趙序雯 劉偉 張新東 肖智

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院，山東 滕州 277599)

腎腫瘤的發(fā)病率及死亡率占全身腫瘤的2%左右，其中腎細(xì)胞癌可占85%左右，被認(rèn)為是我國(guó)泌尿外科惡性腫瘤中一類非常常見的惡性腫瘤疾病，但在當(dāng)前臨床研究中，關(guān)于腎癌的發(fā)病機(jī)制尚未明確〔1〕。據(jù)流行病學(xué)專家發(fā)現(xiàn)腎癌的發(fā)生發(fā)展可受到多種因素影響，如吸煙、肥胖、職業(yè)、基礎(chǔ)疾病、飲酒及家族史等〔2〕。也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，由于惡性腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移本身屬于一個(gè)較為復(fù)雜的病理過程，且該過程與細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜降解等多種過程及環(huán)節(jié)有關(guān)，且新生血管的形成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移等具有密切關(guān)聯(lián)性〔3〕。在多種促血管生長(zhǎng)因子中，表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域(EGFL)7被認(rèn)為是促進(jìn)血管管腔形成的必需因子，可在血管管腔形成及功能中發(fā)揮較為重要的作用；血管表皮生長(zhǎng)因子(VEGF)被認(rèn)為是最為重要的一種血管生成正性因子，可有效促進(jìn)調(diào)整血管內(nèi)皮的增殖過程；而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)本身作為一種可在惡性腫瘤中呈現(xiàn)出較高表達(dá)水平的物質(zhì)，在惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖過程中過度表達(dá)〔4,5〕。本文擬分析EGFL7、MMP-9和VEGF在老年腎透明細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬滕州市中心人民醫(yī)院2019年4月至2021年4月收治的老年腎透明細(xì)胞癌患者80例的臨床資料，均簽署知情同意書，其中男42例，女38例，年齡60～72歲，平均(65.24±4.12)歲，均接受根治性腎切除術(shù)治療，選取切除下來的腎透明細(xì)胞癌組織樣本進(jìn)行研究，全部患者按照TNM分期分為Ⅰ期組(n=14)、Ⅱ期組(n=19)、Ⅲ期組(n=27)、Ⅳ期組(n=20)，同時(shí)按照Fuhrman分級(jí)分為1級(jí)組(n=15)、2級(jí)組(n=21)、3級(jí)組(n=30)及4級(jí)組(n=14)。TNM分期指腫瘤原發(fā)灶的情況，隨著腫瘤體積的增加和鄰近組織受累范圍的增加，依次用T1～T4來表示〔6〕。Fuhrman分級(jí)的確定方法是用顯微鏡觀察癌細(xì)胞，根據(jù)癌細(xì)胞的核形態(tài)做分級(jí)，如果異型性越高，分級(jí)就越高，預(yù)后越差。具體分級(jí)方法：Ⅰ級(jí)為高分化；Ⅱ級(jí)為高分化；Ⅲ級(jí)為中分化；Ⅳ級(jí)為低分化(未分化)〔7〕。

1.2組織標(biāo)本選取方法 在手術(shù)過程中使用解剖刀在癌腫部位取出300 mg癌組織后，將癌組織放置在標(biāo)記好的無RNA酶凍存管中保存15 min，隨后放置-80℃冰箱中保存待用。

1.3免疫組織化學(xué)染色方法 采用免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(SP)法測(cè)量EGFL7、MMP-9和VEGF。具體操作方法：選擇含有腫瘤的組織標(biāo)本用石蠟切片固定，烤片后，使用二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水；3%過氧化氫孵育，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌以達(dá)到阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的目的；使用微波抗原修復(fù)，并向其中分別加入正常羊血清及過氧化物酶溶液，孵育后加入一抗4℃孵育過夜，之后加入生物素標(biāo)記二抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素鏈霉菌抗生物素溶液，最后給予二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水及封片處理。采用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組。該實(shí)驗(yàn)中所涉及的免疫組化試劑盒及相關(guān)試劑均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，主要儀器光學(xué)顯微鏡、電熱恒溫培養(yǎng)箱、組織超薄切片機(jī)購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.4結(jié)果判讀 EGFL7、MMP-9和VEGF陽性染色將腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)或包膜出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著判斷為陽性，由兩位病理科醫(yī)生獨(dú)立完成判斷。通過利用高倍鏡下半定量法判斷每張切片內(nèi)單個(gè)視野內(nèi)染色陽性細(xì)胞百分比，陽性細(xì)胞≤10%計(jì)為0；陽性細(xì)胞10%～24%計(jì)+；25%～49%計(jì)為；50%～74%計(jì)為；≥75%計(jì)為〔8〕。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1EGFL7、MMP-9和VEGF在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)情況 在Fuhrman分級(jí)4級(jí)的腎透明細(xì)胞癌中，EGFL-7在胞質(zhì)中呈現(xiàn)高表達(dá)，尤其在毛細(xì)血管形成區(qū)域表達(dá)較高；MMP-9在胞質(zhì)中出現(xiàn)淡黃色或棕色顆粒；VEGF也在毛細(xì)血管周圍的腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜中高表達(dá)。見圖1。

圖1 EGFL7、MMP-9和VEGF在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)情況(DAB，×100)

2.2不同TNM分期下EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率對(duì)比 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期組分別與Ⅰ期組相比，EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率較高，Ⅲ、Ⅳ期組分別與Ⅱ期組相比陽性率較高，Ⅳ與Ⅲ期組相比陽性率較高(P<0.05)。見表1。

