李莉 劉茹 何晶 陳云 郭娟 陳紅 劉玲

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065)

失眠為最常見(jiàn)的睡眠障礙和第二大精神障礙〔1〕，其主要特征為睡眠質(zhì)量、睡眠啟動(dòng)或睡眠維持不佳，并伴有嚴(yán)重的痛苦和日間功能障礙〔2〕。據(jù)估計(jì)，大約有30%的成年人受到睡眠障礙的困擾，其中6%～10%被診斷為失眠〔3〕，其主要見(jiàn)于年齡較大人群〔2〕。一項(xiàng)有關(guān)失眠在我國(guó)普通人群中的綜合發(fā)病率Meta分析顯示，我國(guó)失眠綜合患病率為15%，且正在逐步年輕化，平均年齡小于43.7歲的患病率明顯高于43.7歲及以上人群〔4〕。長(zhǎng)期失眠會(huì)誘發(fā)多種疾病，同時(shí)，失眠也是抑郁癥、躁郁癥、焦慮癥、糖尿病等多種疾病的常見(jiàn)的并發(fā)癥〔5,6〕。目前，西醫(yī)治療失眠的主要手段為藥物治療和認(rèn)知行為療法，但由于藥物往往會(huì)引起過(guò)度鎮(zhèn)靜、耐受、成癮和神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)及認(rèn)知行為療法的資源稀缺、費(fèi)用昂貴，難以推廣等問(wèn)題〔3〕，許多失眠患者轉(zhuǎn)而求助于非處方藥物。中藥是我國(guó)最常見(jiàn)的治療失眠的方法之一，溫膽湯最初記載于姚僧垣所著的《集驗(yàn)方》中，主要用于治療由“痰”而引起的各種病癥〔7〕。中醫(yī)認(rèn)為，失眠病位在心，與五臟六腑密切相關(guān)，病機(jī)為痰熱內(nèi)擾〔8〕。既往研究結(jié)果顯示，溫膽湯及其加減方可顯著改善失眠患者睡眠質(zhì)量，并具有作用溫和、副作用小及治療復(fù)發(fā)率低等優(yōu)點(diǎn)〔9〕。近來(lái)，研究表明睡眠障礙會(huì)對(duì)線粒體造成影響〔10〕。大腦具有較高的代謝率和能量需求，線粒體作為細(xì)胞產(chǎn)能的主要場(chǎng)所，大腦很大程度上依賴于線粒體功能〔11〕，因此，本研究通過(guò)構(gòu)建失眠小鼠模型探究溫膽湯對(duì)失眠小鼠腦組織線粒體的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料 溫膽湯方劑由湖北省中醫(yī)院門(mén)診中藥房提供，方劑配方為半夏(6 g，批號(hào)：19021091)、竹茹(6 g，批號(hào)：18122371)、麩炒枳實(shí)(6 g，批號(hào)：19031361)、陳皮(9 g，批號(hào)：19051171)、炙甘草(3 g，批號(hào)：19040261)、茯苓(4.5 g，批號(hào)：19061131)。方劑進(jìn)行二次煎制，第一次，加入藥材8倍量水，煎至沸騰后，持續(xù)40 min，過(guò)濾取汁；第二次，加入藥材6倍量水，煎至沸騰后持續(xù)30 min，過(guò)濾取汁，兩次汁液混合后，濃縮成1∶1藥液備用。

