陳紅陽 賈壯壯 趙磊 趙晨陽 郭利平

(1天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120；天津中醫(yī)藥大學(xué)；2第一附屬醫(yī)院；3組分中藥國家重點實驗室)

缺血性腦卒中是嚴重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點〔1〕，其發(fā)生發(fā)展過程中主要涉及興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)及細胞凋亡等一系列復(fù)雜的生理及病理機制〔2〕。目前，重組組織型纖溶酶原激活劑(rtPA)被認為是最有效的治療方法。血腦屏障(BBB)結(jié)構(gòu)及功能的完整性是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵部分，其中內(nèi)皮細胞形成緊密連接(TJs)，保護BBB結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定，可有效減少腦損傷后的神經(jīng)元損傷〔3〕。越來越多的研究從僅關(guān)注包括內(nèi)皮細胞在內(nèi)的BBB及神經(jīng)元，逐漸轉(zhuǎn)化為關(guān)注包括神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞、周細胞、星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞在內(nèi)的神經(jīng)血管單元(NVU)，強調(diào)多細胞、多機制在腦卒中發(fā)生發(fā)展過程中的作用〔4〕。

缺血性腦卒中屬于中醫(yī)的“中風”范疇，其病理性質(zhì)多為本虛標實，氣虛血瘀為本病重要的病理機制之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣活血法為名老中醫(yī)治療缺血性腦卒中的主要治法，黃芪-川芎藥對為重要藥物組合〔5〕。黃芪可補氣健脾、益衛(wèi)固表，川芎可活血行氣、散瘀止痛。黃芪甲苷與川芎嗪分別作為黃芪和川芎的主要活性成分，均可有效減輕腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮良好的神經(jīng)保護作用〔6，7〕。本研究采用黃芪甲苷與川芎嗪組分配伍，探討二者對腦缺血再灌注損傷大鼠NVU的保護作用。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級Wistar大鼠60只，體質(zhì)量250～270 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2016-0006，飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。

1.2藥物及試劑 黃芪甲苷(上海士峰生物科技有限公司，批號：20072518)；川芎嗪(成都曼思特生物科技有限公司，批號：MUST-200514103)；依達拉奉注射液(南京先聲東元制藥有限公司，批號：80-170510)；免疫染色通透液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號P0096)；冰凍切片抗原修復(fù)液(北京索萊寶科技有限公司，批號C1035)；離子鈣結(jié)合銜接分子(Iba)1抗體，血小板衍生生長因子受體(PDGFR)β抗體(英國Abcam公司，批號分別為ab178846，ab32570)；神經(jīng)元特異核蛋白(NeuN)抗體，膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)抗體(美國CST公司，批號24307，3670)；番茄凝集素(LEL，美國Vectorlab公司，批號B-1175)。

1.3主要儀器 IX73型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；DM750M Leica顯微鏡(德國LEICA公司)；CM-1950冰凍切片機(德國LEICA公司)。

1.4模型制備 參考Long〔8〕改良線栓法，制備大鼠大腦中動脈栓塞/再灌注(MCAO/R)模型，方法如下：予以3%異氟烷氣體麻醉大鼠，并將其固定，采用多普勒腦血流儀監(jiān)測大鼠局部腦血流變化；將大鼠頸部沿正中線切開，分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內(nèi)動脈(ICA)，于ECA近心端剪V形切口，然后將線栓從V形口緩慢插入大腦中動脈，觀察大鼠腦血流變化。大腦中動脈栓塞1.5 h后再灌注。假手術(shù)組不做插線栓處理，其余操作同前。

1.5分組與給藥 大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、依達拉奉組(6 mg/kg)、黃芪甲苷組(40 mg/kg)、川芎嗪組(20 mg/kg)、黃芪甲苷配伍川芎嗪(配伍用藥)組(40 mg/kg+20 mg/kg)，每組10只。造模后各組分別進行腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)給藥7 d，假手術(shù)組和模型組分別注射等容積生理鹽水。

