仇相書，陳川威，王 琛，侯金利，史 寧，朱翔宇，魯會軍，金寧一*

(1.西北農林科技大學 動物醫(yī)學學院，陜西 楊凌 712100；2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122；3.海南省五指山市動物疫病預防控制中心，海南 五指山 572200；4.巴州動物疾病控制與診斷中心，新疆 庫爾勒 841000；5.山東省招遠市辛莊畜牧獸醫(yī)站，山東 招遠 265400；6.吉林農業(yè)大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130122)

蓋塔病毒(Getah virus，GETV)是披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒屬(Alphavirus)成員，能引起多種動物非特異性發(fā)熱，無菌性腦膜炎和流產。自1955年首次從馬來西亞雪背庫蚊(Culexgelidus)中分離到GETV-MM2021以來[1]，在中國、日本、韓國、蒙古、俄羅斯、澳大利亞和印度等眾多國家和地區(qū)陸續(xù)報道臨床病例或分離、檢測到該病毒，截至目前已報道共231株GETV的部分基因或全基因組序列[2]。蓋塔病由GETV引起，主要經蚊蟲等節(jié)肢動物傳播。蚊子在我國數量大、種類多、分布廣，容易加劇GETV的傳播。作為一種“新發(fā)蚊媒傳染病”，蓋塔病在我國流行問題日益突出，對動物安全和公共衛(wèi)生構成了嚴重威脅。據報道在2006年之前，僅在我國6個省發(fā)現了GETV[3]，但到2018年，受GETV影響的省份數量急劇增加到15個[4]。研究人員陸續(xù)在人及豬、馬、牛、袋鼠、狐貍、鳥類等多種動物血清中均檢測到GETV抗體[5-7]，其中，豬和馬被認為是GETV增殖和傳播的重要宿主，感染后可表現出相對明顯的臨床癥狀。病豬可出現發(fā)熱、腹瀉、震顫，嚴重時導致母豬生殖障礙和胎兒死亡[8]；病馬的臨床癥狀包括體溫升高、蕁麻樣皮疹和后肢水腫等[9]。

GETV血清流行病學研究顯示，印度馬匹GETV抗體陽性率為17%(10%～28%)[10]，韓國為39%[11]，中國香港為24%[12]。在日本，GETV流行后，馬感染率從7.5%劇增至93%，野豬感染率為47.8%[13]。GETV在馬群中的流行及危害日益嚴重，關于我國馬群感染GETV的研究鮮有報道。1979年LI等[14]從海南省采集的馬血清樣本中檢出GETV抗體，其陽性率為25%(4/16)；2017年李元元[15]對云南省采集的256份馬血清進行GETV中和抗體檢測，陽性率為47.7%；2018年LU等[16]從廣東省某賽馬場的1匹發(fā)熱馬血液中鑒定出GETV毒株，且該毒株與2017年我國分離的豬源GETV株基因同源性最高。

目前，我國尚無正式生產應用的GETV診斷試劑盒及其相關疫苗，這對了解蓋塔病的傳播和流行規(guī)律造成很大困難。GETV感染會使感染動物體內產生抗GETV中和抗體，通過血清中和試驗檢測血清中和抗體的方法，可以了解動物群體自然感染情況。本研究對新疆部分地區(qū)馬匹開展GETV血清流行病學調查，以期獲知這些地區(qū)馬群中蓋塔病的流行特征和流行規(guī)律，對加強蓋塔病的防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品馬血清采自新疆維吾爾自治區(qū)4個地區(qū)，包括克拉瑪依市、阿克蘇地區(qū)、昌吉回族自治州和伊犁哈薩克自治州；2個品種：純血馬與伊利馬；3個年齡段：小于1歲齡(<1歲齡)、1～3歲齡、大于3歲齡(>3歲齡)；2種飼養(yǎng)方式：散養(yǎng)場與規(guī)模場。采血方式為頸靜脈采血，每匹10 mL，共采集294份馬血清。

1.2 細胞、病毒、細胞培養(yǎng)基非洲綠猴腎細胞(Vero)、GETV毒株SD17/09(GenBank登錄號：MH106780.1)由本實驗室保存。細胞維持液(含2%新生胎牛血清的DMEM)、無血清DMEM購自北京索萊寶科技有限公司。