實(shí)驗(yàn)用4～5周齡SPF級(jí)昆明種雌性小鼠由三峽大學(xué)提供，共30只，體重為(20±2)g，合格證No.42010200003462，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(鄂)2018-0104。實(shí)驗(yàn)用主要試劑包括艾司唑侖片(華中藥業(yè)股份有限公司，襄陽(yáng))；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，北京，貨號(hào)：R0010、PC0020)；兔抗己糖激酶(HK)1、HK2、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(GLUT)1、β-actin抗體，羊抗兔二抗(武漢貝茵萊生物科技有限公司，武漢，貨號(hào)：PAB30519、PAB30271、MAB37348、PAB36265、SAB43714)；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，上海，貨號(hào)：C2006)；三磷酸腺苷(ATP)含量測(cè)試盒、乳酸測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，南京，貨號(hào)：A095-1-1、A019-2-1)；鋨酸(Ted Pella Inc，美國(guó)，貨號(hào)：18456)；醋酸鈾(Merck KGaA，德國(guó)，貨號(hào)：1005-25g)；戊二醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海，貨號(hào)：30092436)。實(shí)驗(yàn)用主要儀器包括全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀(上海天能科技有限公司，上海，型號(hào)：Tanon-5200)；流式細(xì)胞儀(ACEA，美國(guó)，型號(hào)：NovoCyte)；酶標(biāo)儀(Ladsystems，美國(guó)，型號(hào)：MK3)；透射電鏡(日立，日本，型號(hào)：HT7700)。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建失眠小鼠模型 30只SPF級(jí)昆明種雌性小鼠，隨機(jī)挑取24只采用改良版水平轉(zhuǎn)盤(pán)睡眠剝奪法構(gòu)建失眠模型〔12〕。使用亞克力塑料板構(gòu)建一個(gè)長(zhǎng)為110 cm、寬為60 cm、高為40 cm的睡眠剝奪箱，以10 cm的縱向距離和13 cm的橫向距離為標(biāo)準(zhǔn)，在其底部固定15個(gè)高為8 cm、直徑為6.5 cm的圓柱形平臺(tái)，注入23～25℃水至平臺(tái)下1 cm處，保持水溫。待小鼠適應(yīng)性培養(yǎng)7 d后，對(duì)待造模小鼠進(jìn)行站立訓(xùn)練，將其放置于圓柱平臺(tái)上，當(dāng)小鼠即將入睡時(shí)，由于肌肉松弛垂頭觸水或落入水中而驚醒，使其被迫保持清醒站立。造模期間(2 w)，小鼠于早晚各拿出休息1次，每次30 min，每2 d記錄1次小鼠行為學(xué)改變(精神狀態(tài)、飲食)、毛發(fā)和體重變化。

1.2.2分組與處理 24只失眠模型小鼠隨機(jī)等分為4組，分別為模型組、溫膽湯低劑量組(10 mg/kg)、溫膽湯高劑量組(45 mg/kg)及艾司唑侖片組(0.15 mg/kg)，剩余6只未造模小鼠設(shè)置為正常對(duì)照組。站立訓(xùn)練第2周(第8天)開(kāi)始進(jìn)行灌胃給藥處理，每次給予0.5 ml藥液灌胃，正常對(duì)照組及模型組小鼠給予0.5 ml蒸餾水灌胃。末次灌胃給藥12 h后，戊巴比妥鈉過(guò)量麻醉處死小鼠(100 mg/kg)，收集腦組織，于-80℃保存。

1.2.3透射電鏡觀察海馬組織和下丘腦線粒體形態(tài) 取各組小鼠海馬組織及下丘腦，于4℃下，使用2.5%戊二醛預(yù)固定30 min以上，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，每次10 min。使用1%鋨酸后固定1 h后，經(jīng)梯度乙醇和梯度丙酮處理脫水，丙酮與環(huán)氧樹(shù)脂進(jìn)行半浸透，純環(huán)氧樹(shù)脂進(jìn)行全浸透。對(duì)固定、脫水、浸透后的樣本進(jìn)行包埋處理和切片處理，得到60 nm超薄切片，使用醋酸鈾避光染色20 min，雙蒸水水洗3次，吸干，枸櫞酸鉛避光染色15 min后，透射電鏡觀察線粒體形態(tài)。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)腦組織細(xì)胞線粒體膜電位 收集各組小鼠腦組織細(xì)胞懸液，取1×106個(gè)細(xì)胞，重懸于0.5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液中，并加入0.5 ml JC-1染色工作液，混合均勻，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。400 r/min離心3 min，收集沉淀，JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入1 ml JC-1染色工作液重懸細(xì)胞，400 r/min離心3 min，重復(fù)以上步驟2次，加入400 μl JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，并使用NovoCyte分析軟件對(duì)其進(jìn)行分析。