2.3不同F(xiàn)uhrman分級(jí)EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率對(duì)比 2、3、4級(jí)組分別與1級(jí)組相比，EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率較高，3、4級(jí)組分別與2級(jí)組相比陽性率較高，4與3級(jí)組相比陽性率較高(P<0.05)。見表1。

2.4EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率與TNM分期、Fuhrman分級(jí)相關(guān)性 腎細(xì)胞癌中EGFL7、MMP-9和VEGF陽性表達(dá)率隨著TNM分期(r=0.887、0.657、0.914)、Fuhrman分級(jí)(r=0.954、0.687、0.776)的升高而增加，且呈現(xiàn)出了明顯的正相關(guān)性(P<0.05)。且EGFL7與MMP-9、VEGF呈正相關(guān)(r=0.579、0.812，P<0.005)，MMP-9與VEGF呈正相關(guān)(r=0.745，P<0.05)。

表1 不同TNM分期及不同F(xiàn)uhrman分級(jí)EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率對(duì)比〔n(%)〕

3 討 論

報(bào)道指出，無論是原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤在正常生長(zhǎng)及擴(kuò)散過程中均會(huì)依賴血管的生長(zhǎng)及發(fā)展，且腫瘤的持續(xù)惡化及生長(zhǎng)也必須依賴新生血管的生成，方可提供重組的營(yíng)養(yǎng)及氧氣，并由此快速將產(chǎn)物運(yùn)輸，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)揮促進(jìn)作用，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)的循環(huán)提供基礎(chǔ)〔9〕。腫瘤血管生成是一個(gè)較為連續(xù)且復(fù)雜的過程，且腫瘤體內(nèi)的新生血管是由于各種血管因子誘導(dǎo)及相互作用形成，為此，對(duì)腎癌組織中的血管生長(zhǎng)因子進(jìn)行研究具有重要臨床意義〔10〕。

VEGF被認(rèn)為是最強(qiáng)的血管生長(zhǎng)因子，在內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)可特異性作用在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體上，并對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及腫瘤血管的生長(zhǎng)可產(chǎn)生較強(qiáng)的刺激作用，且?guī)椭[瘤脫落后可順利進(jìn)入血管內(nèi)，而對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移產(chǎn)生一系列推動(dòng)作用〔11〕。本研究結(jié)果說明當(dāng)VEGF的陽性表達(dá)率升高后，可通過作用在內(nèi)皮細(xì)胞的受體上而發(fā)揮較為明顯的生物學(xué)功能，并由此誘導(dǎo)并加重內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移，促進(jìn)腫瘤血管生成〔12〕。

EGFL7作為一種在近年來新發(fā)現(xiàn)的新基因，可特異性表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)上，研究指出，EGFL7的作用在于能夠?qū)ρ軆?nèi)皮遷移產(chǎn)生較為顯著的促進(jìn)作用，同時(shí)還可對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞黏附進(jìn)行有效調(diào)節(jié)，并能夠?qū)椭鷺?gòu)建血管床結(jié)構(gòu)，有效維持血管穩(wěn)定性〔13〕。另外，有研究顯示，由于腫瘤組織中具有較為豐富的血液供應(yīng)，EGFL7也會(huì)大量存在于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)〔14〕。本研究結(jié)果顯示，腎癌中若表現(xiàn)出了EGFL7高表達(dá)情況，說明此時(shí)腫瘤血管不斷形成，EGFL7也有效維持了腫瘤血管的穩(wěn)定性。

MMPs是一類鋅離子和鈣離子依賴的蛋白酶家族，該家族中有24種類型，可靶向ECM中眾多蛋白并使其降解，且各種MMP間具有一定底物特異性〔15〕。正常情況下，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基膜，和組織金屬蛋白酶抑制劑一起調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的降解，但調(diào)控機(jī)制失衡會(huì)使細(xì)胞外基質(zhì)過度降解，本身在介導(dǎo)腫瘤血管新生、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中可發(fā)揮較強(qiáng)作用〔16〕。其中MMP-9被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一類潛在生物標(biāo)志物，同時(shí)也被認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)重塑的關(guān)鍵效應(yīng)物質(zhì)。本結(jié)果提示，MMP-9的平衡被打破后，腫瘤的生長(zhǎng)及血管惡化也會(huì)相應(yīng)進(jìn)展〔17〕。另外，本研究結(jié)果顯示，EGFL7、MMP-9和VEGF陽性率三者之間也呈現(xiàn)出了明顯的兩兩正相關(guān)性，但相互之間的作用機(jī)制尚未明確，推測(cè)可能出現(xiàn)此結(jié)果的原因是由于EGFL7的高表達(dá)可加快腫瘤血管生成及腫瘤體積增大，在腫瘤體積不斷增大的期間，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求量也明顯升高，同時(shí)需要更多的新生血管為其提供充分養(yǎng)分，此時(shí)VEGF等其他促血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)量就會(huì)生長(zhǎng)，MMP-9的調(diào)控機(jī)制也會(huì)失衡，由此對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生刺激作用而導(dǎo)致其大量增生，加之內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)聚集而形成血管芽，旨在維持腫瘤血管的穩(wěn)定性〔18〕。

綜上，老年腎透明細(xì)胞癌組織中EGFL7、MMP-9和VEGF與疾病的不同分期及分級(jí)之間具有相關(guān)性，三者的高陽性表達(dá)可能協(xié)同了腫瘤新生血管的生成及疾病的惡化進(jìn)展。