邵亞 李紅

(1甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院)

阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病〔1〕，其病理改變當(dāng)下流行的觀點(diǎn)認(rèn)為是β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積導(dǎo)致老年斑形成、神經(jīng)纖維纏結(jié)及廣泛神經(jīng)元缺失〔2〕。自噬是一種重要的蛋白質(zhì)降解途徑，病態(tài)的自噬功能將會(huì)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Aβ的生成。自噬缺陷發(fā)生在AD的早期，自噬啟動(dòng)，特征蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ?qū)@著性地增長(zhǎng)〔3,4〕。本實(shí)驗(yàn)觀察雷公藤紅素(Qu)干預(yù)下的AD大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力的提高及特征性自噬蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的變化、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病中有毒蛋白Aβ、p-Tau的表達(dá)變化，來探索Qu治療AD可能的機(jī)制是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬途徑來實(shí)現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心120只SPF級(jí)Wistar大鼠，體重為(250±10)g。從中分出20只為對(duì)照組，雙側(cè)海馬給予同等劑量的生理鹽水代替造模藥物。剩下100只，采用Aβ1～42至大鼠雙側(cè)海馬構(gòu)建AD模型，造模后隨機(jī)分為5組(AD模型組、Qu高、中、低劑量組、雷帕霉素組)，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，規(guī)律晝夜光照。

1.2試劑與藥物 Qu(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：209B021)；雷帕霉素(索萊寶公司，批號(hào)：412H031)；Aβ1～40抗體(Bioss，批號(hào)：AG10091626)；Beclin 1抗體(Abcam公司，批號(hào)：GR 3198372-7)；Phospho-Tau(Bioss，批號(hào)：AE121775)；Beta-Amyloid(ANASPEC PEPTIDE，批號(hào)：1855817)；兔SP試劑盒(中杉金橋，批號(hào)：SP9001)。

1.3造模與給藥 濃度10%的水合氯醛(4 ml/kg)麻醉大鼠，用鼠腦立體定位儀，體位保持門齒鉤平面低于耳間線平面約2.4 mm，前后鹵處相同平面。將大鼠的頭頂部位去毛備皮并消毒，從頭顱中線開顱，對(duì)照Paxinosand Waston，腦立體定位儀確定前囟后3.3 mm，中線雙側(cè)旁開2.0 mm的位置為雙側(cè)海馬CA1區(qū)，用牙科鉆鉆開骨窗，膜下2.8 mm，以0.5 μl/min的速度緩慢注入Aβ1～42溶液5 μl，保持5 min，充分彌散，撤針，縫合，在縫合處滴注0.2 ml慶大霉素防止大鼠被感染。將對(duì)照組大鼠進(jìn)行同樣的手術(shù)操作，使用同體積的生理鹽水代替造模所用Aβ1～42溶液。在造模后的次日直至第25天，配制Qu 0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、2.0 mg/ml濃度試劑，按1.0 mg/(kg·d)劑量分別腹腔注射于Qu低、中、高劑量組，每日9～10點(diǎn)給藥。同時(shí)雷帕霉素組配制溶液為1.0 mg/ml試劑，按1.0 mg/(kg·d)劑量，每日同時(shí)間腹腔注射，而對(duì)照組則給予等劑量的生理鹽水每日腹腔注射。

1.4取材及組織處理 每組選擇一半大鼠，分離雙側(cè)海馬用于蘇木素-伊紅(HE)染色分析和海馬Aβ、p-Tau表達(dá)免疫組化測(cè)定；剩余的一半，分離雙側(cè)海馬用于Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)Western印跡檢測(cè)。 10%水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)200 ml灌注沖洗血管床約20 min，直至流出液體清亮，4%多聚甲酸灌注30 min，切取包含海馬的腦組織。4%多聚甲醛固定48 h，常規(guī)石蠟包埋，切4 μm的切片，附于防脫載玻片，6℃烤箱過夜干燥用于免疫組化(SABC)方法分析海馬各亞區(qū)中Aβ1～40、p-Tau的表達(dá)量。冰上分離海馬，液氮保存，隨后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存，用于Western印跡檢測(cè)。