1.2.5生化檢測(cè)腦組織中ATP乳酸濃度 取各組小鼠腦組織樣本，根據(jù)ATP及乳酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定其濃度。

1.2.6Western印跡檢測(cè)腦組織HK1、HK2和GLUT1表達(dá)水平 取各組小鼠腦組織樣本，將其剪成細(xì)小碎片，按10 μl/mg的量加入裂解液，裂解至完全裂解，于4℃下，12 000 r/min離心15 min，測(cè)定上清液蛋白濃度，根據(jù)其結(jié)果上樣至SDS-PAGE凝膠，電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。使用5%脫脂牛奶于4℃低溫環(huán)境中封閉過(guò)夜，加入1∶1 000稀釋的HK1、HK2、GLUT1、β-actin抗體，室溫孵育1 h，PBST洗滌5 min，重復(fù)洗滌3次，加入1∶20 000稀釋二抗，室溫孵育1 h，PBST洗滌5 min，重復(fù)洗滌3次。于暗室中加入ECL發(fā)光液進(jìn)行反應(yīng)后，在全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)結(jié)果并讀取灰度值，以β-actin為內(nèi)參分析其灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1溫膽湯方劑對(duì)失眠小鼠體重的影響 與正常對(duì)照組〔(34.02±2.55)g〕比較，失眠模型組精神狀態(tài)及毛發(fā)較差，飲食量減少，體重〔(19.60±0.72)g〕顯著減輕(P<0.05)。與模型組比較，溫膽湯低劑量組〔(23.52±0.84)g〕、高劑量組〔(26.13±1.73)g〕及艾司唑侖片組體重〔(28.75±1.67)g〕顯著增加(P<0.05)，小鼠的精神狀態(tài)、毛發(fā)及飲食情況均得到改善。

2.2溫膽湯方劑對(duì)失眠小鼠腦組織線粒體結(jié)構(gòu)的影響 正常對(duì)照組海馬組織和下丘腦中線粒體數(shù)量較多，其形態(tài)正常，線粒體嵴清晰。失眠模型組海馬組織和下丘腦中線粒體數(shù)量減少，線粒體出現(xiàn)明顯腫脹、破損，大部分嵴斷裂、溶解，出現(xiàn)空白區(qū)域，形成空泡樣。與模型組比較，溫膽湯方劑組及艾司唑侖片組腦組織中線粒體損傷有所改善，且溫膽湯方劑高劑量組的改善效果優(yōu)于溫膽湯方劑低劑量組。見(jiàn)圖1。

圖1 各組海馬組織及下丘腦線粒體結(jié)構(gòu)比較(×8 000)

2.3溫膽湯方劑對(duì)失眠小鼠腦組織線粒體膜電位的影響 流式檢測(cè)各組腦組織細(xì)胞線粒體膜電位結(jié)果顯示，較正常對(duì)照組〔(8.81±0.60)%〕，模型組線粒體膜電位下降細(xì)胞所占比例〔(46.58±0.77)%〕顯著增加(P<0.05)。給藥干預(yù)后，與模型組相比，溫膽湯低劑量〔(34.23±1.35)%〕、溫膽湯高劑量組〔(23.56±0.65)%〕及艾司唑侖片組中線粒體膜電位下降細(xì)胞所占比例〔(20.79±0.33)%〕均顯著減少(P<0.05)，且溫膽湯方劑高劑量組減少效果顯著優(yōu)于溫膽湯方劑低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組腦組織細(xì)胞線粒體膜電位變化

2.4溫膽湯方劑對(duì)失眠小鼠腦組織線粒體功能的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組腦組織中ATP濃度降低，乳酸濃度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)溫膽湯方劑和艾司唑侖片干預(yù)治療后，ATP及乳酸濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且溫膽湯高劑量組的影響效果高于低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.5溫膽湯方劑對(duì)失眠小鼠腦組HK1、HK2和GLUT1表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組腦組織中HK1、HK2和GLUT1表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，溫膽湯低、高劑量組及艾司唑侖片組腦組織中HK1、HK2和GLUT1表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且溫膽湯濃度越高，表達(dá)下降越多(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖3。

