，在氧化應(yīng)激和各種抗氧化過程之間的因果關(guān)系引起了研究者對(duì)抗氧化劑在皮膚上應(yīng)用的興趣。微小RNA(miRNA)是一種長(zhǎng)度為22～24 nt的非編碼RNA，通過誘導(dǎo)mRNA衰減和翻譯抑制，從而調(diào)控基因的表達(dá)〔3〕。近年來，涉及miRNA的疾病數(shù)量急劇增加，其中也包括一些皮膚疾病。例如，miR-203a在黑色素瘤中具有腫瘤抑制作用〔4〕。miR-29與腫瘤抑制蛋白p53一樣可促進(jìn)皮膚衰老過程〔5〕。miR-29a-3p、miR-30a-5p和miR-34a的下調(diào)可導(dǎo)致皮膚成纖維細(xì)胞的衰老減少〔6〕。

miR-181家族在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中具有重要作用。Neu等〔7〕在對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌(SCC)進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-181a通過靶向鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)在SCC中起著至關(guān)重要的腫瘤抑制作用，并且可能成為基于miRNA療法的候選靶標(biāo)。

本研究擬在細(xì)胞水平探討氧化應(yīng)激刺激之后的皮膚成纖維細(xì)胞中miR-181a-5p具體作用機(jī)制，為進(jìn)一步探索氧化應(yīng)激導(dǎo)致的皮膚衰老機(jī)制，尋找抗衰老的新靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株 大鼠皮膚成纖維樣細(xì)胞RS1購自武漢普諾賽生命科學(xué)技術(shù)有限公司(貨號(hào)：CL-0430)。

1.2主要試劑與儀器 試劑：DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)，H2O2(sigma)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA)，SYBR Green PCR 試劑盒(KAPA Biosystems)，CCK8試劑盒，過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX) 、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測(cè)定試劑盒(南京建成)，Lipofectamine?RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)，兔抗細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2多克隆抗體、兔抗Ⅰ型膠原α1鏈(COL1A1)多克隆抗體、兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2多克隆抗體(bioswamp)等。儀器：CFX-Connect 96熒光定量 PCR 儀(Bio-Rad)，Nano-300 超微量分光光度計(jì)(杭州奧盛)，352型酶標(biāo)儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS公司)，DMIL LED倒置熒光顯微鏡(Leica 公司)等。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將大鼠皮膚成纖維樣細(xì)胞RS1(含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將細(xì)胞以2×103個(gè)/孔、2×105個(gè)/孔接種于96孔板和6孔板，待細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照試劑盒說明書將Opti-MEM無血清培養(yǎng)基分別稀釋miR-181a-5p模擬物(mimic)、抑制物(inhibitor)及其無關(guān)序列(negative control)和Lipofectamine?RNAiMAX，室溫靜置5 min后混勻共孵育，之后加入培養(yǎng)板，4 h之后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞按照不同處理分為對(duì)照組(不經(jīng)任何處理)，模型組(200 μmol/L的H2O2處理6 h)，模型+miR-181a mimic組(200 μmol/L的H2O2處理6 h后，轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimic)，模型+mimic-NC組(200 μmol/L的H2O2處理6 h后，轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimic NC)，模型+miR-181a inhibitor組(200 μmol/L的H2O2處理6 h后，轉(zhuǎn)染miR-181a-5p inhibitor)，模型+ inhibitor-NC組(200 μmol/L的H2O2處理6 h后，轉(zhuǎn)染miR-181a-5p inhibitor NC)。

1.5Real-time PCR檢測(cè)P53、衰老標(biāo)記蛋白(SMP)30、COL1A1及miR-181a-5p 轉(zhuǎn)染24 h后，按照Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行定量檢測(cè)。采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，并送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成，引物序列：P53正義鏈：5′-TGCGTGTGGAGTATTTGG-3′,反義鏈：5′-GATTCTCTTCCTCTGTGCG-3′;SMP30正義鏈：5′-TGGTTTGGATTGGTCG-3′,反義鏈：5′-CACTTCTGCGGTTGGA-3′;COL1A1正義鏈：5′-AGGTGTTGTGCGATGACG-3′,反義鏈：5′-AGCTGGGGAGCAAAGTTT-3′;GAPDH正義鏈：5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′,反義鏈：5′-CACCACCCTGTTGCTG-3′;miR-181a-5p正義鏈：5′-GGGAACATTCAACGCTGT-3′,反義鏈：5′-AGAAGCCCGCTACCTG-3′;U6正義鏈：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′,反義鏈：5′-ACGCTTCACG AATTTGCGTGT-3′。

