邢宇彤 張明 朱茂述 吳佳梅 周鋼 孔維生

(1廈門市第五醫(yī)院胸心外科，福建 廈門 361101；佳木斯大學(xué) 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室；3附屬第一醫(yī)院胸心外科)

心力衰竭(心衰)發(fā)生發(fā)展的過程十分復(fù)雜且具有連鎖、動態(tài)的特點，細胞因子和神經(jīng)激素在心衰發(fā)生時可以對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生直接的毒害作用，對心室重構(gòu)產(chǎn)生重要影響。心衰存在時，機體抗炎因子的缺乏及其炎性細胞因子的過度表達將會進一步促進心功能不全加重。脂聯(lián)素是由脂肪細胞分泌的一種類蛋白激素，且在肥胖時產(chǎn)生反向調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)〔1〕。核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB在心衰患者的外周血粒細胞中活化較為活躍，它參與多種炎性細胞因子的調(diào)控及基因表達。通過對比觀察晚期心衰患者和心衰大鼠的心肌細胞可發(fā)現(xiàn)，心室重構(gòu)的發(fā)展過程可能與NF-κB的活化存在十分密切關(guān)系〔2〕。心室重構(gòu)的形成過程除了與血流動力學(xué)的改變有關(guān)外，可能還與炎性細胞因子密切相關(guān)，且NF-κB對多種炎性細胞因子具有調(diào)控作用。所以NF-κB在心衰的發(fā)生發(fā)展中對炎性因子的分子調(diào)控機制及其與心衰的關(guān)系的研究可能會為我們找到解決心衰治療方法的途徑。本研究旨在闡明脂聯(lián)素在肥胖大鼠心衰發(fā)展過程中可能的機制及作用途徑。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 采用2月齡健康SD大鼠40只，雄性，SPF，體重(150±20)g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，動物合格證號：2014120903，嚴格按清潔級大鼠的要求在佳木斯大學(xué)動物實驗中心喂養(yǎng)。動物的使用均遵循美國國立健康研究所出版的實驗動物照料和使用指南及佳木斯大學(xué)實驗動物照料和使用規(guī)則，自由飲水。隨機將40只大鼠中的任意10只分為對照組，剩余的30只分為肥胖組。對照組動物給予正?；A(chǔ)飼料喂養(yǎng)，肥胖組給予高脂飼料分別喂養(yǎng)6 w。肥胖指數(shù)=〔體重(g)〕1/3×1 000/體長(cm)。試劑：大鼠脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；抗NF-κB抗體、抗腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(美國Santa cruz公司)。儀器：HX-300小動物呼吸機(中國成都泰盟公司)；BL-420F生物功能實驗系統(tǒng)(中國成都泰盟公司)；自動酶標分析儀(美國MODEL 550)；LeicaDM4000B型生物顯微鏡(德國萊卡公司)等。

1.2心衰模型的制備及血流動力學(xué)監(jiān)測 心衰模型的制備：從肥胖組中篩選出符合實驗要求的SD大鼠，按0.3 ml/100 g的濃度腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，背位固定，氣管插管，小型動物呼吸機輔助呼吸，設(shè)定潮氣量20 ml/kg。胸部去毛后沿左側(cè)第3肋處表皮切開長約2.5 cm切口，再于第3肋間止血鉗鈍性分離肋間肌，撐開胸廓，緩慢小心剪開心包，充分暴露心臟，在距左冠狀動脈根部3 mm處，用7-0 Prolene線將冠狀動脈左前降支完全結(jié)扎。直到看見左室壁變紫、心電圖S-T段抬高和肢體導(dǎo)聯(lián)高尖R波，即為結(jié)扎冠狀動脈成功。然后將心臟迅速還納回胸腔，無菌絲線連續(xù)縫合胸壁。大鼠恢復(fù)自主呼吸數(shù)分鐘后停止輔助呼吸，并每日注射青霉素，持續(xù)3 d，預(yù)防感染。繼續(xù)養(yǎng)2 w后，建立肥胖大鼠心衰模型(心衰組)。心功能檢查：肥胖大鼠心衰模型建成后，分離出右側(cè)頸動脈，使其長約1.5 cm，在右頸動脈插入1%肝素化后的心導(dǎo)管，經(jīng)三通管與MP150生物分析系統(tǒng)相連，同步記錄主動脈壓力曲線，主動脈收縮壓(SAP)及主動脈舒張壓(DAP)。記錄結(jié)束將心導(dǎo)管進一步插入左心室，穩(wěn)定后開始記錄左心室壓力曲線、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室收縮壓(LVSP)。每隔3 min測1次，至少測量3次以上，取測量次數(shù)的平均值作為最終結(jié)果。

1.3血清脂聯(lián)素和TNF-α的ELISA檢測 肥胖大鼠心衰血流動力學(xué)監(jiān)測完成后，經(jīng)腹主動脈采血3.5 ml置于預(yù)先肝素化的試管內(nèi)，將取到的血液樣本在室溫下靜置30～60 min，待血清分離時將血液樣本置入離心機中，調(diào)制5 000 r/min離心15 min，再取上清液至2 ml離心管內(nèi)，將含上清液的離心管及時保存于液氮中，血液樣本全部取完后統(tǒng)一放入-80℃冰箱保存待檢。用酶標法進行檢查。