因此，思想政治教育方法必須要跟隨著事物發(fā)展的變化趨勢，使之順應歷史的發(fā)展潮流，順應時代的變遷，才能取得滿意的效果。

1.3 樣品采集與處理將采集的血樣靜置，析出血清后，6 000 r/min離心10 min，收集上層血清。將血清置于56℃水浴中滅活30 min，作為待檢樣品。

GPS控制測繪技術與其他測繪手段相比創(chuàng)新性較強，通過靈活精準的三維控制網即可發(fā)揮出GPS的優(yōu)勢，而這種網絡又具有一個特點就是可以減少周圍干擾物體對數據準確性的影響，避免誤差的產生。這種測繪技術不僅能使用水準儀、經緯儀和測距儀獲取被測高程、角度和距離，還能在定位系統的支持下在任何位置建立坐標，彌補了以往測繪技術的不足之處，滿足了現代化測繪需求，是被測點的數據更為精準可靠。

截至目前，蓋塔病在全世界范圍內先后6次在馬群中暴發(fā)，造成了巨大的經濟損失。其中，5次發(fā)生在日本(1978年、1979年、1983年、2014年、2015年)，1次在印度(1990年)。BANNAI等[19]持續(xù)監(jiān)測來源于日本北部茨城縣與南部千葉市的豬、馬GETV中和抗體情況，結果表明，茨城縣豬中和抗體陽性率從2012年的0%增加至2015年的65.0%；在千葉市，陽性率在2015年上升至48.0%。值得注意的是，2014-2015年蓋塔病在這些地區(qū)賽馬中暴發(fā)。系統發(fā)育分析表明，在此期間，從豬和馬中分離到的GETV毒株之間有著密切的親緣關系，表明GETV可以在特定地區(qū)豬和馬之間同時傳播。新疆是我國陸地面積最大的省級行政區(qū)和畜牧業(yè)大省之一。然而，關于GETV在國內家畜特別是在新疆地區(qū)馬群中的流行，目前尚未見報道。

為了比較新疆不同地區(qū)、不同品種、不同年齡、不同飼養(yǎng)方式馬GETV中和抗體效價的差異，本研究統計了不同效價的陽性血清數占對應總陽性血清數的百分比，中和抗體滴度范圍包括低效價組(1∶10～1∶20)、中效價組(1∶40～1∶320)、高效價組(1∶640～1∶1 280)。

1.5 統計分析使用Excel 2007、SPSS 13.0進行數據錄入分析。計數資料用率來描述，率的比較采用χ2檢驗；計量資料用幾何均數進行描述，幾何均數的比較采用F檢驗(將陽性血清抗體滴度數值取倒數，進行對數轉換后采用F檢驗[18]，多重比較采用Duncan法)。檢驗水準α=0.05或0.01。

Discriminating Vehicles with Dummy Axle Based on K-Means Clustering……………MA Zongpu, WANG Ting(4·48)

2 結果

2.1 新疆部分地區(qū)馬群GETV中和抗體水平對采集的馬血清進行血清中和試驗，結果顯示，294份馬血清樣品中，檢出陽性血清227份，中和抗體陽性率達77.2%，陽性血清中和抗體幾何平均滴度(GMT)為1∶145.8。

2.5 不同飼養(yǎng)方式馬群GETV感染情況對散養(yǎng)場和規(guī)模場馬血清GETV中和抗體陽性率進行分析，結果表明這2種飼養(yǎng)方式中和抗體陽性率分別為56.9%和83.0%(χ2=19.520，P<0.01)，組間差異極顯著；陽性血清中和抗體GMT分別為1∶125.2和1∶166.3(F=1.547，P=0.215)，組間差異不顯著(表4)；規(guī)模場馬陽性血清低效價占比率(5.8%)顯著低于散養(yǎng)場(16.2%)，在陽性血清中效價占比率(74.2%)高于散養(yǎng)場(64.9%)，在陽性血清高效價占比率(20.0%)接近于散養(yǎng)場(18.9%)，結果見圖4。

根據山西省地質工程勘察院現場前期實鉆資料，地層情況大致為一碰即碎的松軟泥砂地層，取心難度很大?，F場主要使用了兩種取心鉆具，常規(guī)及超前單動雙管鉆具。常規(guī)單動雙管鉆具幾乎無法獲取巖心，超前單動雙管鉆具平均巖心采取率為33%。巖心丟失嚴重，嚴重影響巖心采取率及質量。筆者根據地層特點從巖心堵塞、沖蝕等方面進行了分析，具體如下：