1.6神經(jīng)功能評分 參照改良神經(jīng)功能(mNSS)評分標準〔9〕，進行大鼠神經(jīng)功能評分。評價包括運動測試、感覺測試、平衡測試、反射測試、異常運動。五項測試評分之和為神經(jīng)功能總得分，總得分越高，大鼠神經(jīng)功能缺損程度越嚴重。

1.7蘇木素-伊紅(HE)染色 大鼠腦缺血再灌注7 d后，斷頭取腦，腦組織使用4%多聚甲醛溶液固定48 h后，做厚度5 μm的連續(xù)冠狀石蠟切片，進行常規(guī)HE染色〔10〕。將石蠟切片經(jīng)脫蠟水化處理后，浸于蘇木素染液5 min，鹽酸乙醇分化30 s，伊紅染液浸染15 s，通過乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，于高倍鏡下觀察HE染色情況。

1.8尼氏(Nissl)染色 將石蠟切片經(jīng)脫蠟水化處理后，浸于Nissl染液中，56℃恒溫浸染1 h，使用Nissl染色分化液分化30 s，通過乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，于高倍鏡下觀察Nissl染色情況。

1.9免疫熒光染色法檢測NUV 大鼠腦缺血再灌注7 d后，斷頭取腦，將大鼠新鮮腦組織經(jīng)最優(yōu)切削溫度(OCT)包埋后，于-20℃做厚度為20 μm的連續(xù)冠狀冰凍切片。冰凍切片經(jīng)通透、抗原修復(fù)、封閉后，在切片上滴加一抗，即LEL(1∶200)、Iba1(1∶400)抗體、PDGFRβ(1∶200)抗體、NeuN(1∶200)抗體、GFAP(1∶400)抗體，4℃孵育過夜；次日于37℃下避光孵育熒光二抗；使用DAPI溶液染核，滴加抗熒光淬滅封片劑，于倒置熒光顯微鏡下觀察NVU各個組成部分的陽性細胞表達情況。

2 結(jié) 果

2.1對神經(jīng)功能缺損的影響 mNSS評分結(jié)果顯示，假手術(shù)組神經(jīng)功能〔(0.0±0.0)分〕正常；模型組神經(jīng)功能〔(13.0±1.2)分〕缺損嚴重；與模型組比較，依達拉奉組〔(5.5 ± 1.4)分〕、黃芪甲苷組〔(8.0 ± 1.3)分〕、川芎嗪組〔(8.2 ± 1.8)分〕、配伍用藥組mNSS評分均顯著降低(P<0.01)，配伍用藥組改善程度優(yōu)于黃芪甲苷組和川芎嗪組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2對缺血半暗帶組織形態(tài)的影響 HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大腦皮層細胞形態(tài)規(guī)則，排列致密有序，核仁清晰可見；模型組出現(xiàn)大面積壞死區(qū)域，細胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)嚴重破壞，間質(zhì)水腫，呈高度疏松篩網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，部分細胞核固縮；黃芪甲苷組及川芎嗪組，缺血半暗帶組織形態(tài)較模型組顯著改善，壞死組織疏松篩網(wǎng)狀程度減輕，且配伍用藥組改善情況明顯優(yōu)于單獨應(yīng)用，見圖1。

2.3對缺血半暗帶Nissl染色的影響 假手術(shù)組大鼠腦缺血半暗帶Nissl體數(shù)目豐富，體積大，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常；模型組Nissl體數(shù)量顯著減少，神經(jīng)元皺縮變形，結(jié)構(gòu)破壞嚴重，排列不規(guī)則；與模型組比較，各治療組Nissl體數(shù)目顯著增加，染色加深，體積增大，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)改善，且配伍用藥組效果優(yōu)于黃芪甲苷或川芎嗪組，見圖2。

2.4對NVU各個組成部分的影響

2.4.1對NVU內(nèi)皮細胞損傷的影響 假手術(shù)組內(nèi)皮細胞表達豐富，血管表現(xiàn)為連續(xù)的線條狀，分布密集；與假手術(shù)組比較，模型組內(nèi)皮細胞表達顯著下調(diào)(P<0.01)，血管分布稀疏，連續(xù)性差；與模型組比較，黃芪甲苷及川芎嗪可顯著上調(diào)內(nèi)皮細胞表達(P<0.05，P<0.01)，改善血管形態(tài)，且配伍用藥組改善程度優(yōu)于單獨應(yīng)用(P<0.01)，見圖3，表1。