表1 各組腦組織ATP、乳酸水平及HK1、HK2和GLUT1蛋白表達(dá)水平比較

1～5：正常對(duì)照組，模型組，溫膽湯低劑量組，溫膽湯高劑量組，艾司唑侖片組圖3 Western印跡檢測(cè)腦組織HK1、HK2和GLUT1蛋白表達(dá)水平

3 討 論

失眠可影響各年齡階層人群，但其多發(fā)與于婦女及老年人群〔2〕。近年來(lái)，隨著快速的城市化和工業(yè)化，年輕人經(jīng)常面臨職業(yè)壓力，夜間長(zhǎng)時(shí)間工作，及其對(duì)電腦、智能手機(jī)等新媒體的廣泛使用等問(wèn)題，打亂了其生物睡眠節(jié)奏，誘發(fā)導(dǎo)致年輕人群中失眠發(fā)病率增加〔4〕。中醫(yī)認(rèn)為失眠病因多為虛實(shí)兩證，即肝郁、痰熱、心火等相關(guān)實(shí)證和心脾氣血虛弱有關(guān)虛證。溫膽湯溫涼兼顧，以半夏為君藥，竹茹為臣藥，君臣相伍，合并燥濕化痰及清熱化痰之效，同時(shí)輔以陳皮和枳殼理氣化痰，茯苓健脾滲濕、絕生痰之源，以達(dá)治療失眠之效〔8〕。本研究結(jié)果進(jìn)一步證明了溫膽湯具有緩解失眠癥狀的療效。

在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，下丘腦作為覺(jué)醒、睡眠中樞與具有睡眠調(diào)節(jié)作用、促進(jìn)慢波睡眠的海馬組織是失眠研究的重要觀察點(diǎn)〔13,14〕。線粒體作為以ATP的形式提供細(xì)胞95%能量的細(xì)胞器對(duì)神經(jīng)元的興奮性、生存以及各腦組織功能的維持至關(guān)重要〔15〕。研究表明，失眠將導(dǎo)致大腦組織線粒體結(jié)構(gòu)損壞和功能障礙〔15〕。短暫的睡眠時(shí)間會(huì)增加線粒體活性氧(ROS)的產(chǎn)生、脂質(zhì)的過(guò)氧化作用及氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因的表達(dá)〔10〕，同時(shí)線粒體作為細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的靶器官，可導(dǎo)致線粒體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷〔16〕。田苗等〔17〕及徐磊等〔18〕分別證明了不同加味溫膽湯可減輕肝臟線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)或減輕腸組織線粒體結(jié)構(gòu)損傷。本研究結(jié)果提示，溫膽湯方劑可緩解失眠小鼠腦組織線粒體結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙。

既往研究表明，細(xì)胞線粒體功能障礙可表現(xiàn)為糖酵解優(yōu)于氧化磷酸化，糖酵解途徑生成乳酸，其途徑ATP生成小于氧化磷酸化途徑，從而導(dǎo)致細(xì)胞呼吸過(guò)程中乳酸生成增多，ATP生成減少〔19～21〕。Wisor等〔22〕研究發(fā)現(xiàn)，在強(qiáng)迫清醒的過(guò)程中腦組織乳酸生成增加。本研究結(jié)果提示，失眠小鼠腦細(xì)胞糖酵解增強(qiáng)，進(jìn)一步解釋了失眠小鼠腦組織ATP濃度降低的可能機(jī)制為糖酵解優(yōu)于氧化磷酸化。GLUT1是促進(jìn)性GLUT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(SLC2)成員，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最保守、分布最廣的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白〔23〕。Cho等〔23〕研究顯示，GLUT1上調(diào)可有助于糖酵解速率和乳酸生成的增加。HK為糖酵解途徑的關(guān)鍵限速酶之一，降低其活性可降低細(xì)胞糖酵解水平〔24〕。因此，GLUT1及HK可用于衡量糖酵解水平。本研究結(jié)果顯示，進(jìn)一步提示溫膽湯可緩解失眠小鼠腦組織線粒體功能障礙。