1.6CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以每樣品3復(fù)孔接種于96孔板(每孔180 μl，細(xì)胞密度5×103個(gè)/孔)，按1.4中分組方式培養(yǎng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后向每孔加入10 μl CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。計(jì)算細(xì)胞增殖率(增殖率=試驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%)。

1.7生化試劑盒檢測(cè)CAT、GSH-PX及T-SOD活性 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒使用說明書測(cè)定CAT、GSH-PX及T-SOD活性。

1.8免疫熒光檢測(cè)COL1A1及MMP2的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，以PBS洗滌2次，0.5%Triton X-100室溫通透20 min，PBS洗2次，5%BSA，37℃封閉1 h，棄封閉液，之后加入相應(yīng)COL1A1、MMP2抗體4℃，孵育過夜，PBS洗2次后加入熒光標(biāo)記二抗，37℃，孵育1 h，經(jīng)PBS洗滌，加入抗熒光淬滅封片液進(jìn)行封片，置熒光顯微鏡下觀察，使用Image J軟件分析免疫熒光強(qiáng)度。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-181a-5p轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 與對(duì)照組(1.00±0.03)相比，miR-181a-5p mimics組RS1細(xì)胞miR-181a-5p表達(dá)量顯著上升(4.37±0.26，P<0.01)，miR-181a-5p inhibitor組細(xì)胞miR-181a-5p表達(dá)量顯著下降(0.14±0.01，P<0.01)，mimics-NC及inhibitor-NC組，miR-181a-5p表達(dá)量無顯著變化(0.85±0.07、0.87±0.03；P>0.05)。

2.2miR-181a對(duì)細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組〔(100.00±0.14)%〕相比，模型組細(xì)胞增殖率顯著降低〔(49.68±1.21)%,P<0.01〕。與模型組相比，miR-181a-5p mimics組細(xì)胞增殖率顯著降低〔(39.22±1.16)%,P<0.01〕，miR-181a-5p inhibitor組細(xì)胞增殖率顯著升高〔(64.12±1.27)%,P<0.01〕。mimic-NC組及inhibitor-NC組細(xì)胞增殖率〔(47.16±1.33)%、(48.95±2.26)%〕均無顯著變化(P>0.05)。

2.3miR-181a對(duì)細(xì)胞內(nèi)CAT、GSH-Px及T-SOD活力的影響 與對(duì)照組相比，模型組RS1細(xì)胞內(nèi)CAT、GSH-Px及T-SOD活力顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，經(jīng)H2O2處理的RS1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181a mimics后，CAT、GSH-Px及T-SOD活力顯著降低(P<0.01)。轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后，細(xì)胞內(nèi)CAT、GSH-Px及T-SOD活力顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.4miR-181a對(duì)P53、SMP30、COL1A1 mRNA表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組相比，模型組RS1細(xì)胞的P53及SMP30表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，COL1A1表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，經(jīng)H2O2處理的RS1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181a mimics后，P53及表達(dá)量SMP30表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，COL1A1表達(dá)量顯著降低(P<0.01)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181a inhibitor后，P53及表達(dá)量SMP30表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，COL1A1表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。見表1。

2.5miR-181a對(duì)細(xì)胞內(nèi)COL1A1與MMP2表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，模型組RS1細(xì)胞COL1A1熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.01)，MMP2熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，經(jīng)H2O2處理的RS1轉(zhuǎn)染miR-181a-5p mimic后，COL1A1熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.01)，MMP2熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.01)；細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181a-5p inhibitor后，COL1A1熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.01)，MMP2熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.01)。見圖1、圖2、表2。