2.4.2對NVU周細胞損傷的影響 與假手術(shù)組比較，模型組腦缺血半暗帶PDGFRβ陽性表達顯著下調(diào)(P<0.01)，周細胞損傷嚴重；與模型組比較，各用藥組顯著改善腦缺血半暗帶周細胞損傷，上調(diào)PDGFRβ陽性表達(P<0.01)，且配伍用藥組療效顯著優(yōu)于單獨應(yīng)用(P<0.01)，見表1，圖4。

圖1 黃芪甲苷與川芎嗪對腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶組織形態(tài)改變的影響(HE染色，×200)

圖2 黃芪甲苷與川芎嗪對腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶Nissl染色的影響(Nissl染色，×200)

圖3 黃芪甲苷與川芎嗪對腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶內(nèi)皮細胞表達的影響(IF，×200)

表1 黃芪甲苷與川芎嗪對腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶NVU組成部分的影響

圖4 黃芪甲苷與川芎嗪對腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶PDGFRβ表達的影響(IF，×200)

2.4.3對NVU神經(jīng)元損傷的影響 假手術(shù)組NeuN陽性細胞豐富，分布均勻；與假手術(shù)組比較，模型組NeuN陽性細胞數(shù)明顯減少(P<0.01)，神經(jīng)元排列紊亂，分布稀疏；與模型組比較，黃芪甲苷及川芎嗪干預(yù)后，NeuN陽性細胞數(shù)量顯著增加(P<0.01)；配伍用藥組NeuN陽性細胞數(shù)目顯著多于黃芪甲苷組、川芎嗪組(P<0.01)，見表1，圖5。

2.4.4對NVU星形膠質(zhì)細胞活化的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血半暗帶GFAP陽性細胞增生肥大，陽性細胞數(shù)目增加(P<0.01)，星形膠質(zhì)細胞過度活化；與模型組比較，黃芪甲苷及川芎嗪顯著抑制了GFAP陽性細胞的增生肥大，下調(diào)活化細胞數(shù)目(P<0.01)，且配伍用藥組療效優(yōu)于單獨應(yīng)用(P<0.01)，見表1，圖6。

圖5 黃芪甲苷與川芎嗪對腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶神經(jīng)元表達的影響(IF，×200)

圖6 黃芪甲苷與川芎嗪對腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶GFAP表達的影響(IF，×200)

2.4.5對NVU小膠質(zhì)細胞極化的影響 假手術(shù)組小膠質(zhì)細胞呈胞體較小、分枝較長的分枝狀；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血半暗帶Iba1陽性細胞胞體增大，突起變短，呈阿米巴狀，表達數(shù)明顯升高(P<0.01)，小膠質(zhì)細胞極化程度高；與模型組比較，黃芪甲苷及川芎嗪顯著抑制小膠質(zhì)細胞極化，改善阿米巴狀變化，下調(diào)陽性細胞表達數(shù)(P<0.01)，且配伍用藥效果優(yōu)于黃芪甲苷或川芎嗪單用(P<0.01)，見表1，圖7。

圖7 黃芪甲苷與川芎嗪對腦缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶Iba1表達的影響(IF，×200)

3 討 論

NVU由神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞、周細胞、星型膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞組成，隨著腦卒中的治療策略由僅關(guān)注“神經(jīng)保護”轉(zhuǎn)變?yōu)殛P(guān)注腦卒中病程涉及的“多細胞保護”〔11〕，NVU在腦卒中恢復(fù)中發(fā)揮的作用越來越受到重視〔12〕。對NVU所有組成部分的關(guān)注、對多細胞間信號及細胞與細胞外基質(zhì)之間的信號傳導(dǎo)的研究，對于闡明缺血性腦卒中至關(guān)重要。中藥具有多組分、多靶點、多機制的作用特點，符合NVU多細胞的結(jié)構(gòu)、功能特點及“多細胞保護”治療策略。