1.5指標(biāo)與檢測(cè)方法 利用Morris水迷宮測(cè)試各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。制作腦組織海馬HE染色切片，用Olympus顯微圖像分析系統(tǒng)觀察和分析大鼠海馬結(jié)構(gòu)、神經(jīng)元形態(tài)和免疫組化陽性細(xì)胞。HE染色后的細(xì)胞不同結(jié)構(gòu)的顏色和形態(tài)分別為：細(xì)胞核核仁呈現(xiàn)藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色，調(diào)亡細(xì)胞形態(tài)為細(xì)胞核腫脹、核仁顏色變淡，細(xì)胞核模糊，細(xì)胞排列松散。免疫組化法觀察大鼠海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)各亞區(qū)神經(jīng)元Aβ1～40和p-Tau蛋白的陽性表達(dá)情況，陽性結(jié)果：在胞質(zhì)區(qū)域呈現(xiàn)棕黃色；細(xì)胞核呈藍(lán)色。計(jì)算表達(dá)率：圖像采集后使用 Image-Pro Plus6.0 圖像分析軟件計(jì)算出圖像中陽性染色的平均光密度值。Western印跡法測(cè)定海馬中蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析，組間兩兩比較釆用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Morris水迷宮檢測(cè)各組學(xué)習(xí)記憶能力改善的比較 實(shí)驗(yàn)各組大鼠隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，逃避潛伏期均呈現(xiàn)逐漸減少趨勢(shì)。組間兩兩比較，與AD模型組相比，第1天訓(xùn)練成績(jī)只有對(duì)照組有差異(P<0.05)，余各組均無明顯差異；第2、3、4，5天訓(xùn)練成績(jī)只有Qu低劑量組無明顯差異，余各組均有明顯差異(P<0.05)。Qu各組隨藥物劑量增加，學(xué)習(xí)記憶能力改善明顯，且雷帕霉素組優(yōu)于雷公藤紅素各組(P<0.05)?？臻g探索試驗(yàn) Morris水迷宮訓(xùn)練4天后，第5天開始撤出平臺(tái)開展對(duì)大鼠空間探索能力的測(cè)試，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，AD模型組有效區(qū)域滯留時(shí)間和有效區(qū)域滯留時(shí)間百分比、逃避平臺(tái)滯留時(shí)間顯著縮短(P<0.05)；與AD模型組相比，Qu高、中、低劑量組、雷帕霉素組有效區(qū)域滯留時(shí)間和有效區(qū)域滯留時(shí)間百分比、逃避平臺(tái)滯留時(shí)間明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。Qu高、中、低劑量組有效區(qū)域滯留時(shí)間和有效區(qū)域滯留時(shí)間百分比隨著劑量減少而減少，雷公藤紅素高、中、低劑量組有效區(qū)域滯留時(shí)間和有效滯留時(shí)間百分比的平均值、逃避平臺(tái)滯留時(shí)間均低于雷帕霉素組。見表1。

2.2形態(tài)學(xué)觀察及HE染色 對(duì)照組大鼠海馬CA區(qū)細(xì)胞大鼠形態(tài)如U形，與此相對(duì)可見V形齒狀回，所見組織結(jié)構(gòu)清晰，見圖1。AD模型組可見CA 區(qū)神經(jīng)元顯著丟失，錐形細(xì)胞呈松散排列，部分細(xì)胞核仁不清，細(xì)胞核腫脹模糊，正常體積的錐形細(xì)胞明顯減少；對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞飽滿、錐形細(xì)胞呈緊密排列，核仁染色清楚，細(xì)胞核輪廓清晰，體積正常，均勻一致。Qu高劑量組、雷帕霉素組與AD模型組比較海馬組織病理學(xué)顯著改善，Qu低劑量組、Qu中劑量組與AD模型組比較海馬組織病理學(xué)改善不顯著，見圖2。

表1 各組5 d逃避潛伏期、有效區(qū)域的滯留時(shí)間、百分比比較

2.3海馬中蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá) AD模型組Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，Qu高、中、低劑量組、雷帕霉素組顯著高于AD模型組(均P<0.05)，其中Qu的各劑量組隨著藥物劑量的增加，海馬中Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)量逐漸增加。雷帕霉素組優(yōu)于Qu各組。見表2、圖3。

2.4免疫組化測(cè)定海馬Aβ1～40、p-Tau表達(dá) AD模型組海馬Aβ1～40、p-Tau表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，Qu高、中、低劑量組、雷帕霉素組海馬Aβ1～40表達(dá)量顯著低于AD模型組(均P<0.05)。其中Qu的各劑量組隨著藥物劑量的增加，海馬Aβ1～40、p-Tau的表達(dá)量逐漸減少。雷帕霉素組優(yōu)于雷公藤紅素各組。見表2。

圖1 對(duì)照組海馬CA區(qū)組織結(jié)構(gòu)(HE染色，×40)

圖2 各組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)(HE染色，×200)

表2 海馬中蛋白Beclin-1、LC3-II、Aβ1-40、p-Tau表達(dá)值)

1～6:AD模型組、對(duì)照組、Qu低劑量組、Qu中劑量組、Qu高劑量組、雷帕霉素組圖3 各組大鼠海馬內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達(dá)

3 討 論

AD主要病理學(xué)改變?yōu)榇竽X尤其是海馬區(qū)組織的萎縮、Aβ沉積形成的老年斑(SP)、Tau 蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)及選擇性神經(jīng)元丟失等〔4，5〕。關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，只是存在多種假說，包括Aβ毒性學(xué)說、Tau 蛋白異常修飾學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、基因突變學(xué)說、脂代謝紊亂學(xué)說、炎癥學(xué)說和膽堿能損傷學(xué)說等〔6，7〕。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)AD的研究深入持續(xù)多年，但目前尚未對(duì)AD的罹患原因在機(jī)制方面有明確的結(jié)論〔8～10〕。中醫(yī)是我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，有著自己獨(dú)特的診療體系及思維，隨著對(duì)中醫(yī)藥治療AD的研究深入，單味藥物，復(fù)方制劑在臨床中的運(yùn)用比比可見，而且大量學(xué)者對(duì)單味中藥及復(fù)合中藥方劑的藥理作用做了大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，力圖從中發(fā)現(xiàn)中藥及中藥方劑的有效成分及治療AD的作用機(jī)制。本研究進(jìn)一步表明AD可能與自噬機(jī)制相關(guān)，Qu可能是通過調(diào)節(jié)自噬機(jī)制來改善AD的記憶學(xué)習(xí)障礙，但AD的發(fā)生機(jī)制尚不完全明確，多環(huán)節(jié)，多層系性，極其復(fù)雜，所以Qu干預(yù)AD大鼠模型的機(jī)制尚不完全明確，仍需廣泛和深入的研究。