1.4NF-κB和TNF-α的Western印跡檢測 提取心肌組織中總蛋白，先將少量組織塊置于勻漿器球狀部，用無菌剪將其盡量剪碎。將去污劑裂解液400 μl(含PMSF)加入后勻漿，然后放在冰上。數(shù)分鐘后碾幾次再放冰上，要反復(fù)幾次使組織盡可能碎。30 min后，就可以把裂解液移到1.5 ml離心管里，然后在調(diào)至4℃12 000 r/min離心5 min，取上清再次放到0.5 ml離心管中一起保存在-80℃冰箱里待檢。蛋白測定，灌膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗二抗孵育，定影，顯影，分析。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗、方差分析、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大鼠體重及肥胖指數(shù) 同一時間喂養(yǎng)6 w后，肥胖組平均體質(zhì)量明顯高于對照組(P<0.01)。見表1；以超出對照組平均體質(zhì)量20%的為實驗用肥胖大鼠，則高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠中有23只成為肥胖模型，作為肥胖組。

2.2血脂含量變化 對照組與肥胖組相比，總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)-C、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)-C、TC/HDL-C水平差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表1 兩組體重和肥胖指數(shù)變化

表2 兩組血脂含量比較

2.3心臟功能比較 心衰組比對照組和肥胖組SAP、DAP、LVSP均有明顯的降低，而LVEDP 明顯增加(P<0.05)。見表3。

2.4血清脂聯(lián)素、NF-κB和TNF-α水平 心衰組血清脂聯(lián)素含量明顯低于對照組和肥胖組(P<0.01)，TNF-α、NF-κB均明顯高于對照組和肥胖組(P<0.01)。見表4。

2.5心肌組織NF-κB和TNF-α蛋白表達 與對照組比較，肥胖組心肌組織NF-κB、TNF-α的表達沒有發(fā)現(xiàn)明顯變化(P>0.05)，與肥胖組比較，心衰組心肌組織NF-κB、TNF-α的表達明顯升高(P<0.01)。見圖1。

表3 各組心臟功能比較

表4 各組血清脂聯(lián)素、NF-κB和TNF-α水平比較

圖1 Western印跡檢測心肌組織中NF-κB、TNF-α蛋白表達

3 討 論

肥胖和心血管病危險因素之間有明確的流行病學(xué)關(guān)系，極大增加了心血管病在肥胖人群的發(fā)生概率〔3〕。脂聯(lián)素在人體起到較為廣泛的作用，尤其在抵抗血管粥樣硬化、胰島素增敏、抗炎、交感神經(jīng)系統(tǒng)、與腎素-血管緊張素等系統(tǒng)方面有其獨特性質(zhì)。此外，脂聯(lián)素與多種疾病發(fā)生機制存在聯(lián)系，主要表現(xiàn)在高血壓、糖尿病、高脂血癥、冠心病及代謝綜合征等相關(guān)疾病。近年來研究表明脂聯(lián)素與心衰關(guān)系密切，心衰發(fā)生過程血漿中脂聯(lián)素的含量有顯著差異，并與心衰治療前后心功能改善程度有很大關(guān)系，可以阻礙血管緊張素誘導(dǎo)的心肌肥大〔4〕。NF-κB是心肌肥大形成過程中的重要因子，在內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中，脂聯(lián)素可以阻礙NF-κB活性減輕炎癥因子，TNF-α和黏附因子的表達。NF-κB在缺血再灌注、缺血預(yù)處理及不穩(wěn)定心絞痛中起重要作用〔4，5〕。NF-κB在心衰患者的外周血粒細胞中活化明顯，參與多種炎性細胞因子的調(diào)控及基因表達。通過對比觀察晚期心力衰竭患者和大鼠的心肌細胞可發(fā)現(xiàn)，心室重構(gòu)的發(fā)展過程可能與NF-κB的活化存在十分密切關(guān)系。球形脂聯(lián)素是誘導(dǎo)心肌肥大的主要脂聯(lián)素，能夠抑制血管緊張素Ⅱ生成，在心肌肥大形成中可能有部分是利用抑制NF-κB的活化實現(xiàn)的〔6〕。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是脂聯(lián)素多種生物學(xué)作用的關(guān)鍵信號分子，脂聯(lián)素可以利用磷酸化AMPK阻礙NF-κB活化，通過抑制NF-κB活化減輕炎癥因子和黏附因子的表達，還可以通過磷酸化AMPK，抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活性減輕心肌肥大〔7〕。在各種病因所致心衰病人的心肌組織中，也顯示出NF-κB活化及其調(diào)控分子，如TNF-α等基因表達上調(diào)〔1，8〕。TNF-α在心衰晚期病人體內(nèi)的代謝水平升高，這可導(dǎo)致病人的心臟結(jié)構(gòu)改變、心功能減退、肺水腫和心肌病。心衰患者總脂聯(lián)素和高分子量脂聯(lián)素都高于正常人，但高分子量脂聯(lián)素略低于總脂聯(lián)素，這可能是因為高分子量脂聯(lián)素對心血管起到保護的作用〔6，9〕?？傊?，脂聯(lián)素作為脂肪細胞分泌的特異性蛋白質(zhì)，在心血管疾病、抗炎及肥胖等方面都起到了極其重要的作用〔10～12〕。雖然心衰患者血漿脂聯(lián)素水平升高的機制目前尚不十分明確，但對于肥胖的發(fā)生和心衰患者的臨床防治都具有重要意義，有待進一步研究。