劉曉梅 顧麗 李明

(1蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 蘇州 215009；2蘇州市立醫(yī)院病理科)

結(jié)直腸癌(CRC)目前已分別成為世界上女性和男性第二和第三常見的癌癥〔1～5〕。生物標(biāo)志物在CRC患者的檢測、治療和危險等級中發(fā)揮著重要作用〔6〕。其中，p53基因、鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)和鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(BRAF)的突變、磷酸酶張力蛋白基因(PTEN)和ezrin蛋白的表達(dá)、染色體18q雜合性缺失(18qLOH)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)已被證明是CRC患者的預(yù)后因素〔1，2，7～10〕。然而，這些生物標(biāo)志物數(shù)量少到不足以建立完整的風(fēng)險分層體系，仍需要更多具有預(yù)后價值的生物標(biāo)志物來評估CRC患者預(yù)后。人皮瓣內(nèi)切酶(FEN)1是一種結(jié)構(gòu)特異性的DNA核酸酶〔11〕。它在DNA復(fù)制和DNA修復(fù)途徑如堿基切除修復(fù)(BER)和聚合酶α錯誤編輯中、岡崎片段的成熟中至關(guān)重要〔12〕。增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是DNA聚合酶 δ 的輔助蛋白,參與調(diào)節(jié)DNA的合成。在人類腫瘤,FEN1過表達(dá)已被廣泛報道，并且FEN1表達(dá)對乳腺癌和肺癌有預(yù)后價值〔13，14〕。然而，F(xiàn)EN1、PCNA蛋白在老年人CRC表達(dá)狀態(tài)及預(yù)后價值尚不清楚。本研究分析FEN1、PCNA 在老年人CRC組織中定位及蛋白表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1資料 蘇州市立醫(yī)院2003年1月1日至2007年12月31日年齡60歲及以上住院患者手術(shù)切除CRC標(biāo)本68例(收集74例，其中6例染色時掉片除去)，鄰近正常組織(據(jù)腫瘤5 cm以上)11例。隨訪時間截止至2012年12月30日?；颊咝g(shù)前均未進(jìn)行放療和化療，標(biāo)本均經(jīng)兩位病理專家閱片證實。排除了合并其他惡性腫瘤；心、肝、腎等重要器官嚴(yán)重?fù)p傷及臨床資料不完整者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。年齡中位數(shù)為72.0歲。收集所有患者臨床病理參數(shù)。

1.2試劑 免疫組化一抗、二抗及免疫組化雙染檢測試劑盒均購自基因科技有限公司，F(xiàn)EN1抗體(Catalog Number:GTX70185)，PCNA抗體(AF1363)。免疫組化雙染檢測試劑盒：GTVisionTM。

1.3組織芯片的構(gòu)建 常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，石蠟組織標(biāo)本HE染色后，在顯微鏡下標(biāo)記腫瘤或正常組織。每個蠟塊取二塊組織芯點，制成10行×16列芯片蠟塊(其中每一腫瘤組織取材2芯點)，組織芯直徑為1.6 mm。

1.4免疫組化染色及結(jié)果判定 免疫組化雙染是通過二種不同種屬的二抗系統(tǒng)，二種不同種屬的抗體(一抗為FEN1、PCNA)及不同顏色的顯色系統(tǒng)〔二氨基聯(lián)苯胺(DAB)和PermaRed〕，在一張組織切片(芯片)中同時檢測二種抗原的表達(dá)情況。按照免疫組化雙染試劑說明書進(jìn)行染色操作，實驗同時有公司提供的陰性、陽性對照。FEN1抗體稀釋度為1∶100；PCNA抗體為工作液，F(xiàn)EN1抗體染色陽性者主要在細(xì)胞質(zhì)，少量在細(xì)胞核，棕黃色為陽性信號。PCNA抗體染色陽性者在細(xì)胞核，為紅色。結(jié)果判定：200×顯微鏡下有棕黃或紅色即為陽性，無為陰性。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗和采用Spearman等級相關(guān)分析。FEN1/PCNA蛋白表達(dá)K-M分析患者預(yù)后。

2 結(jié) 果

2.1FEN1/PCNA蛋白雙表達(dá) CRC組織FEN1/PCNA蛋白雙表達(dá)：FEN1蛋白表達(dá)主要定位在細(xì)胞質(zhì)，棕色；PCNA蛋白表達(dá)在細(xì)胞核，紅色。如圖1示：腫瘤腺體的FEN1/PCNA雙表達(dá)于高分化腺癌和低分化腺癌中；而黏液性腺癌陰性表達(dá)及正常結(jié)直腸組織不表達(dá)與腺癌雙表達(dá)。