表1 新疆不同地區(qū)馬群蓋塔中和抗體檢測結果比較

圖1 不同地區(qū)及不同抗體效價馬陽性血清占比率對比

“以謠生利”，“謠”為“利”來，切斷了兩者之間的聯系，“謠”自然就減少了。鑒于當前謠言已經嚴重擾亂經濟秩序和社會秩序，必須從法律上明確造謠責任，讓惡意造謠者付出應有代價。因造謠而產生的收入，不能“落袋為安”，對于這一問題也應該有所規(guī)范。就平臺方來說，處理也不能“對號不對人”，應該把號背后的人列入黑名單，嚴格準入資格，不再為其提供造謠機會。

表2 不同品種馬蓋塔中和抗體檢測結果比較

圖2 不同品種及不同抗體效價馬陽性血清占比率對比

本研究于2020年6月中旬至9月中旬從新疆4個地區(qū)(克拉瑪依市、阿克蘇地區(qū)、昌吉回族自治州和伊犁哈薩克自治州)采集馬血清共294份，進行GETV中和抗體檢測。檢出陽性血清227份，陽性率達77.2%，遠高于海南(25%)[14]和云南(47.7%)[15]，接近于GETV流行后的日本(93%)[13]；結合較高的中和抗體GMT值(1∶145.8)，提示在上述地區(qū)馬群中，GETV感染普遍存在，這些地區(qū)可能正處于蓋塔病流行期或流行后期。

表3 不同年齡段馬蓋塔中和抗體檢測結果比較

圖3 不同年齡及不同抗體效價馬陽性血清占比率對比

2.2 不同地區(qū)馬群GETV感染情況對克拉瑪依市、阿克蘇地區(qū)、昌吉回族自治州和伊犁哈薩克自治州的馬血清GETV中和抗體陽性率進行分析，結果表明，這4個地區(qū)中和抗體陽性率分別為72.2%，74.2%，79.2%，82.1%(χ2=2.667，P=0.448)，組間差異不顯著；陽性血清中和抗體GMT分別為1∶114.3，1∶135.7，1∶202.4，1∶144.0(F=1.948，P=0.123)，但昌吉回族自治州顯著高于克拉瑪依市(表1)；此外，4個地區(qū)的陽性血清中和抗體效價均主要集中在中效價組，數量占比約為70.0%，組間構成比無顯著性差異(圖1)。

表4 不同飼養(yǎng)方式馬蓋塔中和抗體檢測結果比較

圖4 不同飼養(yǎng)方式及不同抗體效價馬陽性血清占比率對比

3 討論

1.4 中和抗體檢測參照文獻[17]的方法，使用“固定病毒-稀釋血清”法檢測待檢馬血清GETV中和抗體效價。使用DMEM將待檢血清進行2-1～2-10倍比稀釋，每個稀釋度血清重復8個復孔，再分別與等體積的GETV病毒液(200 TCID50/100 μL/孔)混合，37℃，5% CO2孵育1 h。取混合液按100 μL/孔接種到含單層Vero細胞(約5×104個/孔)的96孔板，37℃，5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)72～96 h。同時設置GETV陽性對照和正常Vero細胞的陰性對照。96 h后觀察細胞病變情況，按Reed-Muench方法計算并以完全抑制病毒生長的最高稀釋倍數的倒數定義為中和抗體效價。

2.3 不同品種馬群GETV感染情況對純血馬與伊犁馬的血清GETV中和抗體陽性率進行分析，結果表明，2個品種馬中和抗體陽性率分別為83.6%和71.9%(χ2=5.680，P=0.018)，組間差異顯著；陽性血清中和抗體GMT分別為1∶183.8和1∶121.9(F=6.372，P=0.012)，組間差異顯著(表2)；與地區(qū)因素類似，2個品種馬陽性血清中和抗體效價均主要集中在中效價組，數量占比約為70.0%，組間構成比無顯著性差異(圖2)。

2.4 不同年齡馬群GETV感染情況對<1歲齡、1～3歲齡、>3歲齡馬血清GETV中和抗體陽性率進行分析，結果表明，這3個年齡段馬中和抗體陽性率分別為20.0%，45.5%，80.6%(χ2=26.274，P<0.01)，陽性血清中和抗體GMT分別為1∶86.5，1∶34.8，1∶153.1(F=3.823，P=0.023)，>3歲齡組GMP顯著高于其他2組(表3)；>3歲齡組馬陽性血清低效價占比率(5.9%)顯著低于其他2組(50%，60%)，相反，在馬陽性血清低效價與高效價占比率(73.6%，20.5%)高于其他2組(50%，0%；40%，0%)，結果見圖3。

