安靜 曲良超 閆小強(qiáng)

(1開封市中心醫(yī)院麻醉科，河南 開封 475000；2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科)

缺血性腦卒中是一種嚴(yán)重威脅人類健康的腦血管疾病，具有致死致殘率高、復(fù)發(fā)率高和并發(fā)癥多等特點(diǎn)〔1〕。隨著生活質(zhì)量的提高和生活節(jié)奏的加快，缺血性腦卒中發(fā)病率明顯增加，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)。盡管早期抗凝、溶栓和神經(jīng)保護(hù)等傳統(tǒng)治療措施具有一定療效，但大部分患者后期仍留下偏癱、偏盲、失語等不同程度神經(jīng)功能障礙后遺癥。因此，迫切需要尋找新的有效的治療缺血性腦卒中的方法。舒芬太尼(SF)作為主要的μ阿片受體激動(dòng)劑，其親脂性強(qiáng)，更易通過血腦屏障，鎮(zhèn)痛性度且作用持久，在心血管疾病患者外科手術(shù)麻醉中有著廣泛應(yīng)用〔2〕。體內(nèi)研究表明，SF預(yù)處理或后處理對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用〔3,4〕。Nod樣受體Pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白(NLRP)3是炎性小體的重要組成亞基，其通過觸發(fā)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-1活化，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-18和IL-1β分泌，在缺血性腦卒中中發(fā)揮重要作用〔5〕。研究表明，NLRP3表達(dá)下調(diào)可減輕神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，對(duì)腦缺血損傷具有保護(hù)作用〔6〕。然而，SF能否通過調(diào)控NLRP3表達(dá)影響腦缺血損傷尚未可知。本研究通過構(gòu)建缺氧缺糖(OGD)神經(jīng)細(xì)胞損傷模型模擬腦缺血損傷，以NLRP3為切入點(diǎn)，探討SF對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響和分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 月齡20個(gè)月且妊娠16～18 d SD大鼠購自上海凱學(xué)生物科技有限公司；杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、神經(jīng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；枸櫞酸SF注射液購自宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司；si-NC、si-NLRP3、pcDNA-NLRP3、pcDNA由廣州銳博生物技術(shù)公司提供；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8、胰蛋白酶、Trizol試劑購自美國Sigma公司；膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海貝博生物公司；乳酸鹽脫氫酶(LDH)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自南京建成生物技術(shù)研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix購自大連Takara生物公司；兔源NLRP3抗體、兔源B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體、兔源Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體、兔源磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、山羊抗兔IgG購自美國Abcam公司。

1.2皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞分離和OGD損傷模型構(gòu)建〔7〕無菌條件下分離胎鼠大腦皮層組織，顯微鑷離碎為約1 cm3的組織塊，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸。用0.25%的胰蛋白酶37℃消化 15 min。結(jié)束后，加入DMEM培養(yǎng)基用無菌的細(xì)口徑吸管反復(fù)吹打，收集上清液。用200目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，離心，棄去上清。加入神經(jīng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基，制成細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液。將神經(jīng)細(xì)胞接種于包被L-多聚賴氨酸的6孔板中，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h時(shí)全量換液，以后每3 d半量換液1次。培養(yǎng)10 d左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞接種到6孔板，5 d時(shí)棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用37℃預(yù)溫的PBS洗滌1次，每孔加入1 ml無糖DMEM培養(yǎng)基(提前在缺氧培養(yǎng)箱中放置30 min除去培養(yǎng)基中的氧氣)，將培養(yǎng)板置于缺氧培養(yǎng)箱(5% CO2、95% N2)中培養(yǎng)90 min；結(jié)束后，更換為神經(jīng)細(xì)胞專用培養(yǎng)基，置于5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照(Con)組為正常培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，OGD組只給予OGD處理，OGD+SF-L組、OGD+SF-M組、OGD+SF-H組為于OGD前分別加入1×10-11mol/L、1×10-10mol/L、1×10-9mol/L的SF并維持在OGD處理過程中。隨后按照下述方法檢測(cè)細(xì)胞增殖、凋亡、LDH釋放及NLRP3表達(dá)情況。

為證實(shí)OGD是通過調(diào)控NLRP3進(jìn)而影響OGD誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷，實(shí)驗(yàn)分組如下：OGD+si-NC組、OGD+si-NLRP3組為轉(zhuǎn)染si-NC、si-NLRP3 48 h后進(jìn)行OGD干預(yù)處理，OGD+SF+pcDNA組、OGD+SF+pcDNA-NLRP3組為轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-NLRP3 48 h后在培養(yǎng)液中加入1×10-9mol/L的SF進(jìn)行OGD處理。隨后分析各組細(xì)胞增殖、凋亡、LDH釋放及NLRP3表達(dá)情況。

1.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 取5×103個(gè)各組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱孵育2 h。以空白孔調(diào)零后，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長各孔吸光度值(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%

