王子杰，操義恒，馬 雪，張麗媛，王 燕，周 霞*，黃 新，吳桐忠，張星星，鐘發(fā)剛

(1.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000)

綿羊的呼吸系統(tǒng)疾病是引起羔羊死亡的一類重要疫病，對幼齡羊的危害尤其嚴重，給世界養(yǎng)羊業(yè)帶來了較大經(jīng)濟損失[1-2]。該病除了與環(huán)境、飼養(yǎng)管理水平以及免疫力低有關(guān)外，細菌性的病原也是另一個主要原因，其中多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)和溶血性曼氏桿菌(Mannheimiahaemolyticus,Mh)則是引起綿羊呼吸系統(tǒng)感染的常見病原。根據(jù)莢膜多糖抗原的不同，Pm可以分為A、B、D、E、F共5個血清型，Mh可以分為1,2,5,6,7,8,9,12,13,14,16,17型，不同血清型致不同動物發(fā)病[3]。兩者致病過程多依賴各種毒力因子，主要毒力因子包括莢膜、脂多糖、黏附因子、鐵調(diào)節(jié)和鐵獲取蛋白等。除此之外，由于濫用抗生素，使多重耐藥現(xiàn)象越來越嚴重，導致預防和治療的困難，因此通過抗生素耐藥性監(jiān)測獲得的信息可用于指導抗生素的臨床使用。2021年7月新疆石河子地區(qū)某羊場部分羊只發(fā)生了表現(xiàn)為消瘦、呼吸困難、咳嗽,體溫 41℃左右,鼻腔有黏性分泌物的疾病，為了確定此次疫病的細菌性病原，本試驗采用細菌常規(guī)分離鑒定及PCR鑒定方法，從病變肺臟組織中分離鑒定細菌并對分離菌株的部分生物學特性進行研究，以期闡明引起疫病的流行病學特征，為有針對性防控該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源及實驗動物病料來源于新疆石河子某羊場有呼吸道癥狀的4月齡病羊；1月齡昆明系小鼠購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑和儀器2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker Ⅰ 購自TaKaRa公司；腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基購自北京睿博興科生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；全自動細菌生化鑒定儀(VITEK 2 COMPACT)；PCR儀(Biometra)；凝膠成像儀Gel Doc XR+；電泳儀POWER PAC300。

1.3 臨床檢查對病羊進行臨床檢查并剖檢。

1.4 細菌的分離及鑒定將無菌采集的病料樣品分別接種于5%牛血清BHI平板，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，取單菌落接種到綿羊血瓊脂平板上純化，革蘭染色鏡檢觀察菌落的形態(tài)。將分離到的純培養(yǎng)物使用VITEK 2 COMPACT生化鑒定儀進行生化鑒定。使用基因提取試劑盒提取培養(yǎng)物的基因組，以DNA作為PCR模板，參照文獻中Pm的特異性基因[4](Kmt)和Mh的特異性基因[5](Lkt)進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳。引物信息見表1。

表1 Pm和Mh鑒定所用引物

1.5 分離菌株的莢膜血清分型以上述提取的DNA為模板，參照文獻中Pm的5個莢膜血清型基因[6](hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、febD)，Mh的3個分型基因[4](Hyp、Core2、TupA)進行PCR擴增。引物信息見表2。

表2 Pm和Mh莢膜血清分型所用引物

1.6 分離菌株毒力基因的檢測參照文獻對分離菌株7類25個毒力相關(guān)基因[7-11]，包括鐵離子攝取基因(exbB、exbD、hgbA、hgbB、tonB、fur)；黏附素相關(guān)基因(fimA、hsf1、hsf2、ptfA、pfhA、tadD)；外膜蛋白相關(guān)基因(oma87、ompA、ompH、plpB、psl、plpE)；超氧化物歧化酶(SOD)相關(guān)基因(sodA、sodC、tbpA)；唾液酸激酶相關(guān)基因(nanB、nanH)；透明質(zhì)酸酶相關(guān)基因(pmHAS)；毒素相關(guān)基因(toxA)進行PCR擴增。引物信息見表3。