目前，各類大學都對各自的教學進行改革以適應不斷發(fā)展的社會需求和人對知識掌握的需求。但是所有的改革都不可能是盡善盡美的，在課堂教學改革的過程中也會出現一些不盡人意的方面。

各地區(qū)中和抗體陽性率最高的地區(qū)是伊犁哈薩克自治州，為82.1%，最低的地區(qū)是克拉瑪依市，為72.2%；陽性血清中和抗體GMT最高的地區(qū)是昌吉回族自治州，達1∶202.4，大約是最低地區(qū)(克拉瑪依市)的2倍。雖然4個地區(qū)之間的中和抗體陽性率和陽性血清中和抗體效價構成比并沒有顯著性差異(P>0.05)，但昌吉地區(qū)馬群中和抗體GMT均高于其他3個地區(qū)，表明該地區(qū)GETV感染程度最為嚴重。

不同品種馬中和抗體陽性率及陽性血清中和抗體GMT差異均具有統計學意義，純血馬為83.6%和1∶167.5，顯著高于伊利馬的71.9%和1∶132.7(P<0.05)。鑒于2個品種馬為混合飼養(yǎng)，其生活環(huán)境、飼養(yǎng)條件基本一致，因此，推測不同品系馬對GETV的易感性不同，純血馬高于伊犁馬，這可能是由于純血馬引種來源于GETV流行地區(qū)(如日本)所致。為了更好地改良馬匹品種，近幾年我國從澳大利亞、愛爾蘭、日本等多個國家引進純血馬。我國對進口馬的檢疫參照《關于中國從美國輸入馬的檢疫和衛(wèi)生要求議定書》，檢測項目包括非洲馬瘟、日本腦炎、馬鼻疽、馬媾疫等，但目前并未將蓋塔病納入檢測范圍內[20]。因此，在引進外來馬時，應加強對蓋塔病的檢測。

與品種情況類似，>3歲齡的馬血清陽性率和中和陽性血清抗體GMT分別為80.6%和1∶153.1，均顯著高于其他2個年齡段(P<0.05)。此外，>3歲齡組的中、高效價血清陽性率顯著高于其他2個年齡組，提示中和抗體水平隨著年齡增長而呈現遞增趨勢，可能與成年馬被攜帶GETV的蚊蟲反復叮咬、頻繁接觸感染病馬有關。然而，由于采集樣本容量的限制，<1歲齡、1～3歲齡的馬血清均只有10份和11份，遠低于>3歲齡馬血清的273份，這給估計<1歲齡、1～3歲齡馬的血清陽性率和GMT值帶來了較大誤差。

本研究發(fā)現，在所調查的多數規(guī)模場里，普遍存在養(yǎng)殖密度過大、畜舍通風差、蚊蟲易滋生和叮咬馬匹的現象，雖然規(guī)模場和散養(yǎng)場馬陽性血清效價構成比差異不明顯，但這很可能是規(guī)模場馬血清陽性率和中和抗體GMT(83.0%；1∶166.3)顯著高于散養(yǎng)場(56.9%；1∶125.2)的原因。

新疆是我國馬匹養(yǎng)殖數量最多的地區(qū)，馬匹存欄數約86萬匹，占全國存欄總數的10%以上，新疆馬產業(yè)發(fā)展在全國一直占據著重要的地位[21]。本研究首次對新疆克拉瑪依市、阿克蘇地區(qū)、昌吉回族自治州和伊犁哈薩克自治州4個地區(qū)，開展了蓋塔病血清流行病學調查，結果表明，這些地區(qū)馬群GETV感染普遍存在，且陽性馬血清中和抗體水平較高，這可能與品種、年齡以及養(yǎng)殖環(huán)境密切相關。為了進一步了解蓋塔病在新疆地區(qū)的流行規(guī)律，應加強對新疆地區(qū)，特別是對新疆地區(qū)引種馬和規(guī)模化養(yǎng)殖場馬蓋塔病的持續(xù)監(jiān)測。本研究為新疆地區(qū)馬蓋塔病的防控工作及馬產業(yè)的健康發(fā)展提供了依據。