1.5ELISA檢測(cè)LDH釋放量 收集各組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心棄去上清，加入適量體積提取液，超聲波破碎細(xì)胞，離心收集上清液，按照ELISA試劑盒使用要求檢測(cè)各組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞LDH釋放量。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理后，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化收集細(xì)胞。預(yù)冷的PBS重懸、洗滌細(xì)胞；加入300 μl 1×結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞；加入5 μl的Annexin V-FITC混勻后，室溫避光孵育15 min；加入5 μl PI染色，補(bǔ)加200 μl 1×結(jié)合緩沖液后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7Western印跡檢測(cè)Bcl-2、Bax和NLRP3蛋白表達(dá) 采用細(xì)胞裂解液裂解各組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，收集蛋白樣品，并測(cè)定每個(gè)蛋白樣品濃度。配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠；取適量2×蛋白上樣緩沖液和等倍體積蛋白樣品混合，100℃加熱3～5 min，以充分變性細(xì)胞蛋白；蛋白樣品冷卻至室溫后，直接上樣至加樣孔進(jìn)行電泳；利用濕式轉(zhuǎn)膜裝置進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；結(jié)束后用5%的脫脂牛奶4℃封閉膜過夜；洗膜后加入稀釋的一抗室溫孵育膜1 h；洗膜后加入稀釋好的二抗溫孵育膜2 h；洗膜后采用電化學(xué)發(fā)光液來檢測(cè)蛋白。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白和內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)NLRP3表達(dá)水平 用Trizol試劑提取各組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按SYBR Green Master Mix說明書對(duì)NLRP3 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。以GAPDH為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt計(jì)算NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。NLRP3上游5′-CCATCGGC-AAGACCAAGA-3′,下游5′-ACAGGCTCAGAATGCTCATC-3′；GAPDH上游5′-TGACTTCAACAGCGAC-ACCCA-3′,下游5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞存活率、LDH釋放率比較 與Con組比較，OGD組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的存活率顯著降低，LDH釋放率顯著增加(P<0.05)；與OGD組比較，OGD+SF-L組、OGD+SF-M組、OGD+SF-H組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的存活率顯著升高，LDH釋放率顯著降低，并呈一定的劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

2.2各組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、Bax及Bcl-2蛋白比較 與Con組比較，OGD組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與OGD組比較，OGD+SF-L組、OGD+SF-M組、OGD+SF-H組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高，并呈一定劑量依賴性(P<0.05)。見圖1、表1、圖2。

表1 各組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞存活、凋亡、LDH釋放、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的NLRP3 mRNA及蛋白表達(dá)比較

2.3各組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)比較 與Con組比較，OGD組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與OGD組比較，OGD+SF-L組、OGD+SF-M組、OGD+SF-H組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞NLRP3 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，并呈一定劑量依賴性(P<0.05)。見表1、圖3。

2.4抑制NLRP3表達(dá)對(duì)OGD誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞存活、LDH釋放及凋亡的影響 與OGD+si-NC組比較，OGD+si-NLRP3組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)、LDH釋放率、凋亡率及Bax蛋白顯著降低，細(xì)胞存活率和Bcl-2蛋白顯著升高(均P<0.05)。見表2、圖4、圖5。

1～5：Con組，OGD組，OGD+SF-L組，OGD+SF-M組，OGD+SF-H組，圖3同圖1 各組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 兩組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞存活、LDH釋放和凋亡情況比較

圖3 各組NLRP3蛋白表達(dá)

2.5NLRP3過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了SF(1×10-9mol/L)對(duì)OGD誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷作用 與OGD組比較，OGD+SF組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)、凋亡率及LDH釋放率、Bax蛋白表達(dá)顯著降低，細(xì)胞存活率、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與OGD+SF+pcDNA組比較，OGD+SF+pcDNA-NLRP3組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞NLRP3蛋白的表達(dá)、凋亡率、LDH釋放率、Bax蛋白表達(dá)顯著升高，細(xì)胞存活率、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖6、圖7、表3。

圖4 兩組NLRP3蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖5 兩組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡流式圖

1～4:OGD組，OGD+SF組，OGD+SF+pcDNA組，OGD+SF+pcDNA-NLRP3組圖6 各組NLRP3蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖7 各組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡流式圖

表3 各組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞存活、凋亡、LDH釋放和NLRP3、Bcl-2及Bax蛋白比較

3 討 論

既往研究表明，SF對(duì)心、腦血管、神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用。如SF預(yù)處理可明顯增強(qiáng)H9C2細(xì)胞活力，增強(qiáng)其抗缺氧復(fù)氧損傷能力〔8〕。SF后處理還可改善心肌缺血再灌注情況，降低心肌梗死率〔9〕。此外，SF通過抑制脊髓神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)S-100蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)〔10〕。正常情況下，LDH主要存在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激損傷或凋亡時(shí)LDH可穿過細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞外，因此通過檢測(cè)LDH釋放率可直接反映細(xì)胞損傷程度〔11〕。Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要參與者，Bcl-2通過與Bax結(jié)合形成異二聚體，減少Bax二聚體形成，抑制細(xì)胞色素c的釋放，抑制細(xì)胞凋亡〔12〕。本研究說明SF對(duì)OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

NLRP3是腦損傷后引起細(xì)胞炎性損傷的重要介質(zhì)。隨著缺血和周圍區(qū)域內(nèi)的局部或循環(huán)炎癥細(xì)胞的激活，促炎細(xì)胞因子將大量產(chǎn)生和釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡〔13～15〕。最近研究表明，阻斷NLRP3炎癥體活化對(duì)缺血性腦卒中具有神經(jīng)保護(hù)作用〔16〕。Ye等〔17〕研究指出，美異靛藍(lán)可能通過調(diào)控TLR/核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號(hào)通路，抑制NLRP3活化和相關(guān)蛋白表達(dá)，進(jìn)而對(duì)缺血性腦損傷具有保護(hù)作用。Jiang等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)通過電針刺激減弱腦缺血性損傷和神經(jīng)炎癥與NLRP3炎性小體有關(guān)。此外，miR-190通過下調(diào)NLRP3表達(dá)還可減輕帕金森病小鼠模型的神經(jīng)元損傷和神經(jīng)炎癥反應(yīng)〔19〕。本研究與既往體外研究結(jié)果相一致〔13〕，說明SF通過下調(diào)NLRP3表達(dá)進(jìn)而減輕OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。

綜上，SF對(duì)OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與抑制NLRP3表達(dá)有關(guān)。