表3 毒力基因引物信息

1.7 分離菌株藥物敏感性試驗采用K-B紙片法測定分離菌株對9類21種抗生素的敏感性?？股匕é?內(nèi)酰胺類(青霉素、阿莫西林)、頭孢菌素類(頭孢唑啉、頭孢他定、頭孢拉定、頭孢哌酮)、氨基糖苷類(鏈霉素、慶大霉素、丁胺卡那)、大環(huán)內(nèi)酯類(阿奇霉素、麥迪霉素、乙酰螺旋霉素)、多肽類(多黏菌素 B)、四環(huán)素類(多西環(huán)素)、喹諾酮類(恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星)、磺胺類(復方新諾明)、氯霉素類(氟苯尼考)、林可酰胺類(克林霉素)。

1.8 分離菌株耐藥基因的檢測參照文獻[12]對分離菌株8大類21種耐藥基因，包括氨基糖苷類(aadA25、aadB)、氯霉素(floR)、鏈霉素(strA、strB)、氟喹諾酮類(qnrA、qnrB、qnrS)、β-內(nèi)酰胺類(blaTEM、blaOXA、blaSHV、blaCTX-M-2、ermA)、磺胺類藥物(sul1、sul2、sul3)、四環(huán)素類(tetA、tetB、tetH、tetG)、多肽類(mcr-1)基因進行PCR擴增。引物信息見表4。

1.9 小鼠致病性試驗將15只小鼠隨機分為試驗組和對照組，每組5只。將分離株P(guān)m和Mh于BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)14 h至D450=0.45，按0.2 mL/只劑量腹腔注射菌液，對照組腹腔注射等量滅菌PBS。觀察并記錄小鼠狀態(tài)和死亡情況，剖檢死亡小鼠并從肺臟、肝臟、脾臟等臟器分離細菌并進鑒定。

2 結(jié)果

2.1 臨床檢查與剖檢臨床檢查發(fā)現(xiàn)羊出現(xiàn)體溫升高至41～42℃、精神沉郁、咳嗽且呼吸困難等臨床癥狀。剖解可見胸腔內(nèi)肺充血，肺臟部分肉變，并伴有病死灶(圖1)；肝臟淤血，表面散在有白色壞死灶；脾臟腫大且邊緣不齊，伴有針尖狀出血點；淋巴結(jié)腫大。

2.2 細菌的分離與鑒定經(jīng)分離細菌后，發(fā)現(xiàn)1株菌在5%綿羊鮮血BHI平板生長良好，呈現(xiàn)清亮、光滑濕潤黏稠、圓形微隆起、灰白色露珠樣菌落，無溶血現(xiàn)象，革蘭染色為陰性小球桿狀或短桿狀細菌，細菌生化儀鑒定為Pm的可信度為97%，PCR擴增出約460 bp的目的條帶，確定為Pm(Pm-169)；另1株分離菌在5%綿羊鮮血BHI平板生長形成灰白色半透明中等大小菌落，β溶血，為革蘭陰性菌，有莢膜、單個或散在排列，兩級濃染，鑒定為Mh可信度為96%，PCR擴增出約200 bp的目的條帶，確定為溶血性曼氏桿菌(Mh-47)。

2.3 分離菌株的血清分型采取多重PCR方法檢測出1條約660 bp的目的條帶，因此所分離Pm為莢膜多糖D型(圖2)；另1株擴增出1條約80 bp的條帶，為溶血性曼氏桿菌A6型(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker;1.分離菌株;2.陰性對照

M.DL600 DNA Marker;1.陰性對照;2.分離菌株

2.4 分離菌株毒力相關(guān)基因PCR擴增以提取的分離菌株P(guān)m-169、Mh-47的DNA為模板，對7類25個毒力相關(guān)基因進行PCR檢測，結(jié)果顯示，Pm攜帶5類12種不同的毒力基因，即鐵離子攝取相關(guān)基因：exbB、exbD、tonB、hgbA、fur；外膜蛋白相關(guān)基因：oma87、Psl；SOD相關(guān)基因：sodA、sodC、tbpA；黏附素相關(guān)基因：fimA；毒素相關(guān)基因：toxA。Mh攜帶1種的毒力基因，即SOD相關(guān)基因：sodA。

2.5 分離菌株藥物敏感性與耐藥相關(guān)基因PCR擴增藥敏試驗結(jié)果顯示，2株分離菌均對青霉素呈現(xiàn)耐藥，對頭孢唑林藥物中介；對氟苯尼考、阿莫西林等19種抗生素敏感。耐藥相關(guān)基因PCR擴增結(jié)果顯示，未擴增出特異性條帶。

