卡楚拉，白偉琴，李 琦，烏仁達來，塔 娜，伊拉格其，格日勒圖*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 獸醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.錫林郭勒職業(yè)學院，內(nèi)蒙古 錫林浩特 026000)

馬腺疫(strangles)是一種馬屬動物感染馬鏈球菌(Streptococcusequi，S.equi)而引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病。我國《一、二、三類動物疫病病種名錄》(中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告 第1125號)將該病確定為三類動物疫病[1]。S.equi主要感染幼駒，2月齡至4歲以下馬匹易感?；疾●R發(fā)病后，由于下頜部淋巴結(jié)腫大而引起腫脹，隨著膿腫的不斷增大，膿汁會經(jīng)鼻咽部，以黏膿性鼻液的形式排出體外，繼發(fā)的炎癥反應(yīng)導致患畜體溫升高。馬腺疫發(fā)病率高，病死率低，傳染性強，分布廣泛，嚴重影響馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。國外研究統(tǒng)計，在2008年，英國出現(xiàn)近700例馬腺疫疫情，最嚴重的一次引起了超過200匹馬感染[2]。由于該病會引起下頜淋巴結(jié)腫脹而擠壓器官，患病馬會出現(xiàn)呼吸困難而盡力低頭伸脖頸,出現(xiàn)機械性窒息，根據(jù)這一典型癥狀，才有了馬腺疫這一名稱[3]。

S.equi屬于蘭氏分群的C群β溶血鏈球菌，包括馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubspecies.Zooepdemicus,SEZ)、馬鏈球菌馬亞種(Streptococcusequisubspecies.Equi,SEE)、馬鏈球菌類馬亞種(Streptococcusequisubspecies.Ruminatorum,SER)等3個亞種，絕大多數(shù)馬腺疫病例的分離菌均為SEE[4]。SEE在血平板上呈典型的β溶血生長，其形態(tài)與染色特征是由數(shù)十個細菌個體組成的菌鏈，細菌呈卵圓狀，各菌大小不一，直徑為0.7～1.5 μm，菌體著色不均，革蘭陽性菌。研究報道稱SEE來源于SEZ，兩者DNA同源性很高，而區(qū)別兩者的重要指標之一是SEE不發(fā)酵山梨醇，SEZ則發(fā)酵山梨醇和乳糖[5]。SEE可以在水中存活4～6周，但不能在糞便或土壤中存活。從患馬的體內(nèi)排出到柵欄和土壤上后，經(jīng)過1～3 d后細菌會迅速死亡。SEE對來自外環(huán)境細菌的細菌素很敏感，在土壤中存在的菌群會抑制SEE的存活率[6]。

內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟一直是馬腺疫常發(fā)地區(qū)，近來，錫林浩特市周邊個別馬場的部分馬群中6～12月齡幼駒均出現(xiàn)以發(fā)熱、上呼吸道及咽喉黏膜呈現(xiàn)卡他性炎癥、下頜部淋巴結(jié)表現(xiàn)急性化膿性炎癥為主要癥狀的病例。本試驗在送檢的18份臨床樣本中，均能分離出疑似菌，通過實驗室常規(guī)診斷與分子生物學方法分離與鑒定分離菌的主要分類和遺傳進化關(guān)系，成功分離出1株SEE，并分析與篩選出敏感性抗生素類藥物，為當?shù)伛R場及時診斷該疫病以及選擇正確的抗生素類藥物提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料及基本信息18份病料來自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟某馬場?；疾●R出現(xiàn)精神萎靡、低頭伸脖頸、單側(cè)鼻孔流出黃綠色鼻涕、下頜部淋巴結(jié)腫脹等典型癥狀。對病馬的下頜部淋巴結(jié)及周圍進行消毒處理，使用無菌注射器抽取淋巴結(jié)內(nèi)的膿汁，收集至無菌15 mL離心管后，送往實驗室進行疑似菌的分離與鑒定。

1.2 主要試劑綿羊血瓊脂平板購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；革蘭染色液購自北京索萊寶科技有限公司；THB培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；核酸染料購自百泰克生物技術(shù)有限公司；Premix Taq酶、DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；Steadypure 細菌基因組DNA提取試劑盒購自艾科瑞生物工程有限公司。

1.3 疑似菌的形態(tài)特征觀察使用鉑金耳沾取微量膿汁均勻涂抹于無菌載玻片上，進行革蘭染色并鏡檢觀察疑似菌是否呈現(xiàn)出SEE的形態(tài)及染色特征。