表1 各組細(xì)胞生化指標(biāo)活性及細(xì)胞內(nèi)P53、SMP30、COL1A1 mRNA表達(dá)水平比較

圖1 各組細(xì)胞COL1A1表達(dá)情況(免疫熒光染色，×200)

圖2 各組細(xì)胞MMP2表達(dá)情況(免疫熒光染色，×200)

表2 各組細(xì)胞COL1A1和MMP2免疫熒光強(qiáng)度的比較

3 討 論

紫外線輻射是造成皮膚衰老的主要外在因素。紫外線會(huì)刺激過多的活性氧(ROS)生成，使細(xì)胞的抗氧化劑防御系統(tǒng)不堪重負(fù)，并導(dǎo)致皮膚氧化應(yīng)激〔8，9〕。這些防御系統(tǒng)包括保護(hù)酶，例如超氧化物歧化酶(SOD)，CAT和GSH-Px及非酶機(jī)制〔10〕。同時(shí)，ROS的過度積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大分子的氧化損傷，包括DNA修飾，脂質(zhì)過氧化和凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而改變細(xì)胞功能〔11，12〕。

近年來，已有研究報(bào)道m(xù)iR-181a與細(xì)胞內(nèi)ROS、鈣離子調(diào)節(jié)相關(guān)〔13，14〕。miR-181家族在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中具有重要的作用，例如，miR-181a/b在皮膚衰老及持續(xù)衰老之后的細(xì)胞中上調(diào)，其靶向調(diào)節(jié)STIR1發(fā)揮促衰老的作用，在衰老過程中，可特異性的調(diào)控ⅩⅥ型細(xì)胞膠原及胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)〔13〕。miR-181a在H2O2處理6 h后的MSCs細(xì)胞中呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的狀態(tài)，并且這種miR-181a上調(diào)通過下調(diào)己糖激酶(HK)Ⅱ誘導(dǎo)細(xì)胞死亡〔15〕。

p53可參與500多個(gè)靶基因的調(diào)控，從而控制廣泛的細(xì)胞過程，其中包括代謝適應(yīng)，DNA修復(fù)，細(xì)胞周期停滯，凋亡和衰老，在端粒酶活性缺失的小鼠體內(nèi)過表達(dá)p53可導(dǎo)致衰老過程的激活和腫瘤進(jìn)程的抑制，而抑制p53的表達(dá)可導(dǎo)致衰老的旁路激活和腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔16〕。SMP30是一種新型的衰老標(biāo)記分子，其表達(dá)在衰老過程中會(huì)降低〔17〕。近年來，特別是在大鼠和小鼠肝臟中的研究表明，SMP30可參與多種生物調(diào)節(jié)途徑，其中包括細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的調(diào)節(jié)〔18〕。

Ⅰ型膠原是皮膚中最豐富的蛋白，Ⅰ型膠原蛋白是在皮膚纖維化，傷口愈合，組織重塑及皮膚衰老中起作用的主要成分〔19〕。組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)研究表明，在老化的皮膚中，其主要的改變是真皮層Ⅰ型膠原的大量損失，這也被認(rèn)為是皺紋形成的主要原因〔19〕。同時(shí)，MMP和透明質(zhì)酸酶在皮膚衰老過程中也發(fā)揮著極其重要的作用，可導(dǎo)致彈性蛋白酶，膠原酶和透明質(zhì)酸酶的產(chǎn)量增加，從而導(dǎo)致膠原蛋白，彈性蛋白和透明質(zhì)酸的降解，促進(jìn)皮膚老化〔20〕。

本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-181a mimic后，細(xì)胞活力明顯降低，衰老標(biāo)記基因P53及SMP30表達(dá)量明顯升高，同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)生化指標(biāo)CAT、GSH-PX、T-SOD活性均顯著升高。另外，免疫熒光結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)COL1A1表達(dá)受到抑制，MMP2則表達(dá)增強(qiáng)。

綜上所述，miR-181a-5p可促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠皮膚成纖維樣細(xì)胞衰老進(jìn)程，其機(jī)制可能與下調(diào)COL1A1表達(dá)，上調(diào)MMP2表達(dá)有關(guān)。