2.6 小鼠致病試驗試驗組小鼠感染后陸續(xù)出現(xiàn)精神沉郁、呼吸急促、靜臥不動等癥狀。對照組小鼠無變化未死亡。2組小鼠均在16 h內(nèi)全部死亡。對死亡小鼠剖解，可見肺臟充血腫大、部分肺臟出血肉變；脾臟、肝臟均有不同程度腫大出血，且從發(fā)病死亡小鼠的肺臟、脾臟等臟器分離得到的細菌與羊肺組織中分離的細菌形態(tài)一致，PCR鑒定確定為Pm和Mh。

3 討論

養(yǎng)羊業(yè)是新疆畜牧業(yè)中的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)，近年來，新疆大力發(fā)展多胎母羊，雖提高了母畜產(chǎn)羔的數(shù)量，但幼畜的呼吸道類疾病導致多產(chǎn)卻不能多活，嚴重制約了新疆地區(qū)養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。本次病例確定是由Pm和Mh混合感染導致，需引起廣大獸醫(yī)及防疫工作者的高度重視。

Pm的血清型與宿主疾病有一定的相關(guān)性，WATT 等[13]認為，D型的Pm會導致牛羊的地方性肺炎和敗血癥，具有較強的毒力，此次分離到的Pm經(jīng)PCR鑒定也為D型，而王蕾等[8]和馬雪等[14]在石河子地區(qū)檢測牛源的Pm也是D型，表明D型的Pm在本地區(qū)的多個養(yǎng)殖場長期存在，且可能在不同宿主間相互傳播；在12個Mh已確定的莢膜血清型中，1型、2型和6型是全世界最普遍的[15]。郜敏等[16]報道在Mh的血清型中，1型主要為引起牛呼吸道綜合征的血清型，其次是6型；而在羊源的Mh 1型和2型更為常見。有研究表明，2型Mh在江蘇和云南地區(qū)為綿羊的優(yōu)勢血清型[17-18]，而本研究分離到的Mh為6型尚未見報道，該結(jié)果對后期預防Mh的感染和疫苗制備均有重要意義。

細菌的毒力與毒力基因的存在有著密切關(guān)系，因此分離菌株毒力因子的檢測對深入研究菌株的致病機制、亞單位疫苗研制和分子分型具有重要意義。本試驗分離的Pm攜帶5類12種不同的毒力基因，即exbB、exbD、tonB、Oma87、Psl、tbpA、toxA、sodA、sodC、fimA、fur、hgbA。其中exbB、exbD、tonB、hgbA、fur屬于鐵離子獲取相關(guān)基因，它們表達的鐵獲取蛋白是所有生命形式的重要因素，在細菌與環(huán)境之間的相互作用中起著至關(guān)重要的作用，并與膜屏障功能、細菌毒力和宿主免疫力密切相關(guān)[19]。KATSUDA等[20]檢測378株P(guān)m多數(shù)分離株中存在nanB和oma87，JAMALI等[21]也發(fā)現(xiàn)oma87和nanB基因均存在于所有分離株中，而本試驗僅檢測到了oma87，未檢測到nanB，推測Pm毒力基因分布具有多樣性，2種毒力基因的關(guān)聯(lián)性并不絕對。toxA屬于毒素相關(guān)基因，DEVI等[22]認為毒素相關(guān)基因toxA是確定Pm的致病潛力的重要標記基因。EWERS等[11]在德國的小反芻動物中分離的Pm僅12.5%攜帶toxA，認為toxA僅在A型或D型的產(chǎn)毒素 Pm中被檢測到；安琪[23]認為由于sodA、sodC、tbpA屬于SOD相關(guān)基因，細菌利用此可減少自身損傷從而在病羊體內(nèi)存活甚至繁殖。因此本研究分離的Pm均檢測到toxA、sodA、sodC。此外在Mh中僅檢測了一種毒力基因，即sodA，但卻表現(xiàn)出明顯的致病性，其機制還需進一步研究。

分離株的藥敏試驗和耐藥相關(guān)基因PCR檢測結(jié)果表明，2株菌株僅對青霉素耐藥，可能與新疆地區(qū)養(yǎng)羊多為放牧且羊場的用藥較為單一有關(guān)。耐藥基因的檢測結(jié)果與耐藥表型并不一致，推測可能由于細菌對某種抗生素的耐藥是由多種機制共同作用的結(jié)果[14]。