1.4 疑似菌的分離與純化使用鉑金耳沾取膿汁，劃線接種于綿羊血瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置過夜,觀察菌落是否出現(xiàn)β溶血環(huán)及其他特征；挑取大小均一的單菌落進行革蘭染色鏡檢。將疑似菌轉(zhuǎn)接種至綿羊血平板進行純培養(yǎng)，直至血平板上長出大小、形態(tài)均一致的露珠狀菌落。挑取單個菌落，接種于THB培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，染色鏡檢，如顯微鏡下呈現(xiàn)形態(tài)特征相同的細菌，即獲得純化的菌懸液。

1.5 分離菌生長曲線的繪制取100 mL THB培養(yǎng)基至滅菌廣口三角瓶，按照1∶100的體積分數(shù)接種菌懸液，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，分別選取 0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32 h 時間點取樣并測定培養(yǎng)液的D600 nm，以未接種的THB培養(yǎng)基作空白對照。以培養(yǎng)時間為橫坐標，D600 nm為縱坐標繪制細菌生長曲線，共進行 3 次重復試驗，并進行方差分析。

1.6 分離菌的生化鑒定參照馬腺疫診斷技術(shù)(中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T571-2018)，對分離菌對數(shù)期菌懸液進行生化試驗。依據(jù)《獸醫(yī)微生物學實驗教程》[7]中的常規(guī)方法，對分離菌進行蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、蕈糖、七葉苷、山梨醇、精氨酸脫羧酶分解試驗、硝酸鹽(還原)試驗、膽汁溶菌試驗、馬尿酸鹽分解試驗、VP試驗等進行鑒定。

1.7 分離菌16S rRNA測序鑒定取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌懸液至1.5 mL 無菌離心管，參照Steadypure 細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取分離菌株基因組DNA，采用細菌通用引物27F/1492R用于分離菌的核酸鑒定(正向引物：5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物：5′-AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3′)。以分離菌基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 40 s，56℃ 40 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)；72℃延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束。PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收約在1 500 bp處的PCR產(chǎn)物，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.8 分離菌遺傳進化樹的繪制測序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的BLAST系統(tǒng)進行檢索，對分離菌的DNA 序列與同屬的不同細菌在GenBank中錄入的相關(guān)序列做比對，選取同源性高于99%的細菌為參考序列，應(yīng)用MEGA 7.0生物軟件繪制分離菌的遺傳進化樹，分析其遺傳進化關(guān)系。

1.9 分離菌的藥物敏感性試驗依據(jù)NCCLS-藥敏試驗標準，采用K-B紙片瓊脂擴散法，分析分離菌對阿莫西林、苯唑西林、頭孢曲松、多西環(huán)素、紅霉素、利福平、克林霉素、替考拉寧等藥物的敏感性，測量抑菌圈，確定分離菌的藥物敏感性情況。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的形態(tài)特征將膿汁直接進行涂片并革蘭染色后，在光學顯微鏡下清晰可見呈鏈狀排列的革蘭陽性菌和膿細胞，顯示具有致病性鏈球菌的長鏈狀排列特征(圖1A)。

A.膿汁革蘭染色鏡檢結(jié)果；B.革蘭染色鏡檢結(jié)果；C.血瓊脂溶血結(jié)果

2.2 疑似菌的分離與純化在血平板上長出大小形態(tài)一致的露珠狀小菌落，并出現(xiàn)了典型的β溶血環(huán)(圖1 C)。挑取單菌落革蘭染色后，鏡檢觀察到由數(shù)十個細菌個體組成短的菌鏈，單個細菌呈卵圓狀，呈陽性。與典型的SEE完全符合(圖1B)。

2.3 分離菌生長曲線的繪制從繪制的生長曲線可知，分離菌在培養(yǎng)2～4 h后進入對數(shù)增長期，持續(xù)至16 h左右，16～20 h內(nèi)進入平臺期，而后進入衰亡期。經(jīng)方差分析在3次重復試驗的數(shù)據(jù)顯示良好的重復性(圖2)。

圖2 分離菌生長曲線

2.4 分離菌的生化試驗分離菌對蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖等糖發(fā)酵試驗顯示陽性，對乳糖、甘露醇、蕈糖、七葉苷、山梨醇等試驗顯示陰性(表1)；對精氨酸脫羧酶分解試驗顯示陽性，對硝酸鹽(還原)試驗、膽汁溶菌試驗、馬尿酸鹽分解試驗、VP試驗顯示陰性(表2)。

表1 糖發(fā)酵試驗鑒定結(jié)果

表2 生化試驗結(jié)果

2.5 分離菌16S rRNA測序結(jié)果將分離菌株在約1 500 bp處出現(xiàn)的特異性PCR產(chǎn)物經(jīng)過測序后，所得到的16S rRNA基因序列與GenBank登錄的序列進行BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)，分離菌與已注冊的馬鏈球菌馬亞種序列同源性為100%(圖3)。