圖1 CRC組織中FEN1/PCNA蛋白雙表達(dá)(DAB)

2.2FEN1蛋白的表達(dá) CRC組織中FEN1蛋白陽性表達(dá)率〔77.9%(53/68)〕顯著高于正常組織〔8.2%(2/11)，χ2=11.000、P=0.018〕；FEN1蛋白可見于CRC組織中單獨表達(dá)(圖2)，而正常結(jié)直腸黏膜組織普遍呈低表達(dá)，僅有1例局部略微表達(dá)。

2.3PCNA蛋白的表達(dá) CRC組織中陽性PCNA蛋白陽性表達(dá)率為〔30.9%(21/68)〕，正常組織中未見表達(dá)。PCNA蛋白陽性表達(dá)均伴有FEN1蛋白陽性表達(dá)(圖1)。

2.4CRC組織中FEN1與PCNA蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 FEN1、PCNA陽性表達(dá)與年齡、性別、腫瘤直徑、病理大體分型、腫瘤TNM分期、手術(shù)方式、分化程度、浸潤深度等均無關(guān)，而與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤組織學(xué)分級(僅FEN1)相關(guān)(P<0.05)，見表1。

2.5CRC組織中FEN1和PCNA蛋白表達(dá)的相關(guān)性 53例FEN1陽性CRC中PCNA陽性21例，15例PEN1陽性者PCNA亦不表達(dá)。FEN1和PCNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.356，P=0.003)。

2.6CRC組織中FEN1和PCNA蛋白表達(dá)的Kap-lan-Meier分析 隨訪時間6～96個月，F(xiàn)EN1/PCNA蛋白雙表達(dá)與患者生存時間無關(guān)(χ2=1.372，P=0.241)，見圖3。

表1 FEN1、PCNA蛋白陽性表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n)

圖3 FEN1和PCNA蛋白表達(dá)的Kaplan-Meier生存函數(shù)

3 討 論

FEN1是一種結(jié)構(gòu)特異性的多功能核酸酶具有缺口內(nèi)切核酸酶(GEN)的活性。GEN活性在凋亡 DNA 片段化中起著至關(guān)重要的作用，而FEN1/PCNA 復(fù)合物的相互作用可抑制GEN活性并促進(jìn) FEN 活性。當(dāng)細(xì)胞遭受內(nèi)源性或外源性 DNA 損傷如紫外線照射時，F(xiàn)EN1會被磷酸化使其從PCNA上解離，推測PCNA是影響DNA復(fù)制速率和準(zhǔn)確性的信號樞紐并調(diào)控DNA損傷修復(fù)〔15〕。PCNA與200多種蛋白質(zhì)相互作用，作為DNA復(fù)制和修復(fù)過程的基本介質(zhì)〔16，17〕。因此，它已被確定為治療由DNA異常復(fù)制定義的疾病的關(guān)鍵治療靶點，包括人類多種癌癥。本實驗結(jié)果顯示：FEN1/PCNA呈結(jié)合狀態(tài)在同一癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)均陽性與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，理論上是否可以推測FEN1/PCNA復(fù)合物抑制了GEN活性而影響了對DNA損傷修復(fù)的調(diào)控作用。本文提示PCNA和FEN1均在增殖活躍的細(xì)胞中表達(dá)較高。本實驗Lu等〔13〕及He等〔14〕研究證實的FEN1表達(dá)水平在乳腺癌和肺癌組織中高表達(dá)具有預(yù)后價值相同。 而這些結(jié)果與 FEN1 作為抑癌因子〔18〕的結(jié)果相反：癌癥的生長和發(fā)展依然需要FEN1。比較好的解釋是因為FEN1在DNA復(fù)制中起重要作用，所以需要高水平的FEN1來支持癌細(xì)胞的過度增殖。與癌組織中FEN1的過表達(dá)一致，與匹配的正常組織相比，蛋白質(zhì)水平上的 FEN1表達(dá)增加。FEN1可以兩種非常不同的方式促進(jìn)癌癥：①基因突變可導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，并引發(fā)惡性轉(zhuǎn)化；②基因的過表達(dá)賦予腫瘤生長優(yōu)勢，為了響應(yīng)后一種促進(jìn)癌癥的方法，已建議將 FEN1作為癌癥的生物標(biāo)志物及治療靶標(biāo)〔19～22〕。但是，像其他目前的生物標(biāo)志物或化學(xué)療法一樣，F(xiàn)EN1抑制劑可能充滿不確定性或副作用，并且有可能傳播甚至引發(fā)新的癌癥。應(yīng)繼續(xù)增加生物標(biāo)志物或新藥，并最終希望有新的具有診斷、預(yù)后及藥物遞送機(jī)制。