NVU強調(diào)多細胞在結(jié)構(gòu)與功能上的相互支持，其中內(nèi)皮細胞是腦微血管的主要組成部分，其結(jié)構(gòu)及功能的完整直接影響腦部微循環(huán)，在腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元的恢復(fù)過程中發(fā)揮重要作用；周細胞覆蓋于微血管內(nèi)皮細胞周圍，并嵌入到腦血管之外的基底膜〔13〕，與內(nèi)皮細胞共同參與維持BBB結(jié)構(gòu)與功能，并能調(diào)節(jié)毛細血管收縮和舒張，參與調(diào)節(jié)血管生成及免疫反應(yīng)等。周細胞損傷后，BBB結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)異常〔14〕，可引起凝血酶原、纖維蛋白原等血清蛋白及神經(jīng)元或血管損傷后釋放的其他毒性物質(zhì)進入腦實質(zhì)，并促進小膠質(zhì)細胞極化水平，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥反應(yīng)〔15〕；小膠質(zhì)細胞作為神經(jīng)系統(tǒng)中重要的免疫細胞，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，參與炎癥級聯(lián)反應(yīng)，在腦缺血再灌注損傷后免疫和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用〔16〕，有研究〔17〕認為極化后的小膠質(zhì)細胞由分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)椤鞍⒚装蜖睢?，可釋放炎癥介質(zhì)并募集炎癥細胞，加劇腦缺血再灌注損傷；也有研究〔18〕發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞具有高度可塑性，受特定的微環(huán)境刺激可呈現(xiàn)不同表型，進而發(fā)揮損傷和修復(fù)的雙重功能；星形膠質(zhì)細胞是膠質(zhì)細胞另一重要成員，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最豐富的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，可參與維持離子穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)遞質(zhì)清除及神經(jīng)元的能量供應(yīng)，與突觸在結(jié)構(gòu)上有密切聯(lián)系〔19〕，并且與神經(jīng)元及血管細胞連接，以提供對大腦更多功能的廣泛控制。星形膠質(zhì)細胞不僅在生理條件下參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能，并對病理條件下腦功能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，腦缺血再灌注損傷可激活星形膠質(zhì)細胞，由靜息狀態(tài)向活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，活化的星形膠質(zhì)細胞稱之為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞，出現(xiàn)胞體肥大、中間絲蛋白表達水平增高等細胞形態(tài)和功能的變化，過度活化的星形膠質(zhì)細胞在腦缺血再灌注損傷后引發(fā)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用〔20〕。中醫(yī)認為，氣虛血瘀是缺血性腦卒中的主要病理機制之一〔21〕，益氣活血法可顯著改善缺血性腦卒中神經(jīng)功能損傷，但對NVU多細胞保護作用及機制尚不明確。益氣活血代表中藥黃芪及川芎已廣泛應(yīng)用在腦卒中的臨床治療中，黃芪為補中益氣要藥，《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》曰：“能補氣，兼能升氣”，其主要有效成分黃芪甲苷可通過調(diào)節(jié)線粒體能量代謝、抑制細胞凋亡、促進血管新生等多個環(huán)節(jié)改善腦缺血再灌注損傷〔22〕；川芎為“血中之氣藥”，并能“上行頭目”，《神農(nóng)本草經(jīng)》言其“主中風入腦，頭痛”，《長沙藥解》言其能“行經(jīng)脈之閉塞”，研究表明〔23〕，其主要有效成分川芎嗪可通過抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)血小板黏附、促進神經(jīng)再生等途徑改善缺血性腦損傷。

本研究通過線栓法誘導(dǎo)大鼠腦缺血再灌注損傷，采用黃芪甲苷及川芎嗪組分配伍應(yīng)用。黃芪甲苷及川芎嗪干預(yù)后，可顯著改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損及缺血半暗帶組織形態(tài)學(xué)改變，改善腦微血管內(nèi)皮細胞及周細胞損傷，抑制星形膠質(zhì)細胞過度活化及小膠質(zhì)細胞極化程度，促進神經(jīng)元損傷修復(fù)，進而改善MCAO/R大鼠NVU結(jié)構(gòu)及功能，且二藥配伍應(yīng)用治療效果優(yōu)于單獨應(yīng)用。