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2.分離菌基因組DNA樣品

2.6 分離菌遺傳進化樹的繪制應(yīng)用MEGA 7.0軟件繪制的遺傳進化樹上可以看出分離菌與新疆分離株XJALT-10-M2遺傳距離最近，位于相同的分支(圖4)。將該分離菌重新命名為馬鏈球菌馬亞種MDMC0316株，并成功注冊于GenBank(登錄號：OK254140.1)。

圖4 基于16S rRNA基因序列的遺傳進化樹

2.7 分離菌的藥物敏感性試驗藥敏試驗結(jié)果顯示，根據(jù)NCCLS-藥敏試驗標準，可以判定MDMC0316菌株對多西環(huán)素、紅霉素敏感，對阿莫西林、苯唑西林、頭孢曲松表示中介，對利福平、克林霉素、替考拉寧產(chǎn)生耐藥性(表3)。

表3 藥敏試驗結(jié)果 mm

3 討論

WALLER[2]研究認為，感染S.equi后處在潛伏期的馬傳播馬腺疫的概率遠遠高于患病馬通過化膿性分泌物傳播的概率[8]。一些攜帶病原菌的馬雖然常不表現(xiàn)任何馬腺疫的典型癥狀，但是均處于潛伏期[9]。而此時，傳統(tǒng)的馬腺疫診斷方法無法及時做出正確的臨床診斷，不能采取有效的預防措施，導致該疫病的暴發(fā)而造成馬產(chǎn)業(yè)巨大的經(jīng)濟損失[10]。

本試驗成功分離出1株SEE。通過觀察MDMC0316株的染色及培養(yǎng)特性，在綿羊血瓊脂平板上8 h內(nèi)產(chǎn)生β溶血，并在膿汁里長鏈狀排列，呈現(xiàn)出典型致病性鏈球菌的特性[11]。由于S.equi的3個亞種都有各自獨特的酶系統(tǒng)，對底物的分解能力不同、產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物也不同，所以在生化試驗中絕大多數(shù)SEE不發(fā)酵山梨醇與乳糖，此特性正是區(qū)分S.equi的3個亞種的重要方法之一[12]。MDMC0316株對上述2種糖均表現(xiàn)為陰性，不利用該糖類。

根據(jù)16S rRNA測序結(jié)果繪制出的MDMC0316株遺傳進化樹，分析其遺傳進化關(guān)系：分離菌與NCBI中已注冊的馬鏈球菌馬亞種新疆分離株XJALT-10-M2遺傳距離最近，表示該病原體具有極大概率來源于新疆維吾爾自治區(qū)?？赡芴崾拘陆c內(nèi)蒙古馬產(chǎn)業(yè)交易過程中，不嚴格檢疫該類病原體，造成輸入當?shù)伛R群導致局部發(fā)病流行。

本次藥物敏感試驗只是作為緊急臨床用藥需求提供參考，在已備選的若干種抗生素當中，只有多西環(huán)素與紅霉素2種抗生素類藥物對MDMC0316株表現(xiàn)為最敏感。根據(jù)馬場用藥物敏感試驗推薦藥物治療馬腺疫的反饋情況看，上述2類參照抗生素治療效果一般，患病馬流膿癥狀改善不明顯，但是大大縮短了康復期。試驗本身也缺乏陽性和陰性標準對照，所得藥物敏感性試驗數(shù)據(jù)具有局限性。此外，臨床實踐結(jié)果表明，馬腺疫混合感染情況也比較嚴重[13]，本試驗分離細菌時也發(fā)現(xiàn)有些樣品中伴有其他菌種的情況，是原發(fā)病混合感染還是采樣時環(huán)境污染造成的問題需要進一步研究證實。

隨著我國馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，馬屬動物的流通量逐年增加，因而馬腺疫的傳播率也在不斷提高。在馬腺疫的臨床治療中，廣泛使用抗生素的療效不佳，不僅僅是產(chǎn)生耐藥性的問題，在惡性馬腺疫病例用抗生素治療后容易發(fā)生膿腫無法破潰而導致患病馬匹體溫長期呈稽留熱狀態(tài)，易發(fā)生其他并發(fā)癥，甚至引起死亡[14]。美國和新西蘭使用一種鼻腔黏膜免疫疫苗，但是該疫苗有極大的致病率，仍會造成受免疫馬匹的感染，因而未得到廣泛使用[15]。歐盟推出一款馬腺疫的弱毒疫苗——Equilis StrepE(Intervet)[16]，雖然該疫苗在3個月內(nèi)對受接種馬匹能提供有效免疫保護，但個別馬匹出現(xiàn)接種部位膿腫等不良反應(yīng)?？傊?，在馬腺疫疫苗防控中仍存在短期內(nèi)無法克服的